우리는 그들의 도움과 지원을 맥마흔 연구소의 모든 구성원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 NIH / NCI R01 CA176839-01 (MM에) 및 기관 연구 및 학술 경력 개발 상 (JS에 IRACDA)에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. 세포 배양에서 전체 세포 용 해물의 준비 <ol><li> 얼음에 세포 배양 접시를 놓고 5 밀리미터 EDTA (PBS의 예를 들어, 5 ㎖ 5 mM의 EDTA/10 cm 2 플레이트)와 차가운 PBS를 추가합니다. 세포 스크레이퍼를 사용하여 요리에서 자기편 세포를 제거하고 차가운 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 rpm으로 (230 XG)에서 저속 원심 분리하여 세포 현탁액을 펠렛 얼음에 원뿔 튜브를 놓고 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음. </li><li> 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 PBS 1 ㎖와 펠렛을 씻고 감기에 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 펠렛 세포를 10 초 동안 13,000 RPM (13,226 XG)에서 빠른 스핀 정지. 조심스럽게 얼음에 펠릿과 장소 튜브를 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. </li><li> 에서, (예 : 3 × 10 6 세포에 RIPA 버퍼 ~ 150 μl를 추가 펠릿의 크기에 따라) 25 ~ 200 μL에 펠렛을 재현 탁RIPA 완충액 (50 mM 트리스, 150 mM의 염화나트륨, 0.5 mM의 EDTA, 10 mM의 불화 나트륨, 0.1 % SDS, 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 1 % NP-40) 2X 최종 농도 갓 첨가 프로테아제 및 포스파타제 억제제를 포함. 간단히 각 튜브 와동과 얼음에 20 ~ 30 분 동안 현탁액을 품어. 주 : 단백질 및 그들의 변성 세제 (즉 SDS, 트리톤 X-100, 또는 NP-40)의 강도를 용해하는 능력이 다른 단백질을 추출하는 데 사용할 수있는 몇개의 용해 버퍼가있다. RIPA 버퍼는 전체 세포 용 해물을 준비하고 단백질 - 단백질 상호 작용을 방해하는 데 유용합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 14,000 RPM (15,339 XG)에서 포스트 핵 분수, 원심 분리기 해물을 만들려면 얼음 핵 농축 펠릿과 장소 튜브를 중단하지 않고 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 참고 : 상층 액을 추출하는 동안 핵 농축 펠릿은 또한 튜브에서 분리 할 수​​ 있습니다. 핵 농축 펠렛을 수집 방지하기 위해, 내가 직접 피펫 팁을 배치점성 핵 농​​축 펠릿 n을하고 처리하기 위해 피펫으로 그려. </li><li> BCA 또는 브래드 같은 단백질 정량 분석​​법을 사용하여 제조업체의 지시에 따라 각 샘플의 단백질 농도를 결정한다. </li></ol> 2. 샘플 준비 및 전기 <ol><li> 아래에 설명 된 다음 표에 따라 각 샘플을 준비합니다. 대안으로, β-메르 캅토 에탄올로는 2.5 %의 최종 농도로 사용할 수있다. 그러나, 환원제 겔을 적재하기 전에 시간에 각각의 샘플까지 첨가한다. 각 제조 된 샘플의 20 μL와 피펫의 변화에​​ 대한 전체 볼륨의 계정이 아니라 당로드. <table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> REDUCED SAMPLE </td></tr><tr><td> 단백질 샘플 </td><td> X μL </td></tr><tr><td> 배 LDS 샘플 버퍼 </td><td> 6 μL </td></tr><tr><td> 500 nm의 DTT 레드ucing 에이전트 </td><td> 2.4 ㎕의 </td></tr><tr><td> 탈 이온수 </td><td> 최대 15.6 μL </td></tr><tr><td> 총 양 </td><td> 24 μL </td></tr></tbody></table></li><li> 10 분 동안 70 ° C에서 열 샘플. 샘플을 가열하는 동안 (50 ㎖의 20 배의 MES 또는 버퍼를 실행 MOPS 플러스 950 ㎖의 탈 이온수) 버퍼를 실행 1X MES 또는 MOPS 1000 ML을 준비합니다. 버퍼를 실행 MES는 MES 빠르게 MOPS 4 이상 실행 버퍼를 실행 할 수있는 하부의 pKa와 2-200 kDa의 사이의 작은 분자량의 단백질을 해결하는 반면 버퍼를 실행 MOPS는 14-200 kDa의 사이에 중간 크기의 단백질을 해결합니다. 따라서,이 두 버퍼는 단백질 밴드 4의 분리의 차이로 연결 스태킹 겔 내에서 이온의 이동에 영향을 대조했다. 옆으로 설정하고 최소의 위 버퍼 챔버를 채우는 데 사용됩니다 (200) 1X MES의 ML 또는 산화 방지제의 500 μL로 버퍼를 실행 MOPS를 결합I-세포 전기 영동 장치. </li><li> 샘플은 얼음을하기 전에 난방, 빠른 스핀 샘플을 완료하면. </li><li> 전기의 소형 휴대 기기에 프리 캐스트 비스 - 트리스 젤의 어셈블리에 대한 제조 업체의 지침을 따르십시오. 주 : 각 젤이 각 겔의 짧은 (작은) 카세트 버퍼 핵심을 향해 안쪽으로 향하고 젤 레벨 강력히 어퍼 버퍼 상공 회의소에서 누출을 방지하기 위해 버퍼 코어에 대해 가압 그런 방식으로 지향되어 있는지 확인합니다. </li><li> 1X MES 또는 항산화 및 1X MES 또는 버퍼를 실행 MOPS 약 600 mL를 소형 휴대 기기의 낮은 버퍼 챔버를 포함하는 버퍼를 실행 MOPS의 200 ㎖로 위 버퍼 챔버를 입력합니다. 버퍼를 실행하는 별도의 200 ~ 300 ㎖를 나중에 사용하기 위해 저장할 수 있습니다. 그러나, 버퍼의 pH와 품질이 변경 될 수 있으므로 전기를 실행하는 동안 사용되는 버퍼를 재활용하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 각 단백질 SAMP의 20 μl를로드르 각 웰에. 여러 항체 (즉, 2 개 이상)를 조사하기 위해 여러 지구로 막 절편 경우, 그것은 매우이 될 것입니다 각 젤의 첫 번째와 마지막 우물 prestained 단백질 표준의 2-5 μl를로드하는 것이 좋습니다 단백질 밴드의 화상에 영향을주지 않고 막 다른 섹션을 분리하기위한 가이드 등을 절단. </li><li> 끝의 시작과 젤 당 70~80mA에서 110-125mA / 젤의 예상 전류를 35 분 동안 200 V 불변의 실행 젤. 추적 염료 버퍼 코어 따라 백금 와이어로 마이그레이션 할 때 전기가 완료됩니다. </li></ol> 3. iBlot 드라이 블로 팅 시스템을 사용하여 단백질 전송 <ol><li> 완전히 (이 지직 거리는 소음이 발생할 수 있습니다) 카세트 테이프의 접착면을 끊어서 미니 젤을 분리합니다. 짧은 (작은) 판을 취소하고 조심스럽게 탈 물을 용기에 이상 (슬롯) 판에서 젤을 전송하고아래쪽에있는 젤의 두꺼운 발 부분을 제거합니다. 참고 : 드문 경우에, 젤이 더 짧은 플레이트 대신에 연결할 수 있으며, 플레이트 성공 시켰습니다. 이 경우, 더 이상, 홈판을 폐기하고 하단에 위치한 겔의 두께 왼발 부분을 제거한다. 그런 다음 조심스럽게 탈 이온수에 짧은 플레이트에서 젤을 전송합니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 양극과 음극 전송 스택을 조립한다. 참고 : 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 모두 세포막 단백질의 높은 품질과 효율적인 전송을 제공하고 형광 검출 8과 호환됩니다. 그러나, PVDF 막은 니트로 셀룰로스보다 높은 결합능 (240 ㎍ / cm 3) (200 ㎍ / cm 3) (8)를 가지고있다. </li><li> 조심스럽게 기포 또는이 같은 젤과 막 사이에 갇힌 공기를 전송하는 동안 단백질 밴드의 왜곡을 방지 할 수 있습니다 제거합니다. 참고 : 막 또는 TRANSF 트림하지 않습니다어이 양극과 음극 스택 사이의 직접 접촉을하게됩니다로 젤 크기에 맞게 스택. </li><li> 후 제대로 건조 블로 팅 장치에 전송 스택을 조립, 적절한 전압 프로그램 (즉, 프로그램 3 : 7 분 20 V)을 선택하고 전송을 시작합니다. 주 : 150 kDa의 단백질보다 더 느리게 이주 경향 8-10 분의 긴 전송 시간을 필요로 할 수있다. 또, 50-10 분 동안 20 % 에탄올에서 겔의 사전 인큐베이션은 또한이 큰 단백질의 전사 효율을 향상시키는 것을 도울 것이다. 전송 프로그램이 완료되면, 장치는 자동으로 전류를 차단한다. 그것은 바로 막을 제거하고 더 나은 단백질 검출을 확인하고 막을 건조 방지하기 위해 차단 절차를 진행하는 것이 가장 좋습니다. </li></ol> 4. 적외선 형광 단백질 검출 <ol><li> 오디세이는 1 시간 또는 버퍼 (트윈 20을 추가하지 마십시오) 차단의 0.8 ㎖ / cm 2의 최소의 블록 막 (들)하룻밤에 4 ° C. 막 (들)도 있지만이 높은 배경의 원인이 단백질 검출을 방해 할 수 있습니다, 탈지 분유와 차단 될 수 있습니다. </li><li> 4 ℃에서 하룻밤 동안 0.1 % 트윈 (20)와 버퍼를 차단 오디세이에서 원하는 농도 차 항체에 막 (들)을 품다 두 개의 다른 항원이 동일한 블롯에 시각화되는 두 색 검출을 위해,이 일차 항체는 다른 호스트 종으로부터 유도되어야하며 멤브레인 (들)에 동시에 첨가. 참고 : 이전에 일차 항체에 멤브레인 (들) 배양에, 막 (들) 같은 막에 여러 항체 (즉, 2 개 이상)를 조사하기 위해 여러 조각으로 절개 할 수있다. </li><li> TBS에서 10 분 플러스 0.1 % 트윈 - 20 부드러운 흔들림 함께 막 (들) 배를 씻으십시오. </li><li> Odysse에서 800 nm의 채널에 대한 700 nm의 채널과 1:6,000-1:10,000에 대한 1:20,000의 희석에 형광 표지 된 이차 항체와 막 (들)을 품다Y는 (이상 1 시간 동안 막 (들)을 배양하는 배경을 증가시킬 수있다) 30 ~ 60 분 동안 0.1 % 트윈 (20)와 버퍼를 차단. 빛으로부터 멤브레인 (들)을 보호합니다. 주 : 이차 항체는 일차 항체의 각각과 동일한 호스트 종 유래의 다른 형광체로 표지 할 필요가있다. </li><li> TBS에서 10 분 플러스 0.1 % 트윈 - 20 부드러운 흔들림 함께 막 (들) 배를 씻으십시오. 빛으로부터 멤브레인 (들)을 보호합니다. </li><li> 스캔 및 적외선 이미징 시스템 군데까지 막 (들) 트윈 20 4 ° C에서하지 않고 건조 또는 TBS 또는 PBS 중 하나에 저장 될 수있다. 제대로 빛으로부터 보호하는 경우 형광 신호가 몇 달 동안 안정적으로 유지됩니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A.">Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).</li><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera:+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure.">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li><li>Kubo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+incubation+of+solutions+of+proteins+containing+dodecyl+sulfate+on+the+cleavage+of+peptide+bonds+by+boiling.">Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling.</a> Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).</li><li>Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yield+sequencing+of+proteins+electrophoretically+separated+and+transferred+to+an+inert+support.">Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support.</a> J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iBlot+Dry+Blotting+System.">iBlot Dry Blotting System.</a> Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+Blot+Analysis.">Western Blot Analysis.</a> LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odyssey+Infrared+Imaging+System+Application+Software+Version+3.030.">Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030.</a> LI-COR Biosciences. , (2007).</li><li>Hambaeus, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Milk+Composition.">Human Milk Composition.</a> Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).</li><li>DenHollander, N., Befus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+antigens+from+immunoblotting+membranes.">Loss of antigens from immunoblotting membranes.</a> J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 프로토콜에 따라 고품질, 정량적 웨스턴 말 생성에 중요한 단계는 다음과 같다 : 1) 단백질의 농도를 측정하는 단계 2) 샘플 준비, 3) 멤브레인을 차단하고, 4) 일차 항체의 품질과 그릇. 총 단백질 농도를 측정의 정확도는 적외선 형광 검출의 뛰어난 감도는 샘플의 단백질 농도에서 발견 된 약간의 차이를 증폭 때문에 단백질 밴드를 정량화에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. , ?...

<html> 웨스턴 블롯의 기술은 제 1-3 항체를 사용하여 단백질을 검출하기위한 더 나은 방법을 만들기 위해 1977 년과 1979 년 사이에 개발되었다. 이 절차는 이차 항체를 사용하여 시각 및 오토 라디오 그래피, UV 광, 또는 퍼 옥시 다제 반응 생성물 (3)에 의해 검출 된 표적 단백질과 함께 SDS-PAGE 젤에서 세포막 단백질의 전기 영동 이동을 이용했다. 따라서, 이와 같은 기본 원칙은 여전히​​ 널리 오늘날의 서양 얼룩 프로토콜에 사용됩니다. 그러나이 고전적인 웨스턴 블로 팅 기술은 저속 전기 실행 시간, 낮은 해상도와 인공 단백질 밴드, 단백질 분해에 대한 감수성, 그리고 감도를 제한뿐만 아니라 가난한 데이터 품질 4로 존재 많은 단점을, 않습니다. 따라서,이 프로토콜은보다 정확한 정성 및 정량 데이터를 생성하는 표준 웨스턴 블롯 절차에 상당한 발전과 개선에 대해 설명합니다. &quot;&gt; SDS-PAGE를 이용하여 단백질의 광범위한 분리 램리 시스템이 웨스턴 블롯 시스템의 인기에도 불구. 웨스턴 블롯 5 가장 널리 사용되는 겔 시스템이며,이 방법은 대역 왜곡, 해상도의 손실 및 초래할 수 스퓨리어스 대역 4.이 분리 겔 감소 디설파이드 겔의 다른 레 독스 상태에 의한 결합 및 아스 파르 틸-프 롤릴 개열의 재산 화의 높은 pH (9.5)에 의한 단백질의 탈 아미 노화 및 알킬화의 결과 일 수있다 램리 완충액 (pH 5.2) 4,6에서 단백질을 가열에 의한 펩티드 결합., 중성 pH (7.0)로 작동 Lamemmli 시스템에 비해 상당한 이점을 제공 비스 - 트리스 겔 시스템.이 시스템은 단백질 안정성, 최소화 향상 단백질 변형은 그들의 감소 된 상태로 유지하는 단백질을 전기 영동시 아스 파르 틸-프 롤릴 절단을 방지하고,보다 중요하게, 전기 영동 실행 시간은 t, 또. 35 분이다 4,6,7그는 비스 - 트리스 젤 시스템은 더 신뢰할 수있는 데이터 4의 결과로 선명 밴드, 더 높은 해상도와 분리, 증가 감도를 생산하고 있습니다. 비스 - 트리스 젤 시스템과 함께, iBlot 드라이 블롯 시스템은 크게 7 분으로 13 시간 이내 막 상 겔로부터 단백질의 전송 시간을 줄이기 위해 높은 전계 강도와 전류를 사용한다. 이 반송 시스템은 단백질 13의보다 효율적이고 신뢰성있는 전송을 생성 건조 블로 팅 방법에 근거한다. : 기존의 전송 시스템에 iBlot 전송 시스템의 효과에 대한 자세한 비교 내용은 다음 웹 사이트를 참조하십시오 <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html">http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Application</a>s/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . 이는 이온 공기통 8 역할 적절한 전송 버퍼를 포함 겔 매트릭스로 구성되는 양극과 음극 스택을 이용한다. 전송 동안, 물 전기 분해 대역 왜곡 8시키지 않고보다 일관된 단백질 전사 초래 구리 양극으로부터 산소의 발생을 방지하는 것을 돕는다. 또한,이 반송 시스템은 또한 전극 (8) 사이의 거리를 줄임으로써 전송 속도를 증가시킨다. 화학 발광은 서양 얼룩의 단백질 검출 분석을위한 가장 일반적이고 전통적인 기법이지만, 두 컬러 적외선 형광 검출이 크게 웨스턴 블롯 데이터의 민감도, 품질과 정확도를 향상시켜줍니다. 이 검출 방법이 최적의 파장 700 nm의 적외선 레이저 여기를 사용800 nm의 최대 신호 대 잡음 비 및 높은 감도를 가진 9 클리어 데이터 이미지를 생성한다. 따라서,이 목적 단백질은 700 nm 내지 800 nm의 형광 검출 채널을 사용하는 동일한 멤브레인 동시에 가시화 될 수있다. 더 중요한 것은, 적외선 형광의 선형성 및 동적 범위는 강하고 약한 두 단백질 밴드 (9)의 정확한 정량 분석을 할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 이러한 공정의 효능을 손상하고 더 정량적 웨스턴 블롯 데이터를 생성하기 위하여 적외선 형광 단백질 검출을 이용하지 않고 본 실험의 전기 및 전송 시간을 감소시킴으로써 고전 웨스턴 블로 팅 기법을 통해 엄청난 장점 및 개선을 제공한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:297px;">BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:204px;">Thermo Scientific/Pierce</td>
			<td style="width:123px;">23225</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">4x NuPAGE&#174; LDS Sample Buffer&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">10x NuPAGE&#174; Sample Reducing Agent&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0004</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MES SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0002</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">20x NuPAGE&#174; MOPS SDS Running Buffer</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NuPAGE&#174; Antioxidant</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0005</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0335BOX</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:297px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>NP0336BOX</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SeeBlue&#174; Plus2 Pre-Stained Standard&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>LC5925</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">XCell SureLock&#174; Mini-Cell&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, PVDF Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB4010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Transfer Stack, Nitrocellulose Regular</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-01</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174;Transfer Stack, Nitrocellulose Mini</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB3010-02</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iBlot&#174; Gel Transfer Device&#160;</td>
			<td>Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td>IB1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-Actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2228</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-BIM (S69)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total BIM</td>
			<td>Epitomics</td>
			<td>1036-1</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Total ERK1/2</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9107</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Blocking Buffer&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>927-40000&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-32211&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68020&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Western Incubation Box, Medium&#160;</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>929-97205&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Classic Imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Odyssey&#174; Application Software V3.0.30</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis

원래 1970 년대 후반에 설립 된 웨스턴 블롯 기술은 여전히​​ 적극적으로 오늘날 사용된다. 그러나, 웨스턴 블로 팅의 전통적인 방법은 낮은 품질의 해상도, 가짜 밴드, 감도를 감소, 불량 단백질의 무결성을 포함 몇 가지 단점이있다. 최근 비약적으로 진보는 더 높은 질적 및 양적 데이터를 생성하기 위하여 표준 웨스턴 블롯 프로토콜의 수많은 양상을 개선했다. 비스 - 트리스 젤 시스템, 종래 램리 시스템에 대한 대안은, 저렴한 단백질 분리 및 해상도가 발생하는 단백질의 무결성을 유지하고, 35 분의 실행 시간에 전기 영동을 감소시킨다. 또한, 건조 iBlot 블롯 시스템이 극적 종종 긴 전송 시간에 더 비효율적 전통적인 단백질 전송 방법 대조적이다 7 분에서 멤브레인 단백질 전달의 효율 및 속도를 개선한다. 이 매우 혁신적인 수정, 단백질 D와 함께금 속 탐, 고품질의 적외선 형광 이미징 결과를 사용하여보다 정확하고 화학 발광의 표준 웨스턴 블로 팅 기술에 비해 데이터의 일관성. 이 기술은 동시에 다른 형광 채널에서 시각화 두 색 근적외선 염료를 이용하여, 동일한 막에 두 가지 항원을 검출 할 수있다. 또한, 형광 촬상의 선형성과 넓은 다이내믹 레인지가 강하고 약한 모두 단백질 밴드의 정확한 정량을 허용한다. 따라서,이 프로토콜은 크게이 실험의 연주 시간을 줄이면서 이러한 진보는 현저 데이터의 품질을 높일 수있는 고전 웨스턴 블랏 방법을 개선 키를 설명한다.

두 컬러 적외선 형광 향상된 감도 및 클리어 웨스턴 블롯 이미지를 생성하기 위해 가장 높은 신호 - 대 - 잡음비와 같은 막에 강하고 약한 두 대역을 검출한다. 700 nm의 800 nm의 형광 채널 모두에서 시각화 두 가지 색상 웨스턴 블롯 검출에 의해 생성 된 전형적인 결과는 그림 1과 2에 예시되어있다. 그림 1의 최상위 웨스턴 블롯은 인간에서 해물의 두 가지 직렬 희석의 700 nm?...

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The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

이 프로토콜은 웨스턴 블롯 분석을 수행의 최신 발전을 탐구한다. 이러한 신규 한 변형은 35 분간 전기 영동 실행 시간, 12 분 건조 블로 팅 전송 시스템, 및 고해상도, 고품질, 감도 및 서부 데이터의 개선 된 정확성을 생성하는 적외선 형광 단백질 감지 및 이미징 비스 - 트리스 겔 시스템을 이용한다.

타운 웨스턴 가장 빠른 : 클래식 웨스턴 블롯 분석에 현대 트위스트

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

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Research

JoVE Journal

Biology

26.9K 조회수.  University of California, San Francisco.  이 프로토콜은 웨스턴 블롯 분석을 수행의 최신 발전을 탐구한다. 이러한 신규 한 변형은 35 분간 전기 영동 실행 시간, 12 분 건조 블로 팅 전송 시스템, 및 고해상도, 고품질, 감도 및 서부 데이터의 개선 된 정확성을 생성하는 적외선 형광 단백질 감지 및 이미징 비스 - 트리스 겔 시스템을 이용한다. 

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Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

웨스턴 Invitrogen NuPage Novex BIS 트리스 MiniGels를 사용하여 모래 바닥

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

연구

생물학

Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

Endolymphatic 덕트의 말살로 Endolymphatic의 Hydrops의 외과 유도

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

웨스턴 모래 바닥 : 샘플 준비를 탐지하기 위해

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

세균과 같은 세포로 신생아 마우스 피부 유래 줄기 세포의 분화<em&gt; 체외</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

문제 해결 전략 현대 양적 형광 웨스턴 블로 팅에 가이드

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

아마의 꽃 - 딥 변환 (<em&gt; LINUM usitatissimum</em&gt;) 높은 변환 속도와 형질 전환 자손을 생성합니다

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

파장과 산화 스트레스에 레드 / 근적외선 치료의 강렬의 범위의 효과의 평가를위한 방법<em&gt; 체외</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

광활성 GFP와 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매 이미징

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...