흉부 이식은 흉부 상피 세포 기능 및 생체 내T 세포 성숙을 조사하기위한 중요한 방법입니다. 이 간단하고 효율적인 프로토콜은 신장 캡슐로 후속 이식을 위해 마우스 18.5 흉자를 분리하고 배양하는 데 사용할 수 있습니다. 18.5 흉부 이식프로토콜은 다른 발달 단계또는 유사한 크기의 다른 조직에 대해 흉부 이식을 위해 수정될 수 있다.
또한,이 절차는 매우 간단합니다. 일부 케이스 스탬프에 대한 세부 정보는 이 기술을 처음 수행할 때 신중하게 검토해야 합니다. 이 절차에는 시각화로 더 잘 설명할 수 있는 자세한 조작이 포함되어 있습니다.
희생 후, 배아일 18.5을 70%에탄올로 닦아내고, 방광에서 자궁의 각 뿔까지 복부에 V자형 절단을 하기 위해 자동 살균된 멸균 기구를 사용한다. 가위를 사용하여 심술관과 자궁 경부 및 질 부위를 자르고 자궁을 얼음에 차가운 PBS가 들어있는 페트리 접시로 수확하십시오. 전방 자궁 벽을 한 자궁 뿔에서 다른 자궁 뿔로 자르고 envelop 내의 배아를 데시두아로 노출시키고 미세 핀셋을 사용하여 데시티 조직을 벗겨냅니다.
탯줄을 잘라 배아를 얼음 위에 새로운 페트리 접시로 옮길 수 있습니다. 첫 번째 흉기를 수확하려면 70 %의 알코올로 한 배아를 닦고 배아를 새로운 페트리 접시로 옮으려면. 참수 후, 축산 의 위치에 있는 접시에 있는 배아를 고치고, 감방 전면을 따라 수평으로 측면 가슴 벽을 잘라멸균 가위를 사용하십시오.
가슴을 열어 다이어프램을 잘라. 흉선은 기관 앞에 위치하고 심장에 인접한 두 개의 흰색 엽으로 볼 수 있어야합니다. 심근 뒤에 구부러진 팁 집게를 조심스럽게 삽입하고 부드럽게 당겨 조직을 수확합니다.
흉선의 무결성을 확인하여 두 개의 관절 엽이 포함되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 스테레오 현미경을 사용하여 결합 조직과 혈관을 다듬기 전에 PBS로 흉선을 씻으하십시오. 모든 티미가 수집되면 각 깨끗한 조직을 24개의 웰 플레이트의 개별 우물로 옮기고 500마이크로리터의 배양 배지를 잘 함유한다.
그리고 2'deoxygranosine를 잘 당 1.25 밀리머의 최종 농도에 추가합니다. 그런 다음 8 일 동안 세포 배양 인큐베이터에 고립 된 티미를 놓습니다. 문화의 마지막 날에, 45도 각도로 주입 튜브 부분에 두피 정맥 바늘을 잘라 누드 받는 사람의 발가락 핀치에 대한 응답의 부족을 확인하기 위해 가위를 사용합니다.
수술대에 마우스를 오른쪽 측면 위치에 놓고 0.5%의 포비도네 요오드 면봉을 사용하여 수술 부위에서 신체 외부까지 두 번 피부가 면봉합니다. 메스를 사용하여 왼쪽 신장 부위의 척추와 평행하게 5~9mm의 피부 절개를 하고 피하 조직과 근육을 잘라 복강을 엽니다. 한 손으로 핀셋 한 쌍을 사용하여, 노출 된 신장의 척추 측 절개 가장자리에서 근육과 지방 조직을 들어 올리고 부드럽게 신장을 짜내기 위해 다른 손을 사용합니다.
수술 중 신장 캡슐을 촉촉하게 유지하기 위해 신장 표면을 식염수로 적시고 두피 바늘을 사용하여 오른쪽 아래쪽의 신장 캡슐을 신장 너비 약 1/2 에서 2/3 정도 부드럽게 긁습니다. 주입 튜브를 캡슐의 닉에 밀어 넣고 신장 캡슐에 약 3~4밀리미터 정도 긴 신장에서 신장 캡슐을 부드럽게 분리합니다. 그런 다음 주입 튜브를 철회합니다.
흉선을 생성된 캡슐 공간에 이식하려면 한 배양 흉기를 신선한 식염수에 두 번 씻고 잘린 주입 튜브를 주사기에 연결합니다. 준비된 흉합을 수정된 주입 튜브에 천천히 흡인시합니다. 그리고 주입 튜브를 신장 캡슐에 부드럽게 삽입하여 우수한 극에 도달할 때까지 넣습니다.
신장 캡슐에 흉선을 전달하려면 튜브를 천천히 철회하면서 플런저를 부드럽게 우울하게 만듭니다. 알코올 램프를 사용하여 두피 바늘을 약간 가열하고 전체 흉골이 캡세이크 공간 안에 있는지 확인한 후 가열 된 바늘을 사용하여 닉을 소작시하십시오. 복강에 소작 신장을 복원하고 봉합봉과 근육을 봉합사로 닫습니다.
변형된 중단된 수직 매트리스 봉합사를 사용하여 적어도 3노트로 피부 절개를 닫고 포비도요오드 면봉을 사용하여 절개를 소독합니다. 그런 다음 항생제와 진통의 피하 주사를 제공하고 전체 복구까지 모니터링과 적외선 램프 아래에 마우스를 배치합니다. 여기서, 두 개의 완전한 엽을 포함하는 분리배아 일 18.5 흉합을 관찰할 수 있다.
이식 직후, 흉선은 받는 사람의 신장 끝에 있는 신장 캡슐 아래에 시각화될 수 있다. 누드 마우스 받는 동물 내에서 성장 의 8 주 후, 흉선 캡슐 아래에 남아, 하지만 크기가 강력하게 증가. T 세포는 이식된 흉선과 누드 마우스 수령인의 말초 혈액 모두에서 생산됩니다.
그러나 예상대로, 어떤 T 세포는 비 이식 누드 동물의 말초에서 검출되지 않습니다. 또한, 본 대표적인 실험에서, LacZ 알렐을 함유한 흉엽으로 이식된 누드 마우스 수신자의 말초 혈액으로부터 수확된 말초 T세포에서 엽유전자가 검출되지 않았으며, 이는 수신자 동물로부터 말초 T세포가 생성되었음을 나타낸다. 관을 신장 캡슐로 미끄러질 때 부드럽게 하십시오.
캡슐을 깨는 것을 피하십시오. 그리고 당신은 흉선 배달에 충분한 공간이 있는지 확인하십시오. 티믹 또는 주변 T 세포 집단은 유동 세포계를 사용하여 분석될 수 있다.
여기서, 수령인의 말초 조직에 있는 면역 반응은 I2d 및 면역 조직화학 분석에 의해 분석될 수 있습니다.
