이 프로토콜은 현장에서의 사전의 초기 보기에서 중앙 집중식 수준의 분자 형성에 이르기까지 동물 광견병의 사후 진단에 사용될 수 있다. 급속한 면역 크로마토그래피 진단 시험은 광견병 진단을 위한 참조 자료를 사용할 수 없는 아프리카와 아시아에 있는 시골과 시골 특색을 위한 유용한 대안입니다. 절차를 시연하는 것은 사이먼 보나스내 실험실에서 기술자가 될 것입니다.
절차의 첫 번째 부분을 시연하는 것은 말리 바마코의 Laboratoire 센트럴 베테리네르의 기술인 이브라히마 디코입니다. 포라멘 매그넘에 액세스하려면 칼을 사용하여 첫 번째 자궁 경부 척추 전에 동물의 머리를 제거하십시오. 그리고 적절한 도구를 사용하여 뇌 줄기 샘플을 수집합니다.
일회용 파이펫, 마시는 빨대, 클램프 또는 드롭퍼와 같이 여기에 도시된 바와 같이. 뇌 줄기는 이 파이펫의 끝으로 여기에서 입증된 대로 명확하게 보입니다. 마시는 짚과 같은이 뇌 줄기의 일부를 수집하기 위해 적절한 도구를 사용합니다.
조심스럽게 삽입하고 뇌 조직을 수집하기 위해 부드럽게 돌립니다. 생검을 수집하기 위해 빨대를 제거하기 전에 손가락으로 빨대를 연결하는 것을 잊지 마십시오. 클램프의 사용도 가능합니다.
포라멘 매그넘의 수준에서 뇌줄기의 큰 조각을 수집하기 위해. 또는 키트에 제공된 드롭퍼를 직접 사용하여 뇌줄기를 수집할 수 있다. 마시는 빨대와 마찬가지로 드롭퍼를 조심스럽게 삽입하고 부드럽게 돌려 뇌 조직을 수집합니다.
그런 다음 뇌 조직을 흡인하고 튜브의 스토퍼와 같은 용기에 놓습니다. 정확한 진단을 위해 샘플 수집 중에 수질근을 포함하는 뇌간을 수집하는 것이 중요합니다. 동질현절이 얻어질 때까지 약 30초 동안 면봉 또는 드롭퍼로 완충제가 들어 있는 튜브내의 뇌 물질을 직접 분쇄한다.
드롭퍼를 사용하여 테스트 장치의 샘플 입구에서 서스펜션의 약 100 마이크로리터를 4방울 떨어뜨리게 한다. 점도 정지가 높거나 마이그레이션의 시작을 가속화하기 때문에 지연되는 경우, 드롭퍼로 장치의 예금 부위의 바닥을 부드럽게 긁어냅니다. 테스트 장치를 읽기 전에 1~5분 동안 완전한 샘플 마이그레이션을 기다립니다.
샘플은 두 줄이 표시될 때 광견병에 대해 양성으로 간주됩니다. 음수, 컨트롤 라인만 있는 경우. 그리고 테스트 라인만 표시되거나 선이 표시되지 않는 경우 유효하지 않습니다.
장치 샘플에서 RNA를 추출하려면 장치를 조심스럽게 열고 필터 용지를 제거합니다. 샘플의 퇴적물을 수집하고 샘플을 삼중LS의 1밀리리터에 넣습니다. 일반 부드러운 수동 교반과 실온에서 1 시간 후, 표준 RNA 추출 프로토콜에 따라 뇌체에서 RNA를 추출. 제조 업체 권장 사항에 따라 RNA 강수량을 용이 하 게 글리코겐의 두 마이크로 리터를 추가.
RNA 리서스펜션의 최종 부피를 뉴클레아제 프리 워터로 50마이크로리터로 조정한다. 그리고 테이블에 따라 세 가지 다른 역전사 정량 PCR 분석법에 대한 마스터 믹스 반응 솔루션을 준비한다. 표에 표시된 프라이머와 프로브를 사용합니다.
희석 된 RNA 샘플의 5 마이크로 리터에서. 그리고 15 마이크로리터의 마스터 믹스는 각각 3개의 상이한 세 가지 세 가지 에세이를 적절한 96 개의 잘 반응 플레이트에서 복제한다. 각 분석체에 대해 적절한 양수 및 음수 컨트롤을 복제하여 각 플레이트에 추가합니다.
그런 다음 테이블에 표시된 대로 열 순환 조건에 따라 다른 해석을 실행합니다. 결과는 표에 설명된 대로 분석할 수 있습니다. 뇌 생검의 컬렉션은 고품질 샘플의 수집을 보장하기 위해 가능한 한 간단합니다.
참조 기술에 비해 급속한 면역 크로마토그래피 진단 테스트의 민감도 및 특이성은 이들 프로토콜을 사용하는 모든 실험실에서 높았다. 시험된 견본의 누적수에 기초하여, 전반적인 감도 및 특이성은 95% 이상이었다 급속한 면역학마토그래픽 진단 시험은 감염된 동물에게서 두뇌 생검에 있는 리사바이러스를 검출하기 에 적합합니다. 리사바이러스 항원 의 수준은 광견병 진단에 중요하기 때문에, 그러나, 검출의 한계는 적정한 바이러스 현탁액을 시험할 때 높게 남아 있습니다.
이러한 대표적인 결과에서, 이중 결합판리사바이러스 역전사에 의해 검출된 후 리사바이러스의 바이러스 폴리머라제의 정량적 PCR 표적화, 51개의 양성 면역크로마토그래피 진단 시험의 패널이 수행되었다. 또한, 기형계는 부분 뉴클레오단백질 유전자의 헤미 중첩 PCR 표적화를 이용하여 시료의 14개에 대해 수행될 수 있다. RT PCR 이후 또는 추가 긴 문자열 분석을 위해 genotyping을 위한 테스트 스트립에 대한 진단 및 추출.
급속한 면역 크로마토그래피 진단 시험은 빠르고 정확한 광견병 진단을 제공할 수 있습니다. 이는 연속 파기반 감시 및 제어 시스템에서 웨이브 기능을 유지하는 데 매우 중요합니다. 그리고 인간을 최소화합니다.
