우리는 재정적으로 산화 스트레스에 우리의 연구를 지원하기 위해, 트리 젠 리히텐슈타인, LHW 재단에게 감사의 말씀을 전합니다.

바젤 대학에서 수행 혜성 분석에 관한 연구는, 안과학 교실은 바젤의 지역 윤리위원회에 의해 승인되었다 시약 1. 준비 <ol><li> 둘 베코 인산염 완충 식염수 (PBS) (칼슘 + +, 마그네슘 + + 무료), PBS (1 패 패킷)과 미디어에 DH 2 O의 990 ml에 추가하여 솔루션을 준비합니다. 7.4 pH를 조정합니다. 실온에서 보관하십시오. </li><li> 용균 솔루션을 준비 : 1,000 ml의 DH 2 O에서 2.5 M의 NaCl (146.1 g)을, 100 mM의 EDTA (37.2 g) 및 10 mM의 후, Trizma베이스 (1.2 g)을 추가 준비하려면 </li><li> 1,500 ml의 DH 2 O 10 M의 NaOH 30 ml의 7.5 ml를 0.2M EDTA, QS를 추가하여 전기 영동 버퍼 (300 mM의 수산화 나트륨 / 1 mM의 EDTA)를 준비하고 잘 섞는다. 총 부피는 겔 상자 용량에 의존한다. 앞서&gt; (13)의 pH가되도록 버퍼의 pH를 측정하고, 사용하기. </li><li> 0.4 M 트리스 함유 중화 버퍼 준비 (# 농축 (GM는 48.5 ~ 800 ml의 DH 2 O는, pH를 7.5로 조정하기 위해 첨가)62, DH 2 O 10 M의 HCl) 1,000 ㎖의 실온에서 솔루션을 저장합니다. </li><li> 염색 솔루션을 준비합니다. 에티 디움 브로마이드 (EtBr이, 10 배 주식, 20 μg의 / ㎖)에 실온에서 50 ml의 DH 2 O 및 저장소에 EtBr이 10 mg을 추가합니다. 1X 주식 - 9 ml의 DH 2 O와 함께 1 ml의 혼합 신중한! 이 알려진 발암 물질로 적절한 예방 조치와 EtBr이를 처리합니다. </li></ol> 백혈구 2. 분리 <ol><li> 정맥 천자를 사용하여 헤파린과 같은 항응고제와 인간의 혈액 샘플 (20 ㎖)을 구합니다. </li><li> 이러한 Histopaque 같은 밀도 구배 전지 세퍼레이터를 사용하여 림프구를 분리. <ol><li> 600 μL 세포 분리 액체를 통해 1 PBS 또는 (FBS)없이 RPMI와 비율과 층 : 간단히, 1에 혈액을 희석. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 원심 분리기 1,800 XG. PBS / RPMI의 3-5 ml의에 &#39;버피&#39;코트를 기음과 림프구 펠렛 10 분 동안 300 XG에 원심 분리 하였다. </li><li> (단지 PBS 사이의 경계 위에서 RPMI를 림프구 검색피펫을 이용) 및 세포 분리 액. 플라즈마 및 각 튜브의 액체 전지 세퍼레이터 층과의 계면으로부터 백혈구를 제거하고 대역 한 50 ㎖ 튜브에 수집한다. </li></ol></li><li> 감기 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM)과 50 ㎖에 총 볼륨을 가져와. 10 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 DMEM로 3 회 세척 할 것. </li><li> 혈구 계를 사용하여 세포의 총 수를 카운트. PBS의 세포를 일시 중단하고 10 7 세포 / 튜브의 microcentrifuge 튜브에 aliquote. </li><li> 피펫 5 ㎖ 일회용 플라스틱 튜브에 0.4 ml의 세포. 40 ℃에서 1.2 ml의 1 % 낮은 겔화 온도 아가로 오스를 추가합니다. 믹스 및 신속하고 미리 코팅 된 슬라이드의 아가로 덮인 표면에 세포 현탁액 1.2 ml의 피펫. 거품을 생산하지 마십시오. </li><li> 아가로 오스는 약 2 분 동안 젤을 허용합니다. 겔화에 사용되는 시간과 온도와 일치하고, 그 아가로 오스가 완전히 분해 용액에 침지하기 전에 설정되어 있는지 확인하십시오. 의 완전 후등은 4 ~ ºC에서 솔루션을 용균에 잠수함. </li></ol> 3. 용해 및 전기 영동 참고 : 설명하는 절차는 pH가&gt; (13) 알칼리 조건에서 전기입니다. <ol><li> ~ 4 ºC에서 최소 2 시간 후, 부드럽게 용균 솔루션에서 슬라이드를 제거합니다. 장소는 가능한 한 함께 그들을 가깝게 슬라이딩, 하나의 끝 부분에 수평 젤 상자에 나란히 슬라이드. </li><li> 액체 레벨이 완전히 슬라이드 (아가로 오스를 통해 거품을 피하기) 커버까지 갓 산도&gt; (13) 전기 영동 버퍼와 버퍼 저수지를 입력합니다. </li><li> 20 분은 DNA의 풀림 및 알칼리 불안정한 손상의 표현을 허용하는 슬라이드 알칼리 버퍼에 앉아 보자. </li><li> 25 볼트 (~ 0.75 V / ㎝)에 전원을 켜고 높이거나 버퍼 수준을 낮춤으로써 300 밀리 암페어의 전류를 조정합니다. 30 분간 슬라이드를 Electrophorese. </li><li> 전원을 끄십시오. 조심스럽게 버퍼와 P에서 슬라이드를 올려드레인 트레이에 레이스. 현명한 코트를 중화 버퍼와 슬라이드를 삭제합니다. 슬라이드가 적어도 5 분 동안 앉아 있도록 허용합니다. 슬라이드를 배출하고 두 번 더 반복한다. </li><li> 80 μL 1X 에티 디움 브로마이드 (EtBr이)와 슬라이드를 얼룩 5 분간 방치 한 후 과잉 얼룩을 제거하기 위해 냉각 된 증류수에 담근다. 그런 다음 슬라이드를 통해 커버 슬립을 배치하고 즉시 저장합니다. 스토어는 건조한 상태에서 실온에서 한 달 동안 슬라이드. 주의 : 다른 DNA 얼룩 (예를 들면, SYBR 그린)도 사용될 수있다. 주의! 대부분의 염료가 돌연변이이기 때문에 보호 장갑을 착용하십시오. </li></ol> DNA 나누기 4. 정량 <ol><li> DNA 손상을 시각화하기 위해, 40X 목적 형광 현미경 EtBr이 묻은 DNA 슬라이드를 관찰합니다. </li><li> DNA 이동의 길이와 이주 DNA (도 1A)의 비율을 측정함으로써 세포의 DNA 손상을 정량적으로 평가. Tail- 모멘트와 올리브-mome에 의한 DNA 손상 (그림 1B)를 정량화NT. 꼬리 순간 올리브 -Moment의 정의는 이전에 8-10을 부여하고있다. 참고 : 우리의 경험에서이 매개 변수 중 하나에 의해 충실하기에 충분하다. 세포는 현미경 슬라이드와 사진 세포를 통해 검사 자동화 된 도구를 설정하여 촬영됩니다. DNA 나누기 정량은 이미지 분석 소프트웨어 패키지에 의해 수행 될 수있다. 커스텀 셀의 이미지를 캡처하고 DNA 손상을 정량화 만들어 여러 소프트웨어 패키지가있다. 우리는 실험을하는 동안 같은 소프트웨어 패키지를 사용하는 것이 좋습니다. 실험실 기술자는 그대로 셀 또는 혜성이 컴퓨터에 득점을 식별하고 그 위에 마우스로 클릭합니다. 혜성 또는 그대로 셀은 자동으로 획득됩니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Phillips, J. L., Singh, N. 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P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells).">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells).</a> Exp Cell Res. 175, 184-191 (1988).</li><li>Gaiv&#227;o, I., Sierra, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+comet+assay:+insights,+uses,+and+future+perspectives.">Drosophila comet assay: insights, uses, and future perspectives.</a> Front Genet. 5, 304 (2014).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+in+lens+epithelial+cells+and+peripheral+lymphocytes+from+age-related+cataract+patients.">DNA damage in lens epithelial cells and peripheral lymphocytes from age-related cataract patients.</a> Ophthalmic Res. 51 (3), 124-128 (2014).</li><li>Huet, S. A., Vasseur, L., Camus, S., Chesn&#233;, C., Fessard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+comet+and+micronucleus+assays+in+metabolic+competent+HepaRG+cells+to+predict+in+vivo+genotoxicity.">Performance of comet and micronucleus assays in metabolic competent HepaRG cells to predict in vivo genotoxicity.</a> Toxicol Sci. 138 (2), 300-309 (2014).</li><li>Danson, S., Ranson, M., Denneny, O., Cummings, J., Ward, T. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+case+control+study+on+genetic+damage+in+individuals+residing+in+the+vicinity+of+a+mobile+phone+base+station.">Cross-sectional case control study on genetic damage in individuals residing in the vicinity of a mobile phone base station.</a> Electromagn Biol Med. 9, 1-11 (2014).</li><li>Cabarkapa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+dry+olive+leaf+extract+in+adrenaline+induced+DNA+damage+evaluated+using+in+vitro+comet+assay+with+human+peripheral+leukocytes.">Protective effect of dry olive leaf extract in adrenaline induced DNA damage evaluated using in vitro comet assay with human peripheral leukocytes.</a> Toxicol In Vitro. 28 (3), 451-456 (2014).</li></ol>

스웨덴어 과학자 Ostling 및 요한슨은 세포 하나에서 DNA 손상을 정량화하는 혜성 분석을 사용하여 자신의 분야에서 처음이었다. 중성 조건은 두 과학자들이 사용한다는 점만을 이중 가닥 DNA 나누기의 검출을 허용했다. 싱 등은. 나중에 단일 및 이중 가닥 DNA 나누기를 평가하고 알칼리 불안정한 사이트 (12)을 감지 할 수있는 민감한 버전을 생산 알칼리 조건에서 사용하기위한 분석을 적용. 초기 개발 이후, 분석은 상이한 세포 유형에서 13-15 DNA 손상의 유형을 평가하기에 적합하도록 다양한 단계에서 수정되었다. 모든 기술에서와 같이, 기술 정보에 엄격한주의를 기울이지 16 것은 정확한 결과를 얻기 위해 중요하다. 우리의 경험을 바탕으로 최상의 결과를 얻을 경우 모든 방법 론적 스텝에서 정량-되는 전문 실험실 TECHN에 의해​​ 혜성 수행에 솔루션 준비icians. 신선하고 정확하게 준비된 용지 적절한 피펫 기법 정확한 타이밍과 새로 제조 한 백혈구 (이전 결과 섹션에서 언급 된 바와 같이)의 사용 용도는 정확한 결과 (17)를 얻기 위해 분해 및 겔 전기 영동을 위해서는 필수적이다. 이 분석에서 모든 개별 단계는 신뢰할 수있는 결과를 얻기위한 동등하게 중요하다. 일반적으로 가장 좋은 결과에서 (16)를 얻을 수있다 혜성 정량화까지 솔루션 준비에서 매 방법 론적 단계는 전문 실험실 technicians.Important에 의해 수행되는 경우 것 같다 신선하고 제대로 준비 미디어의 사용 적절한 피펫 기법, 정확한 타이밍은 이미 결과 분석 부 (17)로부터 적절한 결과를 얻기 위해 분해 및 겔 전기 영동 새로 제조 한 백혈구 사용 함. 다른 방법을 할 때, 혜성 분석 기술은 ADVAN이의 tages과 단점. 민감한 방법이기 때문에, 분석은 DNA 휴식을 증가 때문에 결과에 영향을 미칠 수있는 요소 (예를 들면, 자외선)에 취약합니다. 연구되고있는 것을 제외하고, 산화 스트레스를 향상시킬 수있다 상관 계수는 피해야한다. 스트레스는 산화 스트레스 백혈구에서뿐만 아니라 다른 모든 혈액 매체와 림프구에서뿐만 아니라의 수준을 높일 수 있습니다. 앞서 언급 한 바와 같이 산화 스트레스 18,19 측정 다양한 더 직접적인 방법이있다. 혜성 분석은 어떤 장점이 많은 방법 중 하나입니다. 이들은 상대적 저비용 (&lt;10,000 세포)에 필요한 세포의 수가 적은 환자 당 필요한 피 따라서 작은 시료 세포 (약 3 일간)에서 DNA 손상을 계량하는 데 필요한 시간의 상대적인 짧은 기간, 그 감도를 포함 서로 다른 세포 유형에서 엉덩이의 DNA 손상에 넓은 확산 적용. 우리는이 경험을 가지고 있기 때문에 과거에 우리는 백혈구와 함께 작동하도록 선택세포 형과 계획, 특정 연구에 적용했다. 혜성 분석법의 또 다른 장점은 서로 다른 유형 및 DNA 손상의 레벨을 검출하는데 사용될 수 있으며, 따라서 이러한 DNA 복구 과정, 보충 실험 또는 유전 독성 연구와 같은 산화 적 스트레스 또한 연구의 다양한 분야에 적용 할 수 있다는 것이다. 산화 스트레스는 이제 여러 질환의 발병 기전에서 중요한 역할을 인식한다. 혜성 분석 방법은 산화 스트레스 18,19 측정 많은 방법 중 하나를하면서, 비교적 간단하고 저렴한 다재다능하다. 습득하면,이 방법은 산화 스트레스가 역할을 담당 8-10,20,21되는 의학의 모든 분야에서 사용될 수있다.

혜성 분석은 처음 스웨덴어 과학자 Ostling 및 요한슨 (1)에 의해 개발되었다. DNA는 음전하 분자이다. 전기 영동시, 작은 손상, DNA 단편을 빠르게 양전하 양극 (2)을 향해 이동한다. DNA 단편 작을 양극쪽으로 빠르게 자신 마이그레이션 손상, DNA 손상과 손상된 DNA 단편 (3)으로 이루어지는 &quot;꼬리&quot;구성된 &quot;헤드&quot;전형적인 &quot;혜성&quot;을 형성한다. 손상된 DNA를 5 매우 균형 잡힌 DNA 나누기의 생성을 유지 본체 (4) 다른 메커니즘에 의해 복구 할 수 있습니다. 그러나, 저울이 DNA 바꿈 대신 경우 나누기 쌓일 수 궁극적 질환의 발전에 기여한다. 우리의 DNA는 주어진 시간 6 약 0.000165 % 손상을 겪고있다. 단일 가닥 DNA 나누기는 DNA 이중 나선의 두 가닥 중 하나에 결함 참조DNA 이중 나선의 두 가닥이 손상되면 이중 가닥 DNA 나누기가 발생하는 반면. 이러한 세포의 연령, 담배 연기, 다양한 약물 또는 산화 스트레스 7-9으로 주어진 시간에 DNA 나누기의 양을 향상시킬 수있다 여러가지 요인이있다. 향상된 DNA 파손으로 이어지는 모든 요인들이 일정하게 유지된다면, 혜성 분석법에 의해 DNA 나누기 부량은 산화 스트레스 좋은 간접 파라미터이다. 혜성 분석의 방법을 포함한 안과 의학에서 점점 오늘날 사용된다. 그 이유 중 하나는 산화 스트레스가 더욱 더 한 방법 간접적으로 정량 할 수있는 산화 스트레스와 각종 질병 8-11 및 혜성 분석 용기구 병인으로 인식한다는 것이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<colgroup>
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>(CPW59)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium EDTA</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM1370)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(E-8751)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(1077-1)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(TS1006)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Ranbaxy Rankem</td>
			<td>(S0160)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>BDH-Merck</td>
			<td>(89021)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM 845)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Spectrochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials required for gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Melting Agarose (NMA)</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>(RM273)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Melting Point Agarose (LMPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>(A9414)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol - Qualigens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm)</td>
			<td>Blue Star</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>(500010)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettor and Tips</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comet assay as an indirect measure of systemic oxidative stress

산소없이 살 수없는 높은 진핵 생물; 그러나 역설적으로, 산소는 그들에게 해가 될 수 있습니다. 그것이 다른 파이 * 고결 궤도에있는 두 개의 비공유 전자를 가지고 있기 때문에, 산소 분자는 화학적으로 비교적 불활성이다. 이 두 전자들은 자신의 축에 대한 동일 방향으로 회전 즉, 평행 한 스핀을 갖는다. 산소 분자가없는 매우 반응성 이유이다. 산소의 활성화는 두 개의 서로 다른 메커니즘에 의해 발생할 수 있습니다; 어느 시간 (가의 감소)를 통해 하나의 전자 환원을 통해, 또는 충분한 에너지의 흡수를 통해 부대 전자 중 하나의 회전을 반대로. 이것은 반응성 산화 화학 종 (ROS)의 생성을 초래한다. 인체 생리 학적 상태에서 ROS를 제거하는 여러 가지 방법이있다. ROS 생성은 보수 능력, 산화 스트레스의 결과 및 다른 손상 분자를 초과하는 경우. 산화 스트레스는 저를 할 수있는 여러 가지 방법이 있습니다asured. 이 논문은 또한 DNA 나누기의 측정을 허용한다 &quot;혜성 분석법&quot;로 알려진 세포 겔 전기 영동,라는 방법 중 하나에 초점을 맞춘다. 산화 스트레스 이외의 DNA 손상을 유발하는 것으로 알려진 모든 요인들이 일정하게 유지되는 경우, 혜성 분석법에 의해 측정 된 DNA 손상의 양이 산화 스트레스 좋은 파라미터이다. 원리는 간단하며, DNA 분자가 음으로 하전된다는 사실에 의존한다. 완전한 DNA 분자는 전기 영동시 이동하지 않도록 큰 크기를 갖는다. DNA 나누기 그러나 양극쪽으로 전계 이동 작은 단편으로 존재하는 경우 결과. 작은 조각 빠르게 이동한다. 단편은 서로 다른 크기를 가지고 전기의 최종 결과는 별개 라인 오히려 혜성의 형상으로 연속이 아니다. 시스템은 세포의 DNA 나누기 얻어진 &quot;혜성&quot;및 이와의 정량을 허용한다.

혜성 분석의 방법은 재현 가능한 결과를 렌더링 아니지만, 다양한 요인에 의해 영향을받을 수있다. 하나의 이러한 인자는 백혈구 전에 용해하고, 겔 전기 영동 또는이 단계는 새롭게 제조 된 백혈구를 수행할지 여부를 동결 보존되어 있는지의 여부이다. 도시도 2를 그 백혈구가 용해 및 겔 전기 SS- DNA 전에는 동결 보존 하였다 그룹 2에 휴식은 용해 및 젤 -electrophoresis 갓 준비 세포에서 수행 한 그룹 1보다 유의하게 높았다. 분석은 간접적 전신 산화 스트레스를 평가하는데 사용될 수있다. 표 1은 흡연자와 건강한 과목에서 Tail- 모멘트와 올리브 ... 순간에 대한 설명이 통계를 보여줍니다. 데이터는보다 매일 더 담배의 절반 팩을 흡연하는 순환 백혈구 9 ssDNA를 나누기를 두 배로 것으로 나타났다. <img alt="그림 1A" src= &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52763 / 52763fig1A.jpg&quot;/&gt; <img alt="그림 1B" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig1B.jpg" /> 도 1 (A)는 혜성 시험 분석 동안 사용 된 현미경을 도시한다. (B) Δ 밝은 머리와 꼬리 (작은 DNA 조각을 손상) 전형적인 &quot;혜성&quot;을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52763/52763fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52763/52763fig2.jpg" /> 백혈구가 새로 제조 된 백혈구가 용해 및 겔 전기 이전에 사용 된 경우보다 (그룹 2) 동결 보존 때 그림 2. ssDNA를 나누기는 유의하게 높았다. <imgALT = &quot;표 1&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52763 / 52763table1.jpg&quot;/&gt; 표 1. 흡연자의 ssDNA를 두 배 이상 수가 건강한 비 흡연자 일치 연령과 성별에 비해 중단했다.

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Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

혜성 분석은 다른 요인에 의해 유도 된 DNA 나누기를 측정한다. DNA 손상을 유발 (산화 스트레스를 제외한) 모든 요인들이 일정하게 유지되는 경우, DNA 손상의 양이 산화 스트레스 좋은 간접 파라미터이다. 이 프로토콜의 목적은 산화 적 스트레스의 간접적 인 측정에 혜성 분석을 사용하는 것이다.

전신 산화 스트레스의 간접 측정으로 혜성 분석

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.2K 조회수.  University of Basel.  혜성 분석은 다른 요인에 의해 유도 된 DNA 나누기를 측정한다. DNA 손상을 유발 (산화 스트레스를 제외한) 모든 요인들이 일정하게 유지되는 경우, DNA 손상의 양이 산화 스트레스 좋은 간접 파라미터이다. 이 프로토콜의 목적은 산화 적 스트레스의 간접적 인 측정에 혜성 분석을 사용하는 것이다. 

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A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

연구

생물학

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of aerobic life. Molecular oxygen is essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many damaging reactions within living organisms. The combination of aerobic metabolism and iron, which is another vital compound for life, is enough to produce radicals through Fenton chemistry and degrade cellular components. DNA degradation is arguably the most damaging process involving intracellular radicals, as DNA repair is far from trivial. The assay presented in this article offers a quantitative technique to measure and visualize the effect of molecules and enzymes on radical-mediated DNA damage.
The DNA protection assay is a simple, quick, and robust tool for the in vitro characterization of the protective properties of proteins or chemicals. It involves exposing DNA to a damaging oxidative reaction and adding varying concentrations of the compound of interest. The reduction or increase of DNA damage as a function of compound concentration is then visualized using gel electrophoresis. In this article we demonstrate the technique of the DNA protection assay by measuring the protective properties of the DNA-binding protein from starved cells (Dps). Dps is a mini-ferritin that is utilized by more than 300 bacterial species to powerfully combat environmental stressors. Here we present the Dps purification protocol and the optimized assay conditions for evaluating DNA protection by Dps.

Application of an In vitro DNA Protection Assay to Visualize Stress Mediation Properties of the Dps Protein

The DNA-binding protein from starved cells (Dps) plays a crucial role in combating bacterial stress. This article discusses the purification of E. coli Dps and the protocol for an in vitro assay demonstrating Dps-mediated protection of DNA from degradation by reactive oxygen species.

의 적용<em&gt; 체외</emDPS 단백질의 스트레스 중재 속성을 시각화&gt; DNA 보호 분석

Oxidative stress is an unavoidable byproduct of  aerobic life.  Molecular oxygen is  essential for terrestrial metabolism, but it also takes part in many ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

정량 면역 형광 분석은 중심체에서 단백질 수준의 변화를 측정하기 위해

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

파장과 산화 스트레스에 레드 / 근적외선 치료의 강렬의 범위의 효과의 평가를위한 방법<em&gt; 체외</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic human disorders, including cardiovascular and neurodegenerative diseases, diabetes, aging, and cancer. Therefore, it is important to study oxidative stress not only in cell systems but also using whole organisms. C. elegans is an attractive model organism to study the genetics of oxidative stress signal transduction pathways, which are highly evolutionarily conserved.
Here, we provide a protocol to measure oxidative stress resistance in C. elegans in liquid. Briefly, ROS-inducing reagents such as paraquat (PQ) and H2O2 are dissolved in M9 buffer, and solutions are aliquoted in the wells of a 96 well microtiter plate. Synchronized L4/young adult C. elegans animals are transferred to the wells (5-8 animals/well) and survival is measured every hour until most worms are dead. When performing an oxidative stress resistance assay using a low concentration of stressors in plates, aging might influence the behavior of animals upon oxidative stress, which could lead to an incorrect interpretation of the data. However, in the assay described herein, this problem is unlikely to occur since only L4/young adult animals are being used. Moreover, this protocol is inexpensive and results are obtained in one day, which renders this technique attractive for genetic screens. Overall, this will help to understand oxidative stress signal transduction pathways, which could be translated into better characterization of oxidative stress-associated human disorders.

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

의 산화 스트레스 저항을 측정<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트에

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

시험 관내 분석에서 포스파티딜 메틸화 된 역가를 측정하는 방법

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

쥐 간에서 DNA 가닥 나누기 및 산화 적 DNA 손상을 측정하기위한 생체 알카라인 혜성 분석 및 효소 수정 알카라인 혜성 분석에서

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to stress conditions, are implicated in various aspects of cell metabolism and survival. SGs modulate cellular signaling pathways, post-transcriptional gene expression, and stress response programs. The formation of these mRNA-containing granules is directly connected to cellular translation. SG assembly is triggered by inhibited translation initiation, and SG disassembly is promoted by translation activation or by inhibited translation elongation. This relationship is further highlighted by SG composition. Core SG components are stalled translation pre-initiation complexes, mRNA, and selected RNA-binding Proteins (RBPs). The purpose of SG assembly is to conserve cellular energy by sequestering translationally stalled housekeeping mRNAs, allowing for the enhanced translation of stress-responsive proteins. In addition to the core constituents, such as stalled translation preinitiation complexes, SGs contain a plethora of other proteins and signaling molecules. Defects in SG formation can impair cellular adaptation to stress and can thus promote cell death. SGs and similar RNA-containing granules have been linked to a number of human diseases, including neurodegenerative disorders and cancer, leading to the recent interest in classifying and defining RNA granule subtypes. This protocol describes assays to characterize and quantify mammalian SGs.

Stress Granules (SGs) are nonmembranous cytoplasmic structures that form in cells exposed to a variety of stresses. SGs contain mRNAs, RNA-binding proteins, small ribosomal subunits, translation-related factors, and various cell signaling proteins. This protocol describes a workflow that uses several experimental approaches to detect, characterize, and quantify bona fide SGs.

포유류 스트레스 과립으로 세포질 초점을 분류하는 방법

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 통로를 분석하는 전 비보 분석으로 구체 아웃스승

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...