이 프로토콜은 다양한 규모, 트레이드 오프, 방법론 간의 차이점 및 현장 샘플 작업에 대한 고려 사항에서 문화에서 소포를 정화하기위한 접근법을 보여 줄뿐만 아니라 중요합니다. 시아노박테리아는 독특한 소포 샘플링 및 분석 과제를 제시합니다. 이러한 기술은 배양 및 환경 샘플에서 소포를 성공적으로 분리하고 농축했습니다.
500 밀리리터 미만의 샘플을 농축하려면 유형 1 초순수 등급의 물로 15 ~ 20 밀리리터 한외여과 원심 농축기를 헹구는 것으로 시작하십시오. 원심 분리기에 농축기를 넣고 섭씨 4도에서 4, 400 x g에서 회전하십시오. 실행을 취소하고 단계를 두 번 이상 반복합니다.
상청액 샘플을 헹군 농축기에 넣고 동일한 조건에서 스핀하십시오. 샘플이 15 ~ 30 밀리리터의 최종 부피로 농축 될 때까지이 단계를 반복하십시오. 500 밀리리터 이상의 부피를 농축하려면 원고에 설명 된대로 장치를 설정하여 접선 유동 여과를 수행하십시오.
연동 펌프를 흡입 라인에 부착하고 고정 라인에 조정 가능한 클램프를 놓습니다. 원고에 설명 된대로 접선 유동 여과를 살균 한 다음 Type 1 초순수 등급 물 1 리터로 장치를 플러시하십시오. 0.2 미크론 미만의 여액을 샘플 저장소에 첨가하십시오.
유지 라인의 펌프 속도와 배압 수준을 천천히 증가시켜 여과 라인의 출력을 증가시킵니다. 접선 유동 여과를 계속 실행하고 물질이 제거됨에 따라 배양 상청액으로 저장소를 다시 채운다. 저장고의 부피가 기포를 도입하지 않고 흡기 라인으로의 흐름을 유지하는 데 필요한 가능한 가장 낮은 양에 도달하면 시료 농축을 중단하십시오.
클램프로 유출 라인을 닫습니다. 고정 라인의 배압을 제거하십시오. 농축된 상등액을 필터를 통해 10분 동안 재순환시켜 재순환 속도를 분당 20밀리리터에서 40밀리리터로 줄여 회수율을 극대화한다.
잔류 라인을 깨끗한 용기로 옮기고 샘플에서 흡입 라인을 제거하고 농축 된 재료를 수집하십시오. 피펫을 사용하여 샘플 저장소에 남아 있는 물질을 회수합니다. 농축된 상청액을 0.2 마이크론 시린지 필터를 통해 여과한다.
필요한 경우, 최종 농축액을 섭씨 네 도에서 약 삼 주 동안 보관한 후 소포 정제로 옮깁니다. 농축된 배양 샘플을 펠릿화하기 위해 이를 깨끗한 초원심분리 튜브에 넣고 깨끗한 배지 또는 버퍼를 첨가하여 튜브가 채워지도록 합니다. 원심분리 후, 피펫으로 상층액을 제거한다.
펠릿화된 물질을 신선한 배양 배지 또는 세척 완충액, 예컨대 1X 포스페이트 완충 식염수로 재세척하고 원심분리를 반복한다. 최종 펠렛을 한 밀리리터 피펫으로 부드럽게 피펫팅하여 신선한 배양물에 재현탁시키고 깨끗한 용기로 옮깁니다. 밀도 구배 초원심분리를 수행하려면 원고에 설명 된대로 iodixanol 스톡을 준비하십시오.
4X 버퍼의 한 부분을 60 % iodixanol 스톡의 세 부분과 혼합하여 45 % iodixanol 용액을 만듭니다. 45% 요오딕사놀을 1X 완충액으로 희석하여 40, 35, 30, 25, 20, 15 및 10% 최종 요오드딕사놀 농도의 구배 배지를 만듭니다. 그런 다음 동일한 양의 모든 요오드딕사놀 구배 스톡을 초원심분리 튜브에 조심스럽게 오버레이하여 전체 튜브 부피를 활용합니다.
원심분리 후, 조심스럽게 피펫팅하거나 분획 수집기를 사용하여 대략 4.5 밀리리터 구배에 대해 각각 0.5 밀리리터의 분획을 수집한다. 분석 저울과 보정 된 피펫을 사용하여 밀리리터 당 그램 단위로 각 분획의 밀도를 결정하십시오. 튜브에서 샘플을 제거하고 무게를 결정하고 샘플을 튜브로 되돌립니다.
개별 분획을 새 튜브에 깨끗한 버퍼로 희석 한 다음 깨끗한 배지 또는 버퍼 세척하십시오. 조심스럽게 다섯 마이크로 리터의 소포를 바르고 다섯 분 동안 그대로 두십시오. 그리드의 가장자리를 깨끗한 여과지 조각에 터치하여 샘플을 제거합니다.
20 ~ 50 마이크로 리터의 2 % 우라닐 아세테이트를 플라스틱 필름으로 덮인 평평한 표면에 피펫을 꺼냅니다. 그런 다음 두 분 동안 그 위에 떠있는 그리드를 놓습니다. 여과지를 사용하여 우라닐 아세테이트를 제거하고 초순수 한 방울에 잠깐 떠서 씻으십시오.
깨끗한 주사기를 사용하여 챔버를 초순수로 채우고 기포가 없는지 확인하십시오. 카메라 시작'을 클릭하고 지문 주변의 챔버의 최적 영역을 시각화합니다. 화면 게인' 및 카메라 레벨의 슬라이더를 최대로 밀고 가장 낮은 레벨로 줄여 가장 어두운 파티클을 확인합니다.
필요에 따라 초점을 조정하여 입자가 시야각에서 거의 동일하게 보이도록 하고 챔버가 깨끗해질 때까지 매우 깨끗한 물로 계속 세척하십시오. 하나의 밀리리터 주사기를 사용하여 챔버에 소포 샘플을 추가하고 획득 설정을 확인하십시오. SOP 드롭 다운 상자에서 표준 측정'을 선택하고 설정을 변경하여 각각 60 초 비디오의 최소 세 번의 기술 복제본을 수집하십시오.
create'를 누르고 스크립트를 실행하고 프롬프트에 따라 약 100 마이크로리터의 샘플을 반복실험 사이의 챔버로 밀어 넣습니다. 분석'을 클릭하고 실험을 열어 입자 매개 변수를 결정하고 샘플 파일을로드하십시오. 선택한 파일 처리'를 선택하고 분석이 완료될 때까지 기다립니다.
시아노박테리움 Synechocystis sp. PCC6803으로부터 세포밖 소포의 분리 및 특성화는 외막에 카로티노이드가 포함되어 있음을 보여주었으며, 이는 초원심분리를 통해 직접 펠릿화하여 수집된 소포 샘플에 특징적인 오렌지색 착색을 부여한다. 재현탁된 베시클 펠릿은 우라닐 아세테이트로 샘플을 음으로 염색하거나 초박형 절편을 관찰하여 투과 전자 현미경으로 검사하였다.
베시클 크기 분포 및 농도는 동적 광산란 및 나노입자 추적 분석을 사용하여 평가하였다. 정제된 시네코시스티스 sp. PCC6803 소포를 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리하고, 리포폴리사카라이드에 대해 염색하였다.
샘플은 농축 된 소포 샘플 전후에 채취하여 접선 유동 여과가 작동하고 소포가 농축되고 있는지 확인해야합니다. 그런 다음 나노 입자 추적 분석을 사용하여 두 샘플을 모두 측정해야합니다. 배양 및 환경 샘플에서 작은 입자의 차별 및 분리를 개선하기 위해 크기-배제 크로마토그래피 또는 비대칭 전계-유동 분별과 같은 다른 접근법과 이 방법을 병합하기 위한 미래의 노력이 요구된다.
이 기술은 시아 노 박테리아 소포와 시아 노 박테리아 생물학에서 이러한 소포의 특정 기능적 역할을 연구하는 데 도움이됩니다.
