관 구조의 제조는 혈관 네트워크의 조직 공학에 유망한 접근 방식이며, 이는 체외에서 두꺼운 조직을 재배하는 데 있어 주요 과제 중 하나입니다. 코어/쉘 기술의 주요 장점은 단일 단계에서 중공 필라멘트 스캐폴드를 간단하게 생산하여 제조 시간을 줄이고 잠재적으로 셀과의 직접 인쇄를 허용하는 것입니다. 적절한 점탄성 특성으로 하이드로겔 제형을 준비하고 코어/쉘 재료의 연속 균형 흐름을 유지하는 것은 안정적인 스캐폴드의 3D 프린팅에 매우 중요합니다.
먼저 멸균 5mL 주사기를 갓 준비한 하이드로겔로 채우도록 하십시오. 27 게이지 무딘 엔드 바늘이 장착된 두 번째 5mL 주사기를 채우고 갓 준비된 크로스링크 용액을 장착합니다. 코어/쉘 노즐을 조립합니다.
G27 무딘 엔드 바늘을 코어 성분으로 삽입하고 나사를 사용하여 바늘을 고정시하십시오. 내부 바늘은 외부 코어 쉘 노즐에서 약 1mm를 돌출해야합니다. 주사기를 노즐의 G27 바늘에 교차 연결 용액과 연결하고 주사기를 에탄올 멸균 3D 프린터의 압출기 마운트 중 하나에 로드합니다.
주사기를 하이드로겔로 두 번째 압출기로 마운트하여 노즐에 연결합니다. 루어 잠금 장치를 사용하여 코어/쉘 노즐의 측면 루어 입력에 짧은 튜브를 연결합니다. 노즐이 표면에 닿을 때까지 정렬을 조심스럽게 조정한 후 노즐을 외부 노즐 직경과 동일한 거리로 후퇴시킵니다.
생성된 스캐폴드 g-code를 가져오고 재생을 눌러 인쇄 프로세스를 시작합니다. 인쇄 후 인쇄된 스캐폴드로 기판을 조심스럽게 제거하고 전체 스캐폴드에 보조 교차 연결 솔루션을 부어 주세요. 실온에서 1분 동안 비계를 배양합니다.
기판에서 비계를 분리하려면 스캐폴드를 옆으로 부드럽게 당깁니다. 스캐폴드가 기판에 강하게 부착되면 두 재료 사이에 날카로운 모서리를 삽입하여 분리합니다. 스캐폴드를 새 용기로 옮기습니다.
UV는 스캐폴드의 양면을 측면당 30분 동안 살균합니다. 그런 다음 비계를 무색 세포 배양 배지에 넣고 적어도 24시간 동안 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 스캐폴드를 배양한다. 다음 날, 37섭씨에서 5분간 0.25%의 트립신을 가진 체외 문화에서 허브를 수확합니다.
세포가 분리되면, 신선한 세포 배양 배지의 3 mL로 효소 반응을 멈추고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 페놀 레드를 함유하는 신선한 배양 배지에서 펠릿을 다시 중단하고, 밀리리터 농도당 제5 내피 세포에 세포를 3.4배 10배로 희석한다. 27 게이지 바늘이 장착된 멸균 5mL 주사기에 세포를 적재하고 비계의 진입점을 찾습니다.
바늘을 비계 필라멘트의 직선 부분과 정렬하여 스캐폴드를 낮은 각도로 조심스럽게 구멍을 뚫습니다. 바늘이 채널의 중공 필라멘트 내에 있는지 확인하고 플런저를 부드럽게 우울하여 약 1-2 mL의 세포 현탁액을 스캐폴드에 주입합니다. 서스펜션의 흐름은 반투명 스캐폴드를 통해 볼 수 있어야 합니다.
전체 비계가 세포 현탁액으로 채워지면, 신선한 세포 배양 배지에 비계를 침수하고, 최대 10일 동안 세포 배양 배양인에 비계를 반환한다. 인큐베이션의 끝에 라이브 /죽은 이미징을 위해 PBS로 스캐폴드를 헹구고 무딘 끝 바늘을 사용하여 라이브 / 데드 솔루션을 신중하게 비계에 주입하십시오. 용액이 전체 비계를 채우고 30 분 동안 37섭씨에 비계를 배치했는지 확인합니다.
인큐베이션이 끝나면 비계를 PBS로 헹구고 스캐폴드를 유리 슬라이드로 조심스럽게 옮기습니다. 염색된 세포는 그 때 형광 현미경의 밑에 비계에서 관찰될 수 있습니다. 새로 인쇄되고 후처리된 스캐폴드의 단면에서 필라멘트 내에서 눈에 보이는 중공 채널을 관찰할 수 있습니다.
입증된 바와 같이 세포 배양 배지에서 72시간 동안 배양한 후에도 필라멘트는 전체 비계 길이에 걸쳐 중공 구조를 유지한다. 여기서, 비계 내 48시간의 배양 후 내피 세포의 대표적인 라이브/죽은 분석이 나타난다. 살아있는 세포는 그들의 밝은 녹색 형광 신호에 의해 확인될 수 있습니다.
이 기술은 중공 관 비계의 1 단계 제조의 기초이며 바이오 잉크에 통합 된 세포를 사용하여 직접 인쇄하여 업그레이드 할 수 있습니다.
