우리는 자연 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC) 및 금융 지원 캐나다 암 협회 감사드립니다. SCCS 감사 NSERC과 VNL 감사 대학원 장학금에 대한 온타리오 대학원 장학금 (OGS) 프로그램. ARW는 캐나다 연구 의자에 대한 CRC 감사드립니다.

1 부 : 장치 제작 <ol><li> 피라 냐가 솔루션의 클린 유리 기판 (3시 1분 CONC 황산 :. 30 % 과산화수소). 자주 교반 10 분 피라 냐가 솔루션의 기판을 둡니다. </li><li> deionized (DI) 물에 rinsing와 N 2 가스로 기판을 건조 후, 크롬 증착 (250 nm의 두께)에 대한 전자빔 챔버 내부에 기판을 배치. </li><li> 크롬 코팅 기판 탈수, 115에서 5 분 뜨거운 접시에 빵을 다음 이소프로판올에 씻어 ° C. </li><li> 스핀 코팅 (30 S, 3000 RPM)에 의해 헥사메틸디실아젠 (HMDS)와 기판 및 주요 건조. 시플리 S1811 포토 레지스트로 다시 스핀 - 코팅 (동일한 매개 변수를 사용하여). </li><li> 사전 베이킹 핫 플레이트 (100 ° C, 2 분)에 기판, 다음 패턴 photomask를 통해 5 S에 대한 자외선 (UV) 방사선에 노출에 의해 포토 레지스트. </li><li> DI 워터에서 3 분 및 세척을위한 시플리 MF 321 개발자의 UV - 노출된 기판을 개발. 100 뜨거운 접시에 포스트 - 베이크 1 분 ° C. </li><li> 30 S.에 대한 크롬 에칭에 immersing에 의해 에칭 노출 크롬 남아있는 포토 레지스트를 제거하는 10 분 AZ300T 스트리퍼에서 다음 젖어, 디 물에 헹굼. DI 물에 씻어 N 2 가스로 건조. </li><li> 크롬을 패턴 기판 베어링에 보증금 2-5 μm의 화학 기상하여 Parylene - C (단열 고분자) 증착. 보증금 60 S. 2000 RPM에서 스핀 코팅 솔루션 (1 % Fluorinert에 WT / WT FC - 40)에 의해 테플론 - AF 50 NM (표면 소수성를 만들기 위해) 핫 플레이트 (160 ° C, 10 분)에 게시 - 베이크. </li><li> 상단 플레이트 형태로, 코트 위에서 취소 패턴 인듐 주석 산화물 (ITO) 유리 기판 50 nm의 테플론 - AF. </li><li> 핫 플레이트 (160 ° C, 10 분)에 두 기판을 게시 - 베이크. </li></ol> 2 부 : 장치 설정 및 자동화 <ol><li> &quot;두 판&quot;구성 운영 디지털 microfluidic 장치에 1 방울은 바닥 기판 (패턴 전극) 및 최고의 기판 (일반적으로 ITO에서 형성 일 연속, 투명 전극과) 사이에 위치하고 있습니다. </li><li> 장치를 설정하려면, 때론 부드러운 근근이 살아가고하여 하단 기판의 접촉 패드에서 폴리머 코팅을 제거합니다. 커플 40 핀 커넥터 (그림 1A)와 하단의 기판의 패드를 찾아냈다. </li><li> 전원에 LabView (내쇼날 인 스트 루먼트, 오스틴, TX), 가정 내장된 컨트롤 박스 (내쇼날 인스 트루먼 트의 DaqPad의 신호에 의해 제어되는 고전압 릴레이의 배열을 갖춘), 함수 발생기 및 증폭기를 실행하는 컴퓨터 . 컴퓨터 / 제어 박스 100 V RMS / 40 핀 커넥터를 통해 장치를 18 kHz에서 신호의 애플 리케이션을 통해 사용자 정의 컨트롤을 용이하게합니다. </li><li> 하단 기판의 가장자리에 위치 양면 테이프 두 조각 (140 μm의 총 두께)에 의해 장치를 조립하고 unpatterned ITO 슬라이드 (상단 플레이트)로 작성해야합니다. </li><li> 제어 시스템을 초기화하려면, 피드백 제어를 보정하기 위해 LabView 보정 프로그램 (자체 작성)를 실행합니다. </li><li> 해당 저수지 (아래 3 항 참조)에 샘플 및 시약을로드하고 상단 기판 (테플론 코팅 면이 아래로 향하게)으로 그들을 묶으십시오. 상단 기판에 접지 커넥터를 연결합니다. </li><li> LabView에서 작동 코드 (자체 작성)로드 및 비말의 작동을 시작하려면 프로그램을 실행합니다. </li></ol> 3 부 : 샘플 및 시약 준비 <ol><li> 100 MM TrisHCl (산도 7.8)와 0.08 %의 Pluronic F127 w / V. : 작업 버퍼 (WB)를 준비 </li><li> 같은 그림 1B에 표시된 WB와 피펫 예제에서 장치에 저수지 1 (R - 1)로 분석하는 단백질 (S), 디졸브. </li><li> R - 2로 침전제, 20 % Trichloroacetic 디 물 속에 산성 (TCA)와 피펫을 준비합니다. </li><li> 버퍼를 씻어 준비, 30분의 70 클로로포름 / acetonitrile (ACN)와 피펫 R - 4로. </li><li> R - 5로 resolubilizing 버퍼, 100 MM의 탄산수 소 암모늄 (산도 8.0)와 0.08 % Pluronic F127 W / V 및 피펫를 준비합니다. </li><li> R - 6에 WB와 피펫 10 MM에 reductant, 트리스 (2 - carboxyethyl) phosphine (TCEP)를 디졸브. </li><li> R - 7으로 WB와 피펫 12 MM에 alkylating 에이전트 iodoacetamide (IAM)를 디졸브. </li><li> R - 8로 전체 단백질 샘플의 농도 (위, 3.1 참조) 피펫의 to1 / 5와 같은 농도에서 WB에 트립신을 디졸브. </li></ol> 4 부 : 디지털 Microfluidic 샘플 처리 <ol><li> 다음 절차는 자체로 작성된 LabView 코드에 의해 자동으로 구현됩니다. 저수지에서 적절 방울의 볼륨은 전극 (이 경우, 적절 방울이 ~ 600nL 있습니다)의 크기에 의해 정의됩니다. </li><li> R - 1 단백질 함유 시료의 비말과 R - 2 (그림 2, 프레임 1)에서 침전제의 비말을 분배. 두 방울을 병합하여 통합 비말은 PR의 강수량 그 결과, 5 분 품어 수표면에 oteins (그림 2, 프레임 2-3). 폐기물 저수지, R - 3 (그림 2, 프레임 4) 떨어진 시켰던 단백질에서 뜨는을 행동시키다. </li><li> R - 4에서 세척 버퍼 세 방울을 분배하고 폐기물 저수지, R - 3 (그림 2, 프레임 5)에 시켰던 단백질에 걸쳐 몰아라. </li><li> 침전물은 건조하도록 허용하고, 단백질에 R - 5 resolubilizing 버퍼의 비말을 분배. 침전물은 (그림 2, 프레임 6) 해산 때까지 버퍼 20 분 부화 수 있습니다. </li><li> R - 6에서 reductant의 비말을 분배하고 샘플 비말로 병합합니다. 원형 패턴 6 전극에 걸쳐 그것을 작동하여 결합 비말을 섞는다. 비말은 humidified 챔버 (그림 3, 프레임 1-2)에 실온에서 1 H에 대한 부화 수 있습니다. </li><li> R - 7에서 에이전트를 alkylating의 비말을 분배하고 (4.5)를 혼합하여 다음 예제 비말, 그것을 병합합니다. 비말은 빛으로부터 보호 humidified 챔버에 상온에서 15 분, (그림 3, 프레임 2-3)에 대한 부화 수 있습니다. </li><li> R - 8 트립신의 비말을 분배하고, (4.5)를 혼합하여 다음 예제 비말, 그것을 병합합니다. 비말, 37 3 H에 대한 부화 ° C를 철판에 humidified 챔버 (그림 3, 프레임 3-4)에서 수 있습니다. </li></ol> 제 5 부 : 후처리 샘플 준비 <ol><li> 물에 2.5 % trifluoroacetic 산성의 0.6 ML를 추가하여 최고 기판과 담금질의 소화 반응을 제거합니다. </li><li> 제조 업체의 지침에 따라 C18 ZipTips을 (Millipore, 빌레 리카, MA)를 사용하여 침묵 반응 생성물을 정화. </li><li> 100 ML의 최종 볼륨 디 물 샘플을 정화 희석. </li></ol> 6 부 : 질량 분광법 <ol><li> 탠덤 질량 분석기로 성관계를 나노 HPLC에 처리 샘플을 평가합니다. HPLC 시스템은 Eksigent 테크놀로지이며 트랩 칼럼 (3mm의 디아. C18 비즈, 150 μm의 ID를 X 2.5 cm)와 반전 상 분리 칼럼 (3 μm의 디아 갖춘 여기서 사용됩니다. C18 비즈, 75 μm의 ID x는 15cm). 여기에 사용되는 질량 분석기는 써모 피셔 사이 언티픽 -에서 LTQ입니다. </li><li> 물에 5 % acetonitrile로 구성된 모바일 단계에 5μL/min에서 트랩 칼럼에 2 μL 샘플을로드합니다. 20 % acetonitrile에서 25 분 이상 80 % acetonitrile에 선형 그라데이션을 사용하여 0.5μL/min에 반대 위상 칼럼에서 샘플을 분리. 또 다른 10 분에 대해 80 % acetonitrile에서 실행을 계속합니다. </li><li> 탠덤 질량 분광법에 의한 열의를 eluting 밴드를 분석합니다. 작품 여기보고에서, eluent는 NewObjective에서 nanoelectrospray 방출기 (10 μm의 ID와 테이퍼 20 μm의 아이디)를 통해 질량 분석계로 샘플링됩니다. </li><li> SEQUEST 같은 데이터베이스 검색 프로그램을 사용하여 샘​​플에서 단백질을 식별합니다. 이 작품에서는, 우리는 Bioworks v3.01 (온습 피셔 사이 언티픽)에 통합 SEQUEST의 버전을 사용하고, 확인된 단백질은 1.0E - 03 미만의 확률 점수 (99.9 % 신뢰 구간에 해당) 및시의 시퀀스 coverages 있었 최소 30 % (그림 4). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1a.jpg" align="Figure 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1b.jpg" align="Figure 1b" /> 그림 1. (A) 사진 자동 비말의 작동을위한 40 핀 커넥터에 DMF 장치를 성관계를합니다. (B) 장치의 개략도는 샘플과 proteomic 검사 결과에 필요한 시약의 위치를​​ 묘사. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig2.jpg" align="Figure 2" /> 영화에서 그림 2. 프레임은 20 % TCA (침전제)와 30분의 70 %의 클로로포름 / acetonitrile (솔루션 린스)의 자동 추출 및 BSA의 정화를 묘사. 프레임 6, 시켰던 단백질 100 MM의 탄산수 소 암모늄의 비말에 redissolved 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig3.jpg" align="Figure 3" /> 그림 3. 순차 감소, 알킬화 및 resolubilized 단백질의 비말의 소화를 설명하는 동영상에서 프레임. 이 그림에서는 시약은 지혜로움에 대해 염료와 색, 연습, 시약은 색 없습니다. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig4.jpg" align="Figure 4" /> 디지털 microfluidics 처리 소 혈청 알부민의 샘플 그림 4. MS의 크로마토 그램. 25 서로 다른 펩티드는 44%의 시퀀스 범위를 해당 (99.9 % 신뢰 구간) 확인되었습니다.

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	<li>Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Digital+Revolution:+A+New+Paradigm+for+Microfluidics.">The Digital Revolution: A New Paradigm for Microfluidics.</a> Adv. Mat. 21, 920-925 (2009).</li><li>Jebrail, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Method+for+Protein+Extraction+by+Precipitation.">A Digital Microfluidic Method for Protein Extraction by Precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li><li>Luk, V. N., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Approach+to+Proteomic+Sample+Processing.">A Digital Microfluidic Approach to Proteomic Sample Processing.</a> Anal. Chem. 81, 4524-4530 (2009).</li></ol>

proteomics의 표준 시료 처리 및 가공의 부족은 필드에 대한 중요한 제한 사항입니다. 또한, 기존의 macroscale 샘플 처리 손실 및 오염을 샘플로 이어질 수있는 여러 컨테이너 및 솔루션 전송을 포함합니다. 이러한 문제에 대한 잠재적인 해결책은 디지털 microfluidics 1 (DMF)에 의존 샘플 처리를위한 통합 시스템을 형성하는 것입니다. 이전 작품에서는, DMF는 이기종의 불필요한 오염 물질의 효율적?...

digital microfluidics for automated proteomic processing

임상 proteomics는 질병의 조기 진단과 예후에 대해 도움이 될 생체의 발견 약속, 중요한 새로운 분야로 떠오르고있다. 임상 proteomic 방법이 다양하지만, 일반적인 특성은 매우 이질적인 유체 (즉, 혈청, 전혈 등) 사전 분석 (2) 광범위한 생화학 처리 단백질의 추출 (I)가 필요합니다. 여기, 우리는 임상 proteomics에 사용되는 몇 가지 처리 단계를 통합하는 새로운 디지털 microfluidics (DMF) 기반의 방법을보고합니다. 이것은 단백질 추출, resolubilization, 감소, 알킬화 및 효소 소화가 포함되어 있습니다. 디지털 microfluidics은 nanoliter - microliter 크기 방울이 열려있는 표면에 조작하는 microscale 유체 처리 기술입니다. 방울이 유전체 층으로 코팅 아르 전극의 배열의 상단에 위치 - 전기 가능성이 비말에 적용하면 요금이 유전체의 양쪽에 축적. 요금은 비말의 위치를​​ 제어하는​​ 데 사용할 수있는 정전기 손잡이 역할을하고, 일련의 전극의 순서를 바이어스에 의해 방울은 분배 이동, 병합, 혼합, 그리고 표면에 분할 할 수 있습니다. 따라서, DMF는 빠르게, 순차, 다단계, 소형 자동 생화학 assays를 운반하는데 자연 적합합니다. 이것은 종래의 방법 (수동 또는 로봇 pipetting에 의존)을 통해 상당한 발전을 대표하고, 임상 proteomics에 유용한 새로운 도구가 될 수있는 잠재력이있다. 메 J. Jebrail, 비비안 N. 룩, 그리고 스티브 CC Shih이 작품에 동등하게 공헌했습니다. 세르지오 LS 프레이리의 현재 주소는 600 사우스 43 번가, 필라델피아, PA 19104에 위치한 사이언스 대학에 있습니다.

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Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

전기 분야의 응용 프로그램에 의해 전극의 배열에 - 디지털 Microfluidics는 개별 방울 (ML ~ NL)의 조작에 의해 특징 기법입니다. 그것은 빠른 속도, 순차, 소형 자동 생화학 assays을 수행에 적합합니다. 여기서 우리는 몇 가지 proteomic 처리 단계를 자동화 할 수있는 플랫폼을보고합니다.

자동 Proteomic 처리를위한 디지털 Microfluidics

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

digital-microfluidics-for-automated-proteomic-processing

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K 조회수.  University of Toronto. 전기 분야의 응용 프로그램에 의해 전극의 배열에 - 디지털 Microfluidics는 개별 방울 (ML ~ NL)의 조작에 의해 특징 기법입니다. 그것은 빠른 속도, 순차, 소형 자동 생화학 assays을 수행에 적합합니다. 여기서 우리는 몇 가지 proteomic 처리 단계를 자동화 할 수있는 플랫폼을보고합니다.

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Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

마이크로 스케일 영양소 레이어에 해양 미생물의 Chemotactic 응답

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

연구

생물학

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Microfluidics를 사용하여 세균 Chemotaxis의 연구 - 인터뷰

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

전기 생리학에 Microfluidics 적용

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Microfluidics를 사용하여 새로운 치료 응용 프로그램 개발

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

단백질의 전기 영동 분리

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Immunoblot Analysis

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. It involves the solubilization and electrophoretic separation of proteins, glycoproteins, or lipopolysaccharides by gel electrophoresis, followed by quantitative transfer and irreversible binding to nitrocellulose, PVDF, or nylon. The immunoblotting technique has been useful in identifying specific antigens recognized by polyclonal or monoclonal antibodies and is highly sensitive (1 ng of antigen can be detected). This unit provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. This video provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblot 분석

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

젤의 단백질 염색법

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

에서 독소 유도와 단백질 추출 Fusarium 종.</emProteomic 연구> 문화

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Proteomic 분석을위한 마우스 유리체 및 망막의 내장 적출

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...