심혼은 심장 염증과 수리에 있는 중요한 역할을 하는 면역 세포의 이기질 인구를 포함합니다. 면역 세포의 이질성을 이해하고 기능에 대한 추가 통찰력을 얻기 위해서는 심장에서 이러한 세포의 회복을 허용하는 방법이 있는 것이 중요합니다. 이 기술은 건강하거나 병에 걸린 심혼에 있는 면역성 세포 다양성뿐만 아니라 면역성 세포 다양성을 밝히는 것을 도울 수 있습니다.
이 기술에는 세 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 3시간 이내에 다양한 셀 유형의 단일 셀 서스펜션 생성을 이끄는 간단한 단일 워크플로우입니다. 둘째, 그것은 실행 가능한 면역 및 비 면역 세포 집단의 높은 회복으로 이끌어 냅니다.
셋째, 매우 다재다능한 방법이며 다른 종의 심장 조직에도 적용할 수 있습니다. 단일 소화 반응에 사용되는 조직의 양에주의를 기울이는 것이 중요합니다. 멸균 가위를 사용 하 여, 차가운 식염수 또는 HBSS에서 왼쪽 심실의 정액 또는 측면 벽에서 해부 조직 표본.
시편에서 정성 지방과 코르자인 건음을 조심스럽게 해부합니다. 멸균 블레이드 나 가위의 도움으로, 약 200 밀리그램의 무게 조각으로 조직 덩어리를 해부. 마우스를 안락사한 후 날카로운 가위의 도움으로 가슴 구멍을 엽니다.
무딘 헤모스타츠를 사용하여 심장을 위쪽으로 들어올립니다. 5 밀리리터 주사기에 부착 된 25 게이지 바늘을 사용하여 차가운 PBS로 심장을 퍼퓨즈하십시오. 심장이 희미해 나타날 때까지 퍼퓨즈.
심장을 제거하고 멸균 페트리 접시에 얼음에 놓습니다. 멸균 페트리 접시에 인간의 심장 조직 덩어리 또는 뮤린 심장 200 밀리그램을 놓습니다. 멸균 블레이드 나 가위를 사용하여 조직을 미세하게 다진다.
소화를 설정하려면 15 밀리리터 원추형 튜브에서 모든 인간 심장 조직 덩어리 또는 효소 콜라게나제 I, DNase I 및 hyaluronidase를 밀리리터 당 450, 60 및 60 단위의 농도로 모든 인간 심장 조직 덩어리 또는 한 개의 뮤린 심장에 대한 3 밀리리터의 최종 소화 볼륨을 준비합니다. 튜브에 DMEM2.5 밀리리터를 추가합니다. 깨끗한 집게의 도움으로, 각 반응 튜브에 미세하게 다진 조직을 배치합니다.
부드러운 소용돌이로 잘 섞으세요. 흔들리는 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 소화하여 낮은 중간 교반 속도로 설정합니다. 소화 한 시간 후, 인큐베이터에서 튜브를 꺼내 얼음에 놓습니다.
위에 40 미크로넨 세포 여과기를 가진 50 밀리리터 원원형 튜브를 설치합니다. 두 밀리리터의 효소 비활성화 버퍼로 필터를 적시다. 다음으로, 각 소화 관에 완충제 비활성화 효소의 8 밀리리터를 추가하여 소화 효소를 비활성화합니다.
그런 다음 40 마이크로론 세포 여과기를 통해 총 혼합물의 결과 13 밀리리터를 50 밀리리터 원내 튜브에 붓습니다. 여과된 샘플을 신선한 15 밀리리터 원추형 튜브로 다시 전달합니다. 샘플을 섭씨 4도에서 6분간 400배 g로 회전합니다.
미디어의 0.5 밀리리터를 떠나 상수 폐기. 부드러운 파이펫팅으로 셀 펠릿을 다시 중단하고 ACK 리시스 버퍼 1밀리리터를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 소용돌이치며 실온에서 5분 동안 배양하여 적혈구 용액을 수행합니다.
ACK 버퍼에서 5분 후 샘플에 9밀리리터의 DMEM을 추가합니다. 뚜껑을 튜브에 다시 넣고 튜브를 부드럽게 반전하여 혼합합니다. 40 미크론 세포 여과기를 통해 필터링하고 15 밀리리터 원내 튜브에서 여과를 수집합니다.
튜브를 400배 g에서 6분간 원심분리하고 상체를 폐기합니다. FACS 버퍼 1밀리리터를 추가하고 펠릿을 다시 놓습니다. 그런 다음 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮김합니다.
원심 분리기는 5 분 동안 400 배 g에서 다시 합니다. 상체를 버리고 FACS 버퍼의 100 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 단일 세포 현탁액은 이제 항체 염색을 위한 준비가 되었습니다.
1~50개의 희석시 심장 샘플에 전형적인 인체 항체 패널을 추가합니다. 기질 세포와 뮤린 심장 대식세포에 다른 항체를 사용하십시오. 어둠 속에서 섭씨 4도에서 30~40분 동안 배양하세요.
FACS 버퍼 1밀리리터, 부드럽게 소용돌이, 원심분리기를 400배 g에서 5분간 추가합니다. 이 세탁 단계를 두 번째로 반복하십시오. 그런 다음 FACS 버퍼의 350 마이크로 리터에서 샘플을 다시 중단하고 하나의 마이크로 몰러의 최종 농도에 도달하기 위해 DAPI를 추가합니다.
이제 샘플은 FACS 분석을 위한 준비가 되었습니다. 이 프로토콜에서는 마우스와 인간 심근으로부터 대식세포의 분리가 이루어졌다. 이 그림은 처리되지 않고 처리된 인간 LVAD 코어를 보여줍니다.
인간 심근병증으로부터의 CD45 음성 기질 세포뿐만 아니라 인간 심근증으로부터의 CCR2 음성 및 CCR2 양성 인간 대식세포의 유량 분류를 위한 게이팅 방식이 제시되었다. 라이트 스테인드 FACS의 이미지는 CD45 양성 및 CD45 음성 세포를 정렬생존가능성을 나타내는 그대로 세포막을 보여줍니다. 마우스 심장에서 대식세포를 정렬하는 게이팅 계획도 성공적이었습니다.
효소 반응에 사용되는 조직의 무게는 효율적인 소화에 매우 중요합니다. 프로토콜에 표시된 효소 농도에 대해 200 밀리그램 이하의 조직을 사용하지 않습니다. 이 방법에 따라, 세포는 시험관 내 자극 암시를 위해 배양될 수 있다.
세포는 벌크 RNA 염기서열 분석 또는 단하나 세포 염기서열분석용으로 분류될 수 있다. 이 방법은 건강하거나 병에 걸린 인간의 심장에 존재하는 이전에 인식할 수 없는 대식세포 이질성을 발견하는 데 귀중한 기술역할을 해 왔습니다. 단일 세포 시퀀싱 다음에이 방법을 사용 하 여, 다양 한 면역 및 비 면역 세포 는 어떻게 다양 한 면역 및 비 면역 세포 건강 한 심장 대 질병 심장에서 다양 한 발견 하기 위해 진행.
