이 프로토콜은 여러 조직을 평가할 때 냉동 조직의 사용이 물류를 단순화하고 분석을 위해 원격 실험실로 샘플 전송을 허용하며 몇 달 동안 조직을 분석하는 결정을 연기할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 냉동 큐브 조직의 사용이 부검에서 혜성 분석에서 훈련 된 인력을 필요로하지 않으며, 샘플 조작 중에 도입 된 기술적 오류 및 기계적 DNA 손상에 대한 기회를 최소화한다는 것입니다. 이 기술은 전임상 약물 개발, 환경에 들어가는 화학 물질의 안전 평가 및 식품 첨가제에 응용 이해왔습니다.
냉동 조직은 혜성 분석에서 유독성 잠재력, DNA 수리, 화학 요법 또는 방사선에 의해 유도 된 DNA 손상에 대한 보호 효과 및 환경 바이오 모니터링을 위해 사용할 수 있습니다. 이상적으로, 실험은 다음 동물에게서 수확한 기관이 처리를 위해 유효해지기 전에 동결 단계로 각 조직 견본의 처리를 허용하도록 설계되어야 합니다. 냉동 조직은 유독성 잠재력, DNA 수리, 화학 요법 또는 방사선에 의해 유도 된 DNA 손상에 대한 보호 효과 및 환경 바이오 모니터링을 평가하기 위해 혜성 분석에서 소송을 제기 할 수 있습니다.
기술 트레이너 캐롤 보빗, 조사 독성 실험실 매니저 아일린 길라스는 오늘 프로 섹터로 봉사 할 것입니다. 연구 동료 링컨 마틴, 그리고 역사학 기술자 아멜리 Ladesseur 샘플 처리를 시연 할 것입니다. 이 절차를 시작하려면 관심 기관에서 연결된 연결 조직, 장기 및 이물질을 제거하십시오.
잔류 혈액과 파편을 제거하기 위해 약 7 밀리리터의 차갑고 갓 준비된 다진 용액이 들어있는 중간 크기의 계량 보트에서 즉시 장기를 힘차게 휘젓습니다. 조직을 물에 잠그고 추가 처리될 때까지 얼음 위에 유지하기에 충분한 냉분질 용액을 포함하는 다른 깨끗한 계량 보트로 기관을 옮춥니다. 간의 경우 왼쪽 엽의 5mm 세로 섹션을 자르고 차가운 다진 용액의 약 7 밀리리터에서 부드럽게 스위시하십시오.
그런 다음 조직의 스트립을 약 7 밀리리터의 차가운 다진 용액이 들어있는 깨끗한 중간 크기의 계량 보트에 넣고 더 처리 할 준비가 될 때까지 얼음을 유지합니다. 간 의 한 부분을 제거하고 포함 카세트에 배치합니다. 가능한 미래 조직 병리학 평가를 위한 실험실 표준 절차에 따라 고정, 트리밍 및 파라핀 포함을 수행합니다.
십이지장의 경우 십이지장 근위 10mm 부분을 위장에 잘라냅니다. 십이지장 한쪽 끝에 21~25게이지 바늘을 삽입하고 차가운 밍크 액액 1밀리리터로 세척하여 이물질과 박테리아를 제거합니다. 십이지장을 뒤집어 다진 용액의 또 다른 밀리리터로 다시 씻어 내고 바늘을 버립니다.
십이지장 위를 슬라이스하고 약 7밀리리터의 밍크 액티비터에 헹구습니다. 그런 다음 십이지장 두경을 다시 헹구고 더 멀리 처리 할 준비가 될 때까지 얼음에 다진 용액으로 유지합니다. 이전에 간을 위해 설명된 바와 같이 가능한 미래 조직 병리학 평가를 위해 나머지 십이지장의 일부를 잘라고 수정합니다.
두뇌를 위해, 가능한 조직병리학을 위해 저장되는 한 반구와 함께, 먼저 두 개의 반구로 두뇌를 분할하는 것이 유용할 지도 모릅니다. 관심있는 뇌 영역을 해부한 다음 부드럽게 헹구고 간과 십이지장에게 이전에 설명된 대로 더 가공 할 준비가 될 때까지 다진 용액의 얼음을 유지하십시오. 위장의 경우, 제거하고 위위를 폐기.
선위를 열고 차가운 다진 버퍼 약 7 밀리리터가 들어있는 중간 크기의 계량 보트에서 스위싱하여 음식에서 무료로 씻으십시오. 이전에 설명한 바와 같이 가능한 조직 병리학 평가를 위해 고정을 위해 십이지장까지 5밀리미터의 선 위 근위를 제거하십시오. 남은 위장을 약 7밀리리터의 차가운 다진 버퍼가 들어 있는 중간 크기의 계량 보트에 넣고 15~30분 동안 얼음위에 배양합니다.
그 후, 위장을 깨끗한 파라핀 조각으로 옮기고 메스 블레이드 나 플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 표면 상피를 두 번 부드럽게 긁어 이물질을 제거합니다. 집게로 위 점막을 집어 들고 파이펫을 사용하여 차가운 다진 버퍼 1 밀리리터로 헹구세요. 헹구는 위 조직을 깨끗한 표면이나 접시에 옮기고 차가운 다진 용액을 추가합니다.
메스 블레이드 또는 플라스틱 셀 스크레이퍼의 뒷면을 사용하여 위 상피를 4~5회 조심스럽게 긁어 내어 세포를 방출합니다. 이어서, 파이펫을 사용하여 방출된 세포를 포함하는 밍크 액액을 수집하고 얼음상에 있는 미세원심분리기 튜브로 옮기다. 조직 샘플을 다진 경우 간, 뇌 또는 십이지장 의 한 부분을 자르고 차가운 다진 용액 1 밀리리터를 포함하는 표지 된 미세 센심 분리기 튜브로 옮춥시게합니다.
다진 가위를 사용하여 샘플이 마침내 분산될 때까지 시료를 빠르게 다진 반면 샘플이 차가운 상태를 유지하도록 합니다. 샘플은 약간 흐린 것처럼 보일 것입니다. 그러나, 튜브의 바닥에 정착 하는 일부 조각 남아 하는 것이 일반적이다.
그것은 신선한 동안 조직을 사용 하려면, 얼음에 샘플을 포함 하는 튜브를 유지. 조직 샘플을 동결하려면, 다진 또는 수집 직후 튜브의 뚜껑을 고정하고 액체 질소를 포함하는 데워 플라스크에 튜브를 떨어 뜨립니다. 조직 수확이 끝나면 국자를 사용하여 샘플 튜브를 검색하고 건조 얼음에 배치하여 정렬하십시오.
튜브를 드라이 아이스의 냉동고 상자에 옮기고 상자를 영하 80도의 냉동고에 보관합니다. 조직의 냉동 큐브를 준비하기 위해, 조직의 몇 가지 작은 조각을 잘라 개별적으로 몇 초 동안 액체 질소를 포함하는 중간 크기의 계량 보트 또는 다른 적합한 용기에 직접 드롭. 조각이 완전히 얼어 붙은 후, 냉동 조직 큐브를 개별적으로 옮기고 미세 원심 분리튜브 또는 냉동 튜브를 드라이 아이스에 부착합니다.
조직 수확이 끝나면 튜브를 드라이 아이스의 냉동고 상자로 옮기고 상자를 영하 800도의 냉동고에 보관하십시오. 젖은 얼음에 유지 되는 갓 다진 또는 긁힌 조직을 사용 하는 경우, 수확 의 시간 이내에 혜성 슬라이드를 준비. 냉동 다진 또는 긁힌 조직을 사용하는 경우, 샘플이 완전히 해동 될 때까지 실온에서 수조에 냉동 조직의 튜브를 배치하여 차가운 유지되도록합니다.
시료가 해동되면 즉시 튜브를 얼음으로 옮기습니다. 큐브 조직의 경우 냉동고에서 큐브가 들어있는 튜브를 회수하고 슬라이드 준비까지 드라이 아이스를 유지합니다. Aliquot는 상인의 매체 의 1 밀리리터 또는 각 샘플에 대한 라벨1.7 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 다진 용액을 표시하고 얼음에 유지합니다.
해동을 피하기 위해 빠르게 작동하여 실온 조직 채굴 장치의 열린 끝에 조직 큐브를 배치합니다. 장치로 일치하는 크기와 일치하는 주사기 플런저를 신속하게 삽입하여 조직을 메쉬 끝으로 밀어 넣은 다음 차가운 밍크 솔루션을 포함하는 미세 원심 분리기 튜브에 배치해야합니다. 차가운 다진 용액에 약 5~10초 동안 장치의 메쉬 끝을 침수하여 조직이 완전히 해동할 수 있도록 합니다.
세포가 메쉬 모공을 통해 압출될 때까지 플런저를 완전히 우울하게 합니다. 그런 다음 플런저를 약 2.5센티미터 위로 당기고 다시 완전히 누릅니다. 밍싱 솔루션이 탁구가 될 때까지 여러 번 반복합니다.
슬라이드를 준비하려면 셀 서스펜션을 부드럽게 혼합하고 50 마이크로리터를 섭씨 37도에서 0.5% 낮은 융점 아가로즈450 마이크로리터를 함유한 튜브로 옮킨다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 슬라이드를 준비하고 점수를 매는다. 첫 번째 연구에서, 간 은 1 주일 의해 비틀 거린 남성 Sprague Dawley 차량 제어 쥐의 두 코호트에서 수확되었다.
미끄럼주는 갓 다진 조직, 냉동 다진 조직 및 냉동 큐브 조직에서 제조되었습니다. OECD는 신선한 쥐 간에서 백분율 꼬리 DNA에 대한 상한을 권장하기 때문에 6%이러한 결과는 동결 방법 중 어느 것이든 조직을 평가하기 위해 잘 작동 할 수 있음을 보여줍니다. 전반적으로, 고슴도치는 백분율 꼬리 DNA를 평행시켰습니다, 동결된 조직이 더 중대한 가변성을 보였더라도.
두 번째 연구에서는, 암컷 B6C3F1 마우스는 돌연변이원 에틸 메탄설포네이트를 투여하였다. 백분율 꼬리 DNA 결과는 간 조직이 큐브로 동결되고 그 후에 조직 다진 장치를 사용하여 처리되었다는 것을 신선하게 다진 조직을 위해 얻은 것과 아주 유사한 결과를 산출했다는 것을 표시합니다. EMS 유도 DNA 손상의 통계적으로 유의한 증가는 세 가지 방법 모두에 의해 처리된 조직 샘플에서 측정되었다.
세 번째 연구에서는, 90일 화학독성 연구에서 여성 B6C3F1 마우스로부터 채취한 간 샘플을 분석하였다. 냉동 다진 조직의 DNA 손상은 동물 가변성에 상당한 동물과 함께 모든 용량 그룹에 걸쳐 높았다. 백분율 꼬리 DNA 결과는 고슴도치가 이 견본에서 관찰된 DNA 손상의 높은 수준에 실질적으로 기여했다는 것을 나타내는 백분율 고슴도치와 상관관계를 연관시켰습니다.
대조적으로, 손상된 DNA와 백분율 고슴도치는 다진 조직 견본과 병행해서 준비된 플래시 동결된 입단에서 아주 낮았습니다. 따라서, 다진 조직 샘플에서 고슴도치로 나타난 고슴도치로서 나타난 고슴도치들은 생물학적 과정의 결과가 아니라 기계적 중단에 의해 도입되었을 가능성이 높았으며, 또는 플래시가 동결되기 전에 다진 시술 중에 조직 온난화가 발생할 가능성이 있다. 따라서, 다진 조직에 대한 데이터는 신뢰할 수없는 것으로 간주되었다.
비교하여, 고질 데이터는 장기간 저장후에도 냉동 큐브 조직에서 얻어졌다. 수확된 조직을 차갑고 촉촉하게 유지하고 신속하게 작업하여 샘플을 동결하는 것이 중요합니다. 또한, 냉동 큐브 조직은 균질화 단계 직전에 해동되어야 한다.
냉동 조직 샘플은 예를 들어, 산화 손상 또는 교차 연결을 검출하기 위해 혜성 분석의 수정, 유전자 발현의 변화의 평가를 포함한 다른 다운스트림 응용 분야에 적합합니다. 메스 블레이드를 취급하여 조직을 자르거나 긁어내고 동결 과정에서 액체 질소를 취급할 때주의해야 합니다.
