이 프로토콜은 재현성이 높은 방식으로 다양한 박테리아로부터 세포외 소포를 분리하는 방법을 제공하기 때문에 중요합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 박테리아 배양의 상당히 큰 환경에서 EV를 분리하는 데 사용할 수 있어 생체 내 연구가 가능하다는 것입니다. 우리가 보여주는 데이터는 전임상 응용 프로그램을 반영하지만, 이 프로토콜은 치료제용 박테리아 EV 제조에 적용될 수 있을 것으로 예상됩니다.
이 방법은 약간의 수정으로 확장 가능한 모든 세포 배양 시스템에 적용할 수 있습니다. 프로토콜 확장성 때문에 박테리아 세포 배양의 원하는 시작 부피를 처리하기 위해 적절한 크기의 필터와 SEC 컬럼을 갖는 것이 중요합니다. 절차를 시연하는 것은 저스틴 라티아 박사 연구실의 보조 기술자 인 새디 존슨, 저스틴 라시아 박사 연구실의 종양학 펠로우 인 디오니시우스 왓슨, 내 연구실의 연구 기술자 인 아킴 산토스입니다.
멸균 루프를 사용하여 대장균의 단일 콜로니를 250-1000 밀리리터의 Luria-Bertani 또는 LB 국물에 접종하여 시작하십시오. 그런 다음 진탕 인큐베이터에서 분당 300회전 및 섭씨 37도의 호기성 배양액을 배양합니다. 배양 48 시간 후, 세포 배양 물을 깨끗한 500 밀리리터 폴리 프로필렌 원심 분리기 병으로 옮겨 섭씨 4도 및 5, 000 배 G에서 대용량 고정각 로터에서 15 분 동안 원심 분리하여 박테리아 배양 배지를 정화합니다.
상층액을 15분 동안 10, 000회 G로 조심스럽게 원심분리기에 부어 세척한 원심분리기 병으로 옮긴다. 다음으로, 상청액을 적절한 크기의 0.2-마이크론 폴리에테르설폰 진공 구동 필터 장치로 옮기고 여과 장치를 진공 벽 공급 장치에 연결합니다. 여과율이 크게 떨어지면 여과되지 않은 재료를 새 장치로 옮기십시오.
여과된 배지는 섭씨 4도에서 밤새 보관하거나 즉시 추가 처리할 수 있습니다. 생존 가능한 세포의 완전한 제거를 확인하기 위해, 여과된 상청액의 분취량을 적합한 한천 플레이트에 퍼뜨리고 박테리아 균주에 대한 최적 조건에서 배양한 후 임의의 콜로니가 없는지 확인한다. 여과된 배지를 100밀리리터의 부피로 농축하기 위해, 여과된 배양 배지 90밀리리터를 100킬로달톤의 분자량 차단을 갖는 원심 한외여과 장치의 저장소에 로딩하고, 스윙 버킷 로터에서 배지를 섭씨 4도에서 원심분리하고 2, 000배 G 상단 저장소의 부피가 0.5밀리리터 미만으로 농축될 때까지 15 내지 30분 간격으로 사용한다.
남아 있는 여과된 배양 배지로 저장소를 채우려면 장치 바닥의 플로우 스루를 제거하여 균형을 재조정합니다. 저장소에서 농축된 배지의 점도가 눈에 띄게 증가하면 배지를 PBS로 희석하고 원심분리로 재농축하여 분자량 컷오프인 100킬로달톤보다 작은 비세포외 소포 또는 EV 단백질을 줄입니다. 그런 다음 농축된 배지를 저단백질 결합 튜브로 옮겨 섭씨 4도에서 밤새 보관합니다. 100밀리리터보다 큰 부피로 여과된 배지를 농축하려면 분자량 컷오프가 100킬로달톤인 적절한 크기의 접선 유동 여과 또는 TFF 장치를 선택합니다.
원고에 설명 된대로 여과 회로를 조립 한 후 200ml의 PBS를 눈금이있는 용기에 펌핑하여 원하는 유량에 해당하는 적절한 속도를 결정합니다. 속도가 설정되면, 여과된 조절 배지를 실온에서 분당 약 200 밀리리터로 순환시키고, 100 킬로달톤보다 작은 분자를 수집하고, 한외여과막을 가로질러 별도의 용기에서 폐기물로서 컨디셔닝 배지의 부피가 100 내지 200 밀리리터로 감소될 때까지. 여과된 부피를 PBS로 2배 순차적으로 희석하고 더 작은 용기에서 펌프로 배지를 계속 순환시켜 부피를 75 내지 100 밀리리터로 농축한 다음 25 밀리리터 및 10 밀리리터로 농축합니다.
시료 저장소에서 공급 튜브를 들어 올리고 펌프를 펌핑하여 필터를 퍼지하여 시료의 최대량을 회수합니다. 농축 된 샘플을 분자량 컷오프가 100 킬로 달톤 인 15 밀리리터 원심 한외 여과 장치로 옮기고 섭씨 4도 및 2, 000 배 G의 스윙 버킷 로터에서 원심 분리기를 상단 저장소의 배지 부피가 2 밀리리터 미만이 될 때까지 15-30 분 간격으로 이동합니다. 농축된 배지를 저단백 결합 튜브로 옮겨 섭씨 4도에서 밤새 보관합니다.
EV의 분리를 위해 100밀리리터 미만의 출발 물질에 대해 10밀리리터 베드 부피의 작은 컬럼과 100밀리리터 이상의 출발 물질에 대해 47밀리리터 베드 부피를 갖는 더 큰 컬럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 수행합니다. 실험 전 몇 시간에 걸쳐 SEC 컬럼과 PBS를 실온으로 가져온 다음 표준 실험실 스탠드 및 홀더를 사용하여 수직 위치에서 컬럼을 안정화합니다. SEC 컬럼에 연결하기 전에 5밀리리터의 PBS가 프릿을 통해 폐기물 용기로 흐르도록 하여 샘플 저장소에 수분을 공급합니다.
그런 다음 컬럼의 입구 캡을 풀어 샘플 저장소에 2밀리리터의 PBS를 추가하고 PBS가 프릿을 통해 떨어지므로 저장소를 컬럼에 조심스럽게 연결합니다. 컬럼의 평형을 위해 샘플 저장소에 47ml의 PBS를 추가한 다음 SEC 컬럼의 하단을 풉니다. 그런 다음 로드된 모든 샘플 버퍼가 컬럼을 통과하도록 하고 플로우 스루를 폐기합니다.
2밀리리터의 시료를 시료 저장소에 넣은 후 시료가 컬럼에 완전히 들어가도록 하고 플로우 스루를 수집합니다. PBS를 시료 부피를 뺀 14.25ml의 부피로 시료 저장소에 즉시 추가하여 용액이 컬럼을 통해 흐를 수 있도록 하고 컬럼 빈 부피와 동일한 양을 폐기합니다. 다음으로, 2밀리리터의 저결합 마이크로튜브를 SEC 컬럼 바로 아래에 위치시켜 2밀리리터의 PBS가 컬럼을 통과하도록 허용한 후 첫 번째 플로우 스루 또는 분획 1을 수집합니다.
샘플 저장소에 2 밀리리터의 PBS를 계속 추가하여 각 후속 분획을 수집합니다. 수집 된 분획을 단기 보관의 경우 섭씨 4도, 장기 보관의 경우 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 수집된 EV 분획의 무균 테스트를 위해 3밀리리터의 배양 배지에 분석에 사용할 100마이크로리터의 분획을 접종합니다.
이어서, 배지를 최적 조건 하에서 배양하면서 적어도 3일 동안 탁도를 관찰하였다. 또는 분획 샘플을 생산 박테리아를 성장시키는 데 사용되는 배지가 포함된 한천 플레이트에 적용한 다음 콜로니 형성을 확인할 수 있습니다. 다음으로, 동결-해동 주기를 피하기 위해 개별 또는 풀링된 분획의 25-50%를 섭씨 영하 80도의 저단백 결합 튜브로 옮겨 EV를 보관하십시오.
대표적인 분석은 초기 크로마토그래피 분획에서 대장균 MP1 EV의 용출을 보여줍니다. 분획 1에서 6까지는 평균 직경이 100나노미터 미만인 가장 많은 EV를 포함했습니다. 동시에, 후속 분획에는 EV가없는 단백질과 매우 적은 EV가 포함되었습니다.
EV 농축 및 크기는 투과 전자 현미경에 의해, 특히 분획 2 내지 6에서 확인되었다. EV가 풍부한 분획 2 내지 7은 높은 나노루시퍼라제 활성을 갖는 것으로 관찰되었지만, 이후 분획에 비해 비 EV-관련 mCherry로부터의 형광 신호는 매우 낮았다. 면역금 표지는 분획 2 내지 5에서 나노루시퍼라아제의 EV 결합을 확인하였다.
다른 박테리아 종에 대한 프로토콜의 적용 가능성은 다양한 혐기성 박테리아의 배양물에서 EV를 분리함으로써 평가되었습니다. 초기 크로마토그래피 분획 1에서 4는 직경 크기가 100나노미터 미만인 EV에 대해 농축된 것으로 관찰되었습니다. 복잡한 뇌-심장 주입 또는 BHI는 총 EV 수율의 25 % 미만으로 EV 크기의 입자를 포함했습니다.
박테리아 세포 배양의 시작 부피를 처리 할 수있는 TFF 장치를 사용하는 것이 중요합니다. 이 기술을 통해 복잡한 동물 모델에서 기능에 대한 생물학적 질문을 할 수있는 충분한 EV를 생성 할 수 있습니다.
