이 방법은 새로운 안과용 제품 제형의 독성을 시험관 내에서 평가하는 데 사용할 수 있습니다. in vitro에서 안구 세포를 사용하여 화학 물질 및 제품 제형의 농도를 정제함으로써 신제품 안전성을 평가하기 위한 동물 사용을 최소화할 수 있습니다. 시험관 내 분석은 미토콘드리아 기능, 세포막 무결성 및 효소 활성에 대한 화학 물질의 영향을 결정하는 것과 같이 생체 내에서 평가할 수 없는 독성 종점을 평가합니다.
시험관 내에서 세포 독성을 평가하는 것은 잠재적인 독성 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 이것은 눈에서 치료 화학 물질의 최대 허용 용량을 설정하는 데 필수적입니다. 이 절차를 시연하는 것은 Jones Laboratory의 연구원 인 Nijani Nagaarudkumaran이 될 것입니다.
pHCEC와 iHCEC를 모두 1 x 10 농도의 유리 바닥 덮개가 있는 콜라겐 코팅 페트리 접시에 1밀리리터의 인간 안구 상피 배지 또는 HOEM을 사용하여 5번째까지 앉히는 것으로 시작합니다. 5% 이산화탄소가 포함된 섭씨 37도 인큐베이터에서 pHCEC 및 iHCEC 배양 1세트를 24시간 동안 배양하고 다른 세트는 48시간 동안 배양합니다. 배양 후, 섭씨 37도에서 20분 동안 4 마이크로몰 칼세인, 8 마이크로몰 에티듐 호모다이머 1 및 아넥신 5를 함유하는 500 마이크로리터의 아넥신 염색 완충용액으로 세포를 염색한다.
세포를 염색한 후, 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 조정하여 텍스트 원고에 설명된 대로 여기 및 방출 파장을 캡처합니다. 원고의 지시에 따라 2 차원 및 3 차원 이미지를 얻습니다. 세포를 24-웰 콜라겐 1 코팅된 배양 플레이트의 각 웰에 5 x 10 내지 4 밀리리터당 HOEM으로 시딩하고, 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 3시간 동안 배양한다.
배양 후, 웰 내의 배지의 부피를 300 마이크로 리터로 줄이십시오. 다음으로, 별도의 실험에서 세포를 섭씨 37도에서 평방 미터당 6.48와트의 UVA 방사선과 제곱미터당 1.82와트의 UVB 방사선에 5분 및 20분 동안 노출시킵니다. UV 방사선 후, 200 마이크로 리터의 신선한 HOEM을 각 웰에 첨가하고 5 % 이산화탄소로 섭씨 37도에서 20 시간 동안 배양한다.
다음날, 각 웰에서 세포 상청액을 수집하고 멸균 된 2 밀리리터 폴리 프로필렌 튜브로 옮깁니다. 상청액을 섭씨 영하 80도에서 동결시킵니다. UV 노출 후 pHCEC 및 iHCEC에서 방출되는 사이토카인 수준을 확인하려면 다중 사이토카인 분석을 사용하고 키트의 지침에 따라 인터루킨 6, 인터루킨 8, 인터루킨-1 베타 및 TNF-알파를 정량화합니다.
DMEM과 F12에서 10% 대사 분석 시약을 준비합니다. 각 웰의 배양액을 10% 대사 분석 용액 1밀리리터로 교체하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 4시간 동안 배양합니다. 형광 플레이트 판독기를 사용하여 530 나노미터 여기 및 590 나노미터 방출 파장에서 각 용액의 형광을 측정합니다.
시드 세포를 24-웰 콜라겐 1 코팅 배양 플레이트의 각 웰에서 5 밀리리터 당 4 밀리리터로 시드하였다. 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 3시간 동안 배양합니다. 배양 후 배지를 제거하고 PBS에서 0.001% 염화벤잘코늄 또는 BAK, 0.01% 과산화수소 및 0.0025% 도데실 황산나트륨을 포함하는 1밀리리터의 화학 독소에 세포를 5분 및 15분 동안 노출시킵니다.
화학 독소에 노출된 후 웰에서 독소를 제거하고 1밀리리터의 PBS로 헹구고 각 웰에 1밀리리터의 HOEM을 추가합니다. 배양 20시간 후 배지를 10% 대사 분석 용액 1밀리리터로 교체하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 4시간 동안 배양하여 대사 분석을 수행합니다. 형광 플레이트 리더를 사용하여 530 나노미터 여기 및 590 나노미터 방출 파장에서 각 용액의 형광을 측정합니다.
20시간 배양 후 웰에서 세포 상청액을 별도의 멸균 2밀리리터 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 섭씨 영하 80도에서 동결시킵니다. 인터루킨 6, 인터루킨 8, 인터루킨-1 베타 및 TNF-알파를 정량화하기 위한 키트의 지침에 따라 UV 처리된 세포의 사이토카인을 평가하는 데 사용되는 것과 동일한 멀티플렉스 플랫폼을 사용합니다. 종자 세포를 24-웰 콜라겐 1 코팅된 배양 플레이트의 각 웰에서 HOEM의 밀리리터당 1 x 10 내지 5분의 5로 섭씨 37도에서 24시간 동안 5% 이산화탄소와 함께 배양한다.
배양 후 배지를 제거하고 세포를 PBS에서 0.001%BAK, 0.005% BAK 및 0.01% BAK를 포함한 1밀리리터의 화학 독소에 5분 동안 노출시킵니다. 노출 후 화학 독소를 제거하고 1 밀리리터의 PBS로 웰을 헹구고 각 웰에 1 밀리리터의 HOEM을 첨가합니다. 20시간 배양 후 섭씨 37도에서 20분 동안 칼세인, 에티듐 호모다이머 및 아넥신 5를 포함하는 500마이크로리터의 아넥신 염색 완충액으로 세포를 염색합니다.
현미경을 조정하여 여기 및 방출 파장의 630 및 675 나노미터(아넥신 5, 칼세인 AM의 경우 495 및 515 나노미터), 에티듐 1 염색의 경우 528 및 617 나노미터의 강도를 측정합니다. 그런 다음 형광 현미경을 사용하여 세포의 이미지를 획득합니다. iHCEC는 10 내지 20 마이크로미터 범위의 소세포인 것으로 밝혀졌고, pHCEC는 성장 24시간 후에 20 내지 50 마이크로미터 범위였다.
성장 48시간 후에 iHCEC 및 pHCEC에 대해 크기 범위의 유사한 차이가 관찰되었다. UV에 노출되지 않은 세포와 비교하여, 조사된 pHCECs의 대사 활성은 노출 20분에 유의하게 감소하였다. iHCECs의 경우, 5분 및 20분 모두에서 조사된 세포에 대해 대사 활성이 감소하였다.
따라서, iHCECs보다 pHCECs의 대사 활성을 감소시키는데 더 긴 노출 시간이 걸렸다. iHCECs에 의한 최대 사이토카인 방출은 UV 노출 5분이었다. pHCEC에 대한 최대 사이토카인 방출은 UV 노출 20분에서 발생하였다.
방출된 염증성 사이토카인의 총량 측면에서 pHCEC는 iHCEC보다 훨씬 더 많은 인터루킨-1 베타, 인터루킨 8 및 TNF-알파를 방출한 반면, iHCEC는 더 많은 인터루킨 6을 방출했습니다. pHCEC와 iHCEC 모두 세 가지 화학 물질 모두에 노출된 후 인터루킨 6의 방출에 변화를 보였습니다. BAK는 1차 및 불멸화 HCEC 모두에 대한 대조군에 비해 인터루킨 6의 방출을 감소시켰습니다.
과산화수소는 iHCEC로부터 인터루킨 6의 방출을 증가시키고, pHCEC로부터의 방출을 감소시켰다. pHCEC와 iHCEC는 모두 BAK의 0.005%와 0.1%에서 유의하게 손상되었다. 안구 세포 독성에 대한 시험관 내 평가를 수행한 후, 안구 제품이 각막 신경 또는 안구 면역 체계에 미치는 영향을 결정하기 위해 안구 독성에 대한 추가 동물 모델을 수행할 수 있습니다.
이러한 기술은 눈에 대한 화학 물질 및 제품 제형 독성의 메커니즘을 결정하는 데 필수적이며 제품 개발 테스트를 위한 동물 사용을 최소화하는 데 도움이 됩니다.
