미세 바늘 포부 세포학은 우리가 살아있는 마우스에 있는 기관에 있는 만져볼 수 있는 병변에서 trypanosomes를 수집하는 데 사용하는 저렴하고, 간단하고, 빠르고 최소한의 침습기술입니다. 미세 한 바늘 포부는 비 단말 절차임을 감안할 때, 시간이 지남에 따라 동일한 동물에서 반복 샘플링을 허용합니다. 이 사실 인정이 가축으로 번역될 수 있는 경우에, 이 방법은 수의사가 농장에서 가축에 있는 trypanosomiasis를 진단하는 것을 위해 아주 유용할 것입니다.
얼룩 얼룩 절차를 시연하는 것은 아나 마가리다 산토스, 내 실험실에서 보조 기술자가 될 것입니다. 시작하려면 발가락 핀치 방법으로 마취를 확인하십시오. 다리의 후퇴의 반사가 없을 때, 등쪽 회기에서 마우스를 배치합니다.
조심스럽게 고환을 만지작하여 오버리 스킨의 크기와 거리를 결정한 다음 검지와 가운데 손가락 사이 또는 검지 손가락과 엄지 손가락 사이에서 억제합니다. 대상을 더 고정하려면 오버리 스킨을 단단히 펴고 알코올 물티슈로 표면을 청소하십시오. 다음으로, 플런저가 나머지 상태에 있는지 확인하기 위해 5 밀리리터 주사기에 연결된 23 게이지 바늘의 바늘 끝을 대상에 삽입합니다.
흡입을 적용하려면 주사기 플런저를 3~4밀리미터 마크2~3번 으로 철회합니다. 대표적인 견본을 얻고 고부도 같이 더 작은 구조물을 표적으로 하는 확률을 증가시키기 위하여는, 직선또는 몇몇 다른 접선을 따라 기관 내의 바늘을 리디렉션합니다. 흡입을 해제한 다음 바늘을 철회합니다.
바늘은 플런저를 놓아 서 부정적인 압력이 방출 된 후에만 제거 할 수 있습니다. 그렇지 않으면, 흡인은 주사기에 빨려 들어가고 복구 할 수 없습니다. 펑크 부위에 멸균 거즈 스폰지로 압력을 가하여 출혈을 제어합니다.
주사기를 바늘에서 분리하고 공기로 채웁니다. 바늘을 다시 연결하고, 바늘 끝을 슬라이드에 매우 가깝게 또는 심지어 배치하고 바늘의 내용을 슬라이드에 부드럽게 배출합니다. 샘플링을 복제하려면 장기와 동물당 적어도 하나의 추가 포부를 수행하십시오.
식염수에 킬로그램 Atipamezole 당 1 밀리그램의 200 마이크로 리터의 피하 주입으로 마취를 되돌린 후, 회복을 위해 동물을 홈 케이지로 돌려놓습니다. 지배적인 손을 사용하여 엄지 손가락과 검지 손가락 사이에 서리가 내린 끝을 꼬집는 흡인방울이있는 슬라이드를 선택합니다. 지배적 인 손을 사용하여 깨끗한 스프레더 슬라이드를 집어 들고 낙하 의 상단에있는 두 번째 슬라이드를 가로 질러 약 30도 의 각도로 매끄러운 깨끗한 가장자리를 놓습니다.
박막을 얻으려면 슬라이드를 한 개의 가벼운 연속적이고 꾸준한 움직임으로 앞으로 미끄러지게 합니다. 슬라이드를 쉬고 재료의 완전하고 빠른 공기 건조를 허용합니다. 슬라이드의 서리가 내린 가장자리에 연필로 라벨을 붙입니다.
Giemsa 염색 프로토콜의 경우 슬라이드를 100% 메탄올이 들어 있는 코플린 항아리에 5분 동안 침지하여 공기 건조 얼룩을 수정합니다. 그런 다음 슬라이드를 20% Giemsa 용액과 증류수를 30분 동안 포함하는 코플린 항아리로 옮긴다. 슬라이드를 수돗물에 헹구고 티슈 페이퍼로 두드려 철저히 건조시다.
슬라이드를 수평으로 유지하면서 몇 방울의 비수성 장착 매체를 도그에 바릅니다. 커버 글래스 가장자리를 슬라이드에 놓고 낮추고 부드럽게 눌러 기포를 제거합니다. 면역 세포 화학의 경우 실온에서 100 % 메탄올에 공기 건조 얼룩을 10 분 동안 수정하십시오.
코플린 항아리에서 슬라이드를 5분 간 세척하여 1X PBS로 매번 신선한 1X PBS를 사용하여 이 단계를 세 번 반복합니다. 코플린 항아리에서 슬라이드를 제거 한 후, 얼룩을 만지지 않고 여분의 버퍼를 닦아 발수 펜으로 얼룩 주위에 선을 그립니다. 슬라이드를 수평으로 유지하면서 희석 된 1 차 항체 용액 150 마이크로 리터를 각 얼룩에 적용하고 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.
인큐베이션 후, 코플린 항아리에서 5분 동안 슬라이드를 세척하고 1X PBS를 사용하여 매번 신선한 1X PBS를 사용하여 이 단계를 세 번 반복합니다. 슬라이드를 수평으로 유지하면서, 시판되는 말 무 과록시다제 DAB 시각화 시스템의 150 마이크로리터를 각 얼룩에 적용한 다음 실온에서 30분 동안 배양합니다. PBS에서 5분 동안 슬라이드를 다시 세 번 씻으십시오.
그런 다음 10 초 동안 해리스 헤마톡슬린이 들어있는 코플린 항아리에 슬라이드를 침지하여 카운터 스테인하십시오. 수돗물로 헹구고 종이로 두드려 철저히 건조시다. 슬라이드를 수평으로 유지하면서 몇 방울의 비수성 장착 매체를 도그에 바릅니다.
커버 글래스 가장자리를 슬라이드에 놓고 낮추고 부드럽게 눌러 기포를 제거합니다. 좋은 품질의 얼룩은 좋은 밀도와 서로 사이의 기원과 상대적 비율의 조직의 식별을 허용 보존 형태학적 특징을 가진 세포의 단층이 특징입니다. 더욱이, 기생충은 효율적으로 면역 염색, 식별 가능하고 계산가능했다.
불쌍하거나 부정적인 미세 한 바늘 포부 결과 너무 작은 물질 때문에 질량 또는 장기의 대표 하에 있을 수 있습니다. 또한 단일 슬라이드에 너무 많은 재료로 인해 지나치게 두꺼운 얼룩을 만들고 세포 학적 평가를 손상시킬 수 있습니다. 소위 분쇄 된 유물은 많은 벌거 벗은 핵과 DNA 줄무늬의 결과로 중단 된 세포에 얼룩을 떠날 때 너무 많은 힘이 적용되기 때문에 발생합니다.
얼룩 준비 중에 충분한 힘이 적용되지 않으면 세포가 분해되지 않아 세포의 형태학적 특징에 대한 평가를 방해하는 계층화된 층이 발생합니다. 조직 병리학과 미세 바늘 포부 세포 병리학의 비교, 세포 병리학은 더 나은 보존 된 세포 형태와 상대적 비율과 세포의 계산의 더 나은 평가의 장점을 가졌다. 면역 세포 화학은 면역 히스토케화학보다 더 간단하고 빠르며 최적화하기 쉽습니다.
미세 한 바늘 포부, 항상 동물의 좋은 고정을 보장, 흡습 될 장기 또는 질량의 안정화, 조정 진공 응용 프로그램 및 방출. 그런 다음 고품질 얼룩의 경우, 물질이 유리에 배치 된 후 즉시 확산하고 세포 분쇄 된 유물을 피하기 위해 얼룩을 만들기 위해 적용 된 강도에 부드럽게하십시오. 일상적인 현미경 검사법과 면역 세포 화학 이외에, 이 물질은 또한 전자 현미경 검사법, 생화학 분석, 유동 세포측정법, 분자 생물학, 또는 체외 분석법에 사용될 수 있습니다.
이 기술은 우리가 실험적인 동물에 있는 질병을 진단하고 공부하는 것을 잘 바늘 포부가 이용될 수 있다는 것을 보여주기 위하여 저희를 허용했습니다. 우리는 외부 남성 생식 기관에 Trypanosoma 기생충의 tropism을 진단하고 또한 감염의 과정을 통해이 질병을 특성화 할 수 있었다.
