다양한 소 뇌 구조에서 광견병 바이러스의 양. 멕시코는 상당한 가축 잠재력을 가진 나라입니다. 가축 생산량이 가장 높은 주에는 광견병의 주요 송신기인 뱀파이어 박쥐인 데스모더스 로툰두스(Desmodus rotundus)의 존재로 인해 광견병 발병 위험이 있는 습한 열대 지역과 건조한 지역이 모두 포함되어 있습니다.
광견병 바이러스 뉴클레오프로틴 N 유전자의 검출은 주로 분자 시험에 의한 광견병 진단에 사용됩니다. PCR 기반 접근법을 사용하여 DNA 뉴클레오티드 서열의 선택적이고 반복적인 증폭을 통해 임상 샘플에서 최소한의 수량을 검출할 수 있습니다. qRT-PCR은 형광 신호가 증가하는 분자의 검출 및 정량화를 기반으로 단일 반응에서 PCR 제품의 양에 직접적으로 비례한다.
핵산 표적의 사본 수가 증가함에 따라 형광도 증가합니다. 이를 바탕으로, 연구의 목적은 광견병 감염으로 인해 사망 후 소 뇌의 다른 해부학 적 구조에서 바이러스 성 입자의 수를 결정하기 위해 정량적 qRT-PCR을 사용하는 것이었습니다. 총 RNA는 다음 프로토콜에 따라 유기 추출 방법을 사용하여 소 뇌로부터 직접 추출되었다.
각 해부학 구조에서 뇌 조직의 100 밀리그램을 사용하여 guanidinium isothiocyanate를 포함하는 시판되는 시약을 사용하여 총 RNA를 추출하십시오. 각 구조체에서 1밀리리터의 조직을 최대 속도로 15초 동안 마이크로튜브 내부에 작은 유봉을 가진 Dounce 균질화를 사용하여 시약을 피망시켜 각 구조에서 총 100밀리그램의 조직을 수동으로 균질화합니다. 5 분 동안 얼음에 샘플을 배양 한 다음 200 마이크로 리터의 클로로폼을 추가합니다.
샘플을 15초 동안 적극적으로 섞습니다. 얼음에 2~3분 간 배양한 다음, 원심분리기는 섭씨 4도에서 15분 동안 12, 000 x g로 원심분리기를 넣습니다. 수성 상을 깨끗한 튜브로 옮기고 500 마이크로리터의 이소프로필 알코올을 추가합니다.
21도 섭씨에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 원심 분리는 섭씨 4도에서 10 분 동안 12, 000 x g의 샘플을 원심 분리합니다. 피펫팅으로 수퀴상수 상체를 흡인합니다.
격리된 RNA는 관내 펠릿으로서 존재할 것이다. 다음으로, RNA 펠릿을 75% 에탄올1밀리리터로 세척하여 7, 500 x g에서 섭씨 4도에서 5분간 파이펫팅및 원심분리기를 세척합니다. 상체 및 공기를 디산하여 실온에서 RNA 펠릿을 건조시키고, 섭씨 21도.
다음으로, 클레카제없는 물의 50 마이크로 리터에 펠릿을 희석. 분광광계를 사용하여 260 나노미터에서 RNA 농도 및 품질을 결정합니다. 시험관 내 전사는 표적 유전자의 mRNA를 생성한다.
완전한 RABV N 유전자를 증폭시키는 프라이머 쌍과 qRT-PCR 분석기의 양성 제어로 사용되는 프라이머 쌍을 사용합니다. 이러한 프라이머는 완전한 RABV N 유전자를 증폭시키고 T7 폴리머라아제를 인식하는 프로모터를 추가하도록 설계되었습니다. 전체 N 유전자 RABV를 증폭하려면 프라이머 트랜스 및 RAB를 앞뒤로 사용하고 고충실도 PCR 키트를 사용합니다.
각 반응에 대해, 각 프라이머의 10 마이크로몰라와 0.5 단위의 고충실도 폴리머라아제로 깨끗한 PCR 튜브 반응 버퍼에 추가하여 PCR 마스터 믹스를 준비한다. PCR 제품을 체외 합성을 위한 템플릿으로 사용하고 효소 반응의 구성 요소를 제거하려면 제조업체의 지침에 따라 열 기반 농축기 키트를 사용하여 PCR 제품을 정화합니다. 그런 다음 분광계를 사용하여 정량화합니다.
RNA 합성의 경우, 다음과 같은 반응 혼합물을 가진 체외 전사 키트를 사용하십시오: 5 마이크로리터 T7 전사 5X 버퍼, 각 트리호스산염 뉴클레오티드의 1.9 마이크로리터, 정제된 RABV N DNA 10마이크로그램, 효소 혼합물의 2.5 마이크로리터. 다음으로, 혼합물을 섭씨 37도에서 4시간 동안 배양합니다. 그런 다음, 마이크로그램 Rnase-Free DNase당 1개의 마이크로리터를 반응 혼합물에 추가하고 DNA 오염을 제거하기 위해 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.
시험관 내 전사 RNA를 정화한 다음 페놀:클로로폼:이소아밀 알코올을 25:24:1의 비율로 사용하여 농축한다. 정제 된 RNA 펠릿을 TE 버퍼70 마이크로 리터로 다시 중단 한 다음 사용할 때까지 섭씨 80도에 저장하십시오. PCR 제품의 약 5 마이크로그램이 얻어지을 때까지 PCR 프로토콜을 반복하십시오.
정제 및 농도 후, 생체 외 전사 N 유전자 mRNA는 마이크로리터 당 4.711 마이크로그램의 농도로 존재할 것이다. 시험관 내 전사 mRNA가 이 프로토콜의 5단계 다음 N 유전자에 대응하는지 확인하고, 이를 실시간 역전사 폴리머라제 연쇄 반응, qRT-PCR에 대한 양성 대조군으로 사용한다. 실시간 역전사 폴리머라제 연쇄 반응의 경우, 완전한 N 유전자를 양성 대조군으로 코딩하는 시험관 내 mRNA 전사를 사용한다.
제조업체의 지침에 따라 하이브리드화 프로브를 사용하는 상업용 1단계 qRT-PCR 키트와 함께 사용할 수 있습니다. 코로나도와 동료 2010년에 설명한 프라이머에서 프로브를 사용하여 다음과 같은 열 순환 조건을 사용하여 RABV의 보존 된 영역을 감지하십시오. 6개의 분리된 희석이 얻어질 때까지 mRNA의 마이크로리터 당 1마이크로그램을 튜브로 직렬로 배관하여 생체외 전사 된 mRNA의 직렬 희석을 수행합니다.
표준 곡선을 만드는 데 사용할 수 있는 트리플리케이트로 100 마이크로리터 볼륨으로 튜브를 준비합니다. 앞서 설명한 대로 qRT-PCR을 수행합니다. 표준 곡선을 생성하고 세포 배양으로부터 분리된 양수 제어, 음수 제어 및 슈퍼나티를 사용하기 위한 달리기 반응과 동시에 다양한 뇌 샘플을 처리하여 로터로 열 사이클러에서 qRT-PCR을 수행합니다.
시험의 검출, 테스트 효능 및 감도의 한계를 평가하려면 동일한 조건에서 트리플리케이트에 표준 곡선을 사용합니다. RABV 유전자 N의 검출을 위해, 이전에 설명된 PCR 키트를 사용하여 qRT-PCR을 수행하기 위해 필드 샘플, 양성 제어, 음수 제어 및 세포 배양 초나티로부터 RNA를 사용한다. 소 뇌 샘플에 존재하는 RABV 게놈의 사본 수를 결정하기 위해, 표준 곡선 및 생물학적 샘플에서 CT 데이터를 얻고, 교정 곡선 방정식에서 보간된 이들로부터 이 수치는 직접적인 면역 형광에 따라 양성 얼룩을 나타내는 소 뇌 조직을 나타낸다.
결과는 각각 피질, 시상, 수질, 폰 및 뿔에서 RABV에 대한 100%100%83.3%와 50%의 긍정성을 나타낸다. 이러한 결과는 이전 결과를 확인, 각 뇌에서 해부 구조의 적어도 세 RABV에 대 한 긍정적인. 한편, 표준 곡선의 방정식은 샘플내RABV 유전적 함량의 양과 PCR 증폭 단편의 크기 사이의 관계를 나타낸다.
나노그램의 RABV 유전 적 함량의 양은 이 그림에 제시된 방정식을 사용하여 교정 곡선에서 CT 값의 보간에 의해 추론되었다. 이 방정식을 사용하여, 바이러스 RNA의 마이크로리터 당 10~5마이크로그램의 검출 한계는 RABV 게놈의 36개 사본에 대응하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 분석이 민감하고 RABV N 유전자의 낮은 수의 사본을 포함하는 샘플에서 바이러스를 검출하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다.
분석의 효율은 표준 곡선의 경사를 사용하여 계산되었으며, 이는 3.28이었다. qRT-PCR에 사용되는 샘플은 RABV N 유전자의 증폭을 보였다. 존재하는 바이러스 사본수를 결정하기 위해 각 샘플의 CT 값은 교정 곡선 방정식을 사용하여 보간되었습니다.
나노그램에서 얻은 결과는 여기에 설명된 포뮬러로 대체되었다. 이 표는 qRT-PCR과 DFA 간의 비교 결과를 보여 주어 있습니다. qRT-PCR 어약의 결과는 DFA를 사용하여 얻은 것과 일치하였다.
QRT-PCR 검사에서 얻은 결과에 따르면 C 및 D의 경우, 시상은 RABV N 유전자의 가장 많은 수의 사본을 소유하는 구조이다. 이것은 시상 하 부 및 thalamic 뉴런의 초기 감염이 질병의 개발에 중요 하다는 것을 건의, 이러한 뉴런 동물의 식물 기능을 제어 주어진. 각 샘플의 각 구조에서 검출된 RABV N 유전자의 카피 번호는 모든 샘플이 양성이기 때문에 qRT-PCR 테스트의 민감도 및 특이성입니다.
이 결과는 견본의 초기 진단과 일치합니다. qRT-PCR은 매우 민감한 기술입니다. 일부 단계는 최상의 결과를 얻는 데 중요합니다.
이들 중 하나는 RNA 추출을 위한 시료의 적절한 처리입니다. RNA가 쉽게 저하되고 그 결과가 그러므로 영향을 받을 수 있기 때문에 이 단계는 중요합니다. 추운 조건에서 샘플을 유지하는 것이 좋습니다, 공정 기간 동안 섭씨 약 4도.
또한, 시험관 내 전사에서 언급한 바와 같이 여러 발의 PCR 적용이 수행되는 것을 고려한다. 이 연구에서 수행 된 qRT-PCR 분석은 조직의 밀리그램 당 RABV N 유전자의 36.3 사본만큼 검출 할 수 있습니다. qRT-PCR에 가장 적합한 뇌 구조에는 피질과 시상이 포함되었습니다.
이것은 RABV N 유전자의 더 높은 농도가 이 구조물에서 검출되었다는 관측에 근거하고, 그(것)들은 또한 RABV 기준 시험을 사용하여 양성인 것으로 나타났습니다. 시험은 다양한 견본에서 바이러스의 9번째 사본에 0.00023 시간 10에 아주 낮은 농도, 0.00023 시간 검출할 수 있었습니다. 샘플내의 바이러스 입자를 정량화하는 것 외에도, 여기서 제시된 RABV의 검출을 위한 좋은 대체 진단 및 연구 도구를 제공하는 것으로 보인다.
