이 실험 절차의 전반적인 목표는 인간 세포메갈로바이러스 의 통제 하에 세균성 인공 염색체로 조립된 전신 cDNA 클론에서 전염되는 재조합 Zika 바이러스의 생성이다. Zika 바이러스와 같은 RNA 바이러스를 위한 역유전 시스템의 발달은 바이러스 게놈의 직접적인 조작을 가능하게 하여 바이러스 생물학 및 병인의 다중 양상을 연구하고 백신 전략을 개발할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세균성 인공 염색체로서 Zika 바이러스 감염 클론의 생성이 플라비바이러스 게놈과 관련된 독성을 극복하고 BAC cDNA 클론을 깨지기 쉬운 세포로 직접 트랜스포팅하여 전염성 바이러스의 구조를 허용한다는 것입니다.
이 방법론은 다른 flaviviruses뿐만 아니라 다른 양성 좌초 RNA 바이러스에 대한 안정적이고 완전한 기능성 전염cDNA 클론을 생성에 적용 할 수있다. 이 절차를 시작하려면 적절한 제한 사이트를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Zika 바이러스 cDNA 복제본을 구성합니다. 5-프라임 엔드에서 인간 CMV 프로모터에 의해 측면에 있는 Zika 바이러스 게놈을 아우르는 4개의 DNA 단편및 형 간염 델타 바이러스 리보솜 및 소 성장 호르몬 종단 및 3개의 프라임 엔드에서 다각성 서열은 세균성 인공 염색체 플라스미드로 조립된다.
먼저, 완만한 흔들림으로 8시간 동안 클로람페니콜을 함유한 LB 배지 5밀리리터에서 pBAC-Zika 바이러스 감염클론을 운반하는 E.coli DH10B의 단일 콜로니를 성장시다. 그런 다음 클로람페니콜을 함유한 LB 배지의 500밀리리터를 2리터 플라스크에 추가합니다. 제조된 세균 배양의 1밀리리터를 플라스크에 넣고 OD600이 약 0.6~0.8이 될 때까지 14~16시간 동안 37°C에서 세포를 성장시다.
그 후, BAC 정화를 위해 특별히 개발된 상용 키트를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 알칼리성 용해에 의한 BAC 감염 cDNA 클론을 정화한다. 어느 날 형질 전환하기 전에, 성장 배지에서 잘 당 500, 000 세포의 밀도에 6 웰 플레이트의 우물로 베로 세포를 플레이트. 경질 혼합물을 준비하려면 BAC cDNA 클론 4마이크로그램을 혈청 중형250 마이크로리터에 추가하고 신중하게 혼합합니다.
별도의 튜브에서, 혈청 감소 배지의 250 마이크로 리터에 12 마이크로 리터의 투명 제. 소용돌이는 5 분 동안 실온에서 혼합하고 배양합니다. 다음으로, 희석된 BAC cDNA를 경질제와 결합한다.
조심스럽게 섞어서 실온에서 20~30분 간 배양하세요. 이 잠복기 동안, 베로 세포를 세척하고 항생제없이 신선한 배지의 1 밀리리터에 세포를 두고 항생제없이 성장 매체를 사용합니다. 이어서, cDNA 및 경질 시약 혼합물의 500마이크로리터를 베로 세포에 드롭방향으로 분배한다.
플레이트를 앞뒤로 흔들어 6시간 동안 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 가습된 인큐베이터에서 세포를 혼합하고 배양합니다. 그 후, 트랜스퍼션 배지를 제거하고 항생제로 신선한 성장 배지의 2 밀리리터를 추가하십시오. 가습 된 인큐베이터에서 37 °C의 이산화탄소를 5 %의 이산화탄소로 배양하여 세포 요법 효과의 유도를 매일 확인하십시오.
4~6일 간의 트랜스펙트 후 CPE가 약 50~75%의 조직 배양 슈퍼나티를 15밀리리터 원내 튜브및 원심분리기에서 10분 동안 수집하여 세포 이물질을 제거한다. 그런 다음, 재조합 Zika 바이러스를 포함하는 수퍼나츠를 수확하고 세포 펠릿을 폐기한다. 냉동 튜브의 상체를 알리쿼트와 영하 80도에 보관하십시오.
시작하려면 베로 세포를 90%의 합류로 증가시면 됩니다. PBS로 세포를 두 번 세척하고 2 %의 FBS를 포함하는 성장 배지에서 0.1의 감염의 복합성으로 구조 된 바이러스로 감염. 가습된 인큐베이터에 셀 플레이트를 섭씨 37도에 놓고 이산화탄소 5%를, 90분 동안 15분마다 바위를 휘두를 수 있습니다.
바이러스 흡착 후 바이러스 성 접종을 제거하고 2 % FBS로 신선한 성장 매체를 추가하십시오. 이전에 사용한 것과 동일한 조건에서 3~4일 동안 배양합니다. CPE가 약 75%가 세포 이물질을 제거하기 위해 조직 배양 상피 및 원심분리기를 수집한다.
그런 다음, 재조합 Zika 바이러스를 포함하는 상체를 수확하고 펠릿을 폐기하십시오. 상체를 냉동튜브에 알리쿼트합니다. 튜브를 영하 80도에 보관하십시오.
준비가 되면 냉동고에서 바이러스 알리쿼트를 제거하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플라크 분석으로 바이러스 성구를 결정합니다. 본 연구에서는, 지카 바이러스 균주 리오 그란데도 노르테 나탈의 안정적이고 전체 길이cDNA 클론은 바이러스 게놈에 존재하는 기존의 복제 방법과 독특한 제한 부위를 사용하여 세균인공 염색체 pBeloBAC11에 4개의 겹치는 cDNA 단편을 순차적으로 복제하여 생성된다. 본 전길이 cDNA 클론은 인간 세포메갈로바이러스 프로모터에 의해 5-프라임 엔드에서 측면으로 분리되어 형간염 세포의 핵에서 바이러스 RNA의 발현을 허용하고 3-프라임 엔드에서 형간염 형 델타 바이러스 리보솜에 의해 소 성장 호르몬 종단 및 폴리아데니션 서열이 이어서 바이러스 게놈의 정확한 3-prime을 포함하는 RNA를 생산하였다.
BAC cDNA가 조립되면, 전염하는 바이러스는 양이온 리포좀을 사용하여 BAC cDNA 클론을 사용하여 취약한 베로 세포의 직접적인 형질 전환 후에 쉽게 복구될 수 있다. 이 방법을 사용하여 R Zika 바이러스 RGN은 밀리리터 당 1백만 개 이상의 플라크 형성 단위로 더 높은 티터로 구출 될 수 있습니다. 또한, 구조된 바이러스는 명확한 세포병증 효과를 유도하고 약 2밀리미터 크기의 균질성 플라크를 생성한다.
구조된 바이러스 정체성은 Zika 바이러스 E 단백질에 대한 특정 단일 클론 항체를 사용하여 면역 형광 분석을 통해 확인된다. 전반적으로, 이러한 결과는 전염성 재조합 Zika 바이러스가 BAC에서 조립된 전신 cDNA 클론에서 구출될 수 있다는 것을 보여줍니다. 요약하자면, 병리학의 연구를 용이하게 하기 위해, 백신을 개발하거나, 항바이러스 활성을 이용한 약물의 식별을 용이하게 하기 위해 다른 양성가닥 RNA 바이러스의 cDNA 클론을 사용하여 안정적이고 기능적인 감염을 생성하도록 적응할 수 있는 세균성 인공 염색체의 사용에 기초하여 강력한 Zika 바이러스 역유전적 접근법을 개발하였다.
