이 프로토콜은 기술의 조합을 통해 세포외 소포, EV를 농축하는 동시에 EV에서 비온을 분리할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 방법은 여러 다운스트림 분석 및 바이러스 없는 EV 준비의 특성화를 위해 현재 의 금 표준보다 EV 복구를 극대화합니다. 이 프로토콜은 EV 및 바이러스 감염연구에 이상적입니다.
이 방법은 HTLV, 에볼라, Zika 등과 같은 다른 바이러스 시스템에 적응할 수 있습니다. 나는이 방법의 처음 사용자가 나노 입자 준비와 투쟁 할 것으로 예상, 그래서 우리는 신중하게 우리의 사양을 따르는 것이 좋습니다. 시스템에 따라 일부 최적화가 필요할 수 있습니다.
이 방법의 시각적 데모는 프로토콜의 전체 작업 흐름과 뉘앙스를 설명하는 데 중요하며, 이는 처음 사용자의 시간과 실수를 줄입니다. 감염되었거나 감염된 세포에서 배양 상체를 준비하는 것으로 시작합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 5일간 늦은 로그 셀의 약 10밀리리터를 배양하여 모든 중간 시약이 세포외 소포가 없는지 확인합니다.
배양이 준비되면, 5 분 동안 3, 000 배 G에서 원심 분리에 의해 세포를 펠렛과 펠릿을 폐기. 멸균 0.22 마이크로미터 필터로 상체를 걸러내고 깨끗한 튜브에서 여과물을 수집합니다. PEG 강수량 시약의 동일한 볼륨을 여과에 추가하고 튜브를 여러 번 반전하여 혼합합니다.
하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 혼합물을 배양합니다. 인큐베이션 후, 30분 동안 1500배 G로 혼합물을 원심분리하여 이질적인 세포외 소포 또는 EV, 펠릿을 산출한다. 상체를 버리고 칼슘과 마그네슘없이 1X PBS의 150 ~ 300 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.
밀도 그라데이션을 준비하는 동안 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오. 원고에 설명된 대로 6~18%의 iodixanol에 이르는 11밀도 분획으로 iodixanol 밀도 그라데이션 배지를 준비한다. 각 튜브를 소용돌이에 섞고 밀도 분획을 깨끗하고 건조한 스윙 버킷 울트라 센트리후지 튜브에 레이어드합니다.
다시 중단된 EV 펠릿을 10, 000회 G, 섭씨 4도에서 10, 000회, 섭씨 4도의 층이 있는 그라데이션 의 상단에 90분간 추가합니다. 각 분획을 초원심분리기 튜브에서 새로운 미세원심분리기 튜브로 조심스럽게 이송합니다. NT80, NT82 및 1X-PBS의 동일한 볼륨을 혼합하여 EV 분수 농축을 위해 나노 입자의 30 %의 슬러리를 준비합니다.
균일성을 보장하기 위해 나노 입자 혼합물을 소용돌이. 슬러리의 마이크로리터 30개를 각 밀도 분획에 넣고 튜브를 피펫팅하거나 반전시켜 섞는다. 가장 중요한 단계는 밀도 그라데이션 분리에 따라 EV를 농축하기 위해 나노 아티클을 첨가하는 것입니다.
이없이, EV 복구는 가난하다. 밤새 밀도 분획을 포함하는 나노 입자를 섭씨 4도에서 회전합니다. 그런 다음 실온에서 5 분 동안 20, 000 배 G에서 밀도 분획을 원심 분리합니다.
액체를 버리고 1X-PBS로 EV 펠릿을 두 번 세척하십시오. RNA 절연을 위한 펠릿을 준비하기 위하여는, 원고 지시에 따라, 학문, deionized 물, 여과 및 depsy로 취급의 50 마이크로리터를 다시 중단합니다. RNA는 상업적인 키트를 사용하여 격리될 수 있습니다.
젤 전기 전구로 분석을 위해 Laemmli 버퍼의 15 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 샘플을 섭씨 95도로 3분간 가열합니다. 가열 단계를 두 번 더 반복하여 부드럽게 소용돌이를 가하고 열 주기 사이에 샘플을 아래로 회전시합니다.
원심 분리는 20, 000배 G에서 15초 동안 샘플을 원심분리하고, 상신을 젤에 직접 적재합니다. 최상의 결과를 위해, 젤에 적재된 입자의 양을 제한하고, 100볼트로 실행하여 적재된 나노입자가 젤에 유입되는 것을 방지합니다. PEG 강수량은 기존의 초원심분리보다 훨씬 더 효율적인 EV 복구를 가능하게 합니다.
10 밀리리터의 배양을 사용할 때, 이 접근 방식은 초원심분리기보다 약 500배 더 높은 수율을 초래합니다. 이 접근법은 또한 엑소좀의 증가된 격리 효율을 초래하며, 이는 더 높은 수준의 엑소솜 마커 단백질을 통해 분명하게 드러납니다. 서부 PLA 분석에 따르면 CD81이 3000배 증가, CD63의 4배 증가, CD9의 40배 증가.
또한, 이 프로토콜은 EV의 변기를 격리하여 HIV1 감염에서 EV 매개 메커니즘의 다운스트림 연구를 허용합니다. 서부 PLA 분석에 따르면 EV는 3개의 분수 집단에서 발견됩니다. 바이러스는 그(것)들의 단지 2에서 존재하는 동안.
EV의 위반 10.8에서 12까지바이러스 오염이 없습니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 나노 입자가 최적의 EV 농축에 중요하다는 것입니다. 그들의 추가는 필수입니다.
플레이트 계 세포 분석에서 질량 분석법에 의한 서양 블롯, PCR, 순수 디오메치 분석과 같은 많은 하류 분석이 수행될 수 있다. 이러한 특성화를 허용, 기계론적, 및/또는 기능 적 연구. 이 기술을 사용하면 바이러스 성 배경을 오염하지 않고 EV 화물 및 기능을 검사하는 특정 연구를 할 수 있습니다.
이것은 잠재적인 치료의 병기 및 발달에 있는 EV의 공부를 위한 기초를 제공합니다. 이 기술의 한계를 극복하고 EV 준비 및 격리를 대량으로 적용하려면 접선 흐름 여과와 같은 고급 시스템의 사용을 권장합니다. 가장 위험한 계측기는 밀도 그라데이션 분리 중에 초원심분리기입니다.
모든 원심분리기 튜브가 불균형과 잠재적 로터 실패를 피하기 위해 동일한 가중치를 두는지 확인하십시오.
