세포 치료에 대한 관심이 높아짐에 따라 이러한 세포의 기능을 평가하기 위한 새로운 방법이 필요합니다. 이 프로토콜은 신경 맥락에 대한 이러한 세포 생착에 대한 시험관 내 장기 평가를 허용합니다. 이 기술의 주요 장점은 모든 구성 요소가 인간에서 유래했다는 것입니다.
또한 생착을 쉽게 추적할 수 있고 오가노이드의 환경을 쉽게 변경할 수 있어 다양한 약물이나 치료제를 테스트할 수 있습니다. 이 기술을 시연하는 사람은 제 연구실의 재능 있는 박사 과정 학생인 Iliana Ibanez입니다. 유도만능줄기세포 또는 iPSC 유래 신경전구세포(NPC)의 단세포 현탁액을 얼음에서 제거하고 섭씨 4도에서 5분간 300g으로 원심분리하는 것으로 시작합니다.
상층액을 제거하고 세포 펠릿을 가용화된 기저막 매트릭스의 밀리리터당 3밀리그램으로 재현탁시켜 주입당 2마이크로리터의 최종 부피를 얻습니다. 사용할 때까지 즉시 서스펜션을 얼음 위에 다시 놓으십시오. 섭씨 20도의 냉동실에서 미리 식힌 주사기를 얼음 양동이로 옮겨 나중에 사용할 수 있습니다.
다음으로 인큐베이터에서 뇌 오가노이드 플레이트를 제거하고 넓은 보어 팁을 사용하여 오가노이드를 35mm 접시에 옮깁니다. 오가노이드를 안정화하고 주입을 용이하게 하려면 오가노이드를 손상시키지 않고 배지를 최대한 제거하십시오. 오가노이드가 들어 있는 35mm 접시를 해부 현미경 아래에 놓아 주입을 용이하게 합니다.
오가노이드를 주입할 준비가 되면 냉각된 P20 피펫 팁을 사용하여 EGFP 표지된 NPC 세포를 부드럽게 재현탁시키고 이 세포 2마이크로리터를 사전 냉각된 멸균 유리 슬라이드로 옮깁니다. 얼음에서 미리 채워진 인슐린 주사기를 꺼내 바늘의 경사가 아래를 향하도록 하여 2마이크로리터의 세포 현탁액을 천천히 끌어올립니다. 현미경의 초점을 맞추기 전에 오가노이드가 들어 있는 접시의 뚜껑을 엽니다.
한 손으로 접시를 잡고 바늘의 경사를 위로 올립니다. 그리고 다른 손으로 세포를 오가노이드 표면에 천천히 주입합니다. 세포를 주입한 후 뚜껑을 다시 접시에 넣고 주입된 오가노이드를 1-2분 동안 배양합니다.
그런 다음 오가노이드 매질 500마이크로리터를 플레이트에 부드럽게 첨가한 후 오가노이드를 넓은 보어 팁이 있는 24웰 플레이트로 옮깁니다. 오가노이드를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 이틀에 한 번씩 완전히 배지를 교체하여 배양합니다. 형광 현미경에 주입되지 않은 또는 음성 대조군 오가노이드를 로드합니다.
그리고 조명 강도를 1과 2 사이로 설정하고 노출 시간을 80에서 100밀리초 사이로 설정하여 자가형광을 최소화합니다. 다음으로, 양성 대조군 오가노이드를 로드하고 노출 시간을 높여 표지된 세포가 보이도록 합니다. 넓은 보어 피펫 팁으로 오가노이드의 위치를 변경하여 주입을 위한 향상된 녹색 형광 단백질 또는 EGFP 플러스 영역을 찾습니다.
오가노이드를 로드하기 전에 오가노이드에서 배지를 완전히 제거합니다. 그리고 선택한 설정으로 이미지를 만듭니다. 이미징이 완료되면 오가노이드가 건조되는 것을 방지하기 위해 즉시 새 배지를 추가합니다.
모든 오가노이드에 대해 배지 제거 및 이미징을 반복한 후 오가노이드를 정상 배양 및 배지 변화로 되돌립니다. 원하는 간격으로 이미징을 반복합니다. 톨루엔으로 채워진 코플린 슬라이드 염색 용기에 슬라이드를 2분 동안 넣고 이 단계를 반복합니다.
그런 다음 유리 슬라이드를 100% 에틸 알코올로 채워진 유리 코플린 슬라이드 염색 용기에 2분 동안 옮깁니다. 그리고 슬라이드를 2분 동안 물을 채운 코플린 항아리로 옮기기 전에 이 단계를 반복합니다. 물로 씻기를 반복하십시오.
그런 다음 플라스틱 용기를 수조에 넣고 플라스틱이 수조 바닥에 닿지 않도록 합니다. 플라스틱 용기 안에 구연산염 완충액을 붓고 섭씨 95도에서 100도에 도달하도록 합니다. 버퍼가 원하는 온도에 도달하면 슬라이드를 버퍼 안에 넣고 뚜껑으로 용기를 느슨하게 덮고 슬라이드를 수조 안에 30-40분 동안 둡니다.
배양 후 수조에서 플라스틱 용기를 꺼내 실온에서 20분 동안 식힙니다. PBS로 슬라이드를 각각 2분씩 세 번 세척합니다. 샘플을 만지지 않고 종이 티슈로 PBS를 제거합니다.
투과화 완충액을 준비하고 유리 슬라이드 염색 용기를 채웁니다. 슬라이드를 투과화 완충액에 담그고 10분 동안 배양합니다. PBS를 각각 2분씩 3회 반복합니다.
그런 다음 각 샘플을 덮을 염색 혼합물을 준비하고 오가노이드 슬라이드에 25마이크로리터를 첨가한 후 실온에서 1시간 동안 슬라이드를 배양합니다. 배양 후 PBS를 각각 2분 동안 세 번 세척하고 유리 슬라이드 염색 용기 안에 증류수로 슬라이드를 헹구어 염분을 제거합니다. 다음으로, 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 이미징하기 전에 각 샘플에 10마이크로리터의 액체 마운트와 DAPI를 추가합니다.
2X 담금질 완충액으로 반쯤 채워진 유리 코플린 염색 용기에 PBS 45ml를 넣고 이 용기 안에 슬라이드를 넣습니다. 항아리를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 형광 현미경을 사용하여 염색 및 이미징을 반복하기 전에 형광단이 효과적으로 소멸되었는지 확인합니다.
GFP 형광의 명확한 복용량 의존은 10, 000의 세포에 세포 헝겊 조각 탐지 플러스 일관된 EGFP와 더불어 입력 세포 수에, 출석했다. EGFP 양성을 위해 이미징된 주입된 오가노이드 및 대조군은 4개월의 추적 기간 동안 주입된 부위의 지속성을 보여주었습니다. 추가 EGFP 양성 세포 패치는 이식 후 9일 후에 나타났고 연구 종점까지 지속되어 세포의 이동과 새로운 부위에서의 통합을 나타냅니다.
더 높은 배율에서는 오가노이드에 긴 돌출부로 명확한 신경 형태를 관찰할 수 있어 주입된 세포의 통합을 확인할 수 있었습니다. 초기 단일 라운드 염색에서 NPC 상태를 유지하는 세포와 신경 운명으로 분화한 세포의 혼합물을 포함하여 주사 부위에 EGFP 플러스 세포의 존재가 확인되었습니다. 대조군과 주입된 오가노이드의 경우, 네스틴과 NPC가 거의 관찰되지 않았으며, TUJ1과 미성숙한 성숙 뉴런이 대부분이었습니다.
두 개의 원형 염색은 오가노이드의 바깥쪽 영역 대부분에 성숙한 뉴런을 드러내고 미성숙한 뉴런 영역은 중간을 향해 더 자세히 설명했습니다. 성상교세포(astrocyte)는 주입된 오가노이드와 대조군 오가노이드에 존재했으며, 바깥쪽 가장자리 주위에 산재되어 있었다. 주입된 오가노이드에서 두 개의 라운드 염색을 수행한 절편은 성숙한 뉴런의 표현형을 채택한 주입 부위에서 멀리 떨어진 EGFP 플러스 세포의 작은 위성 콜로니를 보여주었습니다.
이 군집 중 일부는 성상교세포(astrocyte) 근처에 있는 것으로 보인다. 그러나, GFP 염색에 완전히 겹치는 EGFP 플러스 세포는 성상교세포를 생성하기보다는 오히려 인접해 있다는 것을 건의하지 않았습니다. 오가노이드를 주입할 때 오가노이드를 완전히 파괴할 수 있으므로 너무 많은 힘을 가하거나 너무 빨리 주입하는 것을 피해야 합니다.
따라서 수명 추적 후 오가노이드를 연결하여 유세포 분석 또는 단일 세포 염기서열 분석 접근법에 사용할 수 있습니다. 이를 통해 세포의 분자 상태를 알 수 있습니다. 이 기술은 신경 퇴행성 질환에 대한 세포 치료를 발전시키고 뇌종양이나 전이를 모델링하는 데 매우 유용할 수 있습니다.
