다닐 Maddalo 기술의 카를 스루에 연구소에서 젊은 탐정 그룹 (YIG)와 같은 연구 활동의받는 사람입니다.

1. 세포를 심는 <ol><li> 시작하기 전에, 37에서 물을 욕조에있는 문화 매체, PBS 1X와 트립신을 따뜻하게 ˚ C </li><li> 인큐베이터 밖으로 세포를 가지고 매체를 기음. </li><li> 부드럽게 그들을 씻어 세포에 PBS 1X의 5 ML을 적용합니다. </li><li> PBS 1X를 기음과 트립신은 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0,025퍼센트를 포함하는 1 ML을 적용합니다. </li><li> 부드럽게 트립신의 균등을 접시를 회전. </li><li> 37 인큐베이터에있는 세포를 장소 ˚ C 50-10분에 대한 (세포 종류에 따라). 시간 체크인 시간부터 세포 판을 흔들어으로 분리하는 경우. </li><li> 매체의 10-20 ML에있는 세포를 Resuspend하고 50 ML 팔콘 튜브에서 그들을 수집합니다. </li><li> 베크 만 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다. 세포의 숫자는 약 60~70%의 합류를 위해 충분해야합니다. </li><li> 플레이트 세포를 및 6~8시간위한 씨앗에게 있습니다. </li></ol> 2. 트랜스fection <ol><li> 이전 transfection하기 ˚ C. 37 물이 욕조에서 혈청 무료 매체의 나누어지는을 따뜻하게 </li><li> 상온에 X - treme 진 9 가져와. </li><li> 이 eppendorf 튜브에서 혈청 무료 매체 (1 관 = 1 transfection) Pipet. </li><li> Pipet 끝 5 분 동안 eppendorf과 부화의 플라스틱 벽에 닿으면하지 않는 혈청 무료 매체를 지불 관심의 X - treme 진 9. 그동안 두 DNA 믹스를 준비 : 한 튜브에 다른 튜브 renilla, 반​​딧불과 분자 보호자에 renilla, 반​​딧불 그리고 빈 벡터 제어에 대한 plasmids 함께 섞는다. </li><li> 혈청 무료 매체에게 + X - treme 진 9, 20 분 상온에서 와동과 부화를 포함하는 각 eppendorf로 DNA 믹스를 추가합니다. </li><li> 37 24 시간 동안 각 판과 부화에 각각의 혼합 dropwise 추가 ° C와 5퍼센트 CO 2 </li></ol> 3. 분할 세포에게 <ol><li> 24시간 transfection, tryps 후1.4에서 설명한대로 세포 inize - 1.6과 6에서 잘 플레이트 60~70%의 최종 confluency로 희석. </li><li> 이외 충격 제어 한 접시를 준비하고 분석해야 복구 시간 포인트만큼 접시대로 그림 보여주었다. 2. </li></ol> 4. 열 충격 <ol><li> 열 충격에 대한 사전 따뜻한 혈청 37 물 목욕으로 매체를 포함 ˚ C. </li><li> 20 MM 20 μg / ML 및 맙스의 최종 농도 혈청이 포함된 매체 cycloheximide에 diluting하여 준비 &#39;열 충격 버퍼. </li><li> 이제 인큐베이터에서 접시를 꺼내와 매체를 기음. </li><li> &#39;열 충격 버퍼&#39;의 각 잘 한 ML에 추가, 37 30 분 품어 ˚ C와 CO 2의 5 % (또한이 치료의 참조 플레이트 포함). 이것은 드 노보 단백질 합성 중단됩니다. </li><li> 물 목욕에있는 동안 스위치와 t를 설정45 emperature ˚ C. </li><li> 부화 후, 이전에 스트 라이프의 컷 Parafilm와 접시의 뚜껑을 밀봉. 참조 플레이트 (refolfed 반딧불의 100 %)은 보육에 남아있다. </li><li> ˚ C 30 분 45 접시를 품어. </li><li> 물 목욕에서 접시를 제거 parafilm을 제거하고 복구를 허용하도록 인큐베이터에 다시 번호판을 넣어. </li><li> 각 시점의 수확 세포에서 4에서 1 분간 2000Xg에서 ˚ C를 centrifuging하여 PBS 1X에서 그들을 씻어 </li></ol> 5. 세포 용해와 루시페라제 분석 <ol><li> 효율적인 세포 용해 들면, 액체 질소에서 세포 펠렛을 동결 스냅. </li><li> 유리관을 두 번 증류수로 1:5 희석 수동 용해 완충액 200 μl를 추가합니다. </li><li> 96 잘 접시에있는 세포 lysate 30 μl를 추가합니다. 각 예제는 세중의에 pipetted 있습니다. </li><li> 오직 &#39;비 충격&#39;참조 샘플이 사용됩니다이 단계는 동일 transfection 효율을 확인하는 데 사용됩니다 이후 renilla 루시페라제 활동을 참조하십시오. </li><li> 분석을위한 솔루션을 준비합니다. Gly - Gly 버퍼에 0.2 mm의 최종 농도를 희석 luciferin luciferin 솔루션하십시오. 반응 버퍼에 대한 Gly - Gly 버퍼 1mM DTT 최종 농도와 ATP를 희석. coelenterazine 반응 버퍼, coelenterazine 버퍼에서 0.2 μm의의 최종 농도를 희석 coelenterazine. luciferin 솔루션과 coelenterazine 반응 버퍼 빛을 보호 유지. </li><li> 이제 luminometer에서 96 - 웰 플레이트를 배치하고 프로그램 &#39;Wallac 1420 워크 스테이션&#39;을 시작합니다. </li><li> coelenterazine 솔루션을 포함하고있는 팔콘 튜브에 Pump1을 소개합니다. 더 빛이 튜브와 접촉하지 수 있도록 뚜껑을 닫습니다. </li><li> 옵션 &#39;디스펜서 관리&#39;메뉴에서 선택하고 Pump1을 체크. </li><li> 옵션 &#39;채우기&#39;를 선택하십시오. </li><li> 플레이트 레이아웃 옵션을 선택 편집하려면 메뉴에서 &#39;프로토콜과 결과를 탐험해보세요. 그것의 프로토콜과 더블 클릭을 선택합니다. 이제 우물을 읽을 수 선택합니다. </li><li> &#39;Wallac 관리자&#39;로 가서 &#39;시작&#39;을 클릭하십시오. renilla 루시페라제과 기판 coelenterazine 사이의 반응은 482 nm의 피크 파장의 빛을 방출과 함께. </li><li> 읽고 나면, &#39;디스펜서 유지 보수&#39;에 가서 튜브로 모두 잔류 솔루션을 공개하는 &#39;비우기&#39;를 Pump1를 선택합니다. </li><li> 지금 물을 포함하는 팔콘 튜브에 튜브를 이동하고 &#39;플러쉬&#39;를 체크. </li><li> 세정 단계 후, &#39;비우기&#39;를 선택하여 튜브를 비웁니다. </li><li> 반응 버퍼 팔콘 튜브에 Pump1 및 luciferin 팔콘 튜브 Pump2에서 하나의 튜브를 놓습니다. </li><li> 플레이트 레이아웃을 변경합니다. </li><li> &#39;디에서 Pump1 및 Pump2에 대해&#39;채우기 &#39;를 선택하십시오스펜서 관리 &#39;메뉴. </li><li> 프로토콜을 선택하고 읽기를 시작합니다. 반딧불의 루시페라제과 기판 luciferin 사이의 반응은 560 nm의 피크 파장의 빛을 방출과 함께. </li><li> 독서의 끝에 Pump1 및 Pump2에 대한 빈 플러쉬 비어 절차를 반복합니다. </li><li> 결과는 &#39;Wallac 1,420 탐색기&#39;에서 지금 사용할 수 있습니다. </li><li> 각 실험 분석 번호로 연결되어 있습니다, 시작 날짜와 종료 사용자 이름입니다. </li><li> 결과는 이제 엑셀 파일로 내보낼 수 있습니다. </li><li> 1 : 계산 들면, 세포는 세 그룹으로 나뉘어져 있습니다. 비 충격을 기준 시료 (100 %가 반딧불 루시페라제을 refolded로 설정) 2. 충격 분자 보호자와 열없이 세포 3. 분자 보호자와 더위와 함께 세포는 충격. </li></ol> 6. 대표 결과 시스템이 프로를 작동하면 단백질 refolding 직접 테스트하는 것이 회복의 시간과 관련이<html> perly, 분석은 다른 시간 지점에서 세포를 수집 수행되어야한다. 직접 상관 시간 / refolding의 비율이 실험이 제대로 수행하고 따라서 제한 요소를 나타냅니다되었음을 나타냅니다. 그러나 그것은 항상 열 충격 후 refolding 것은 포화 이벤트이며, 따라서 적절한 시간 코스 분석이 어떤 실험을 시작하기 전에 수행되어야한다는 것을 고려하여야한다. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 실험의 개요. 생체내의 refolding 분석에 완료해야 3-4일이 필요합니다. 일 1 세포는 씨앗과 transfected 있습니다. 그 다음날 세포가 작은 형식으로 splitted하고 3 일, 그들이 열 충격입니다. 이 시점에서 바로 세포를 수확 후 루시페라제 분석을 수행하거나 -80 ° C에서 세포 펠렛을 저장하고 다른 순간에 분석을 수행할 수 있습니다 _content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 셀 분할. 일 2 세포는 6 자 판으로 분할됩니다. 각 transfection은 같은 접시에 모든 transfection을 위해 잘으로 희석한다. 각 플레이트는 특정 복구 시간 플러스 아닌 충격 참조 플레이트에 해당됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 대표 좋은 결과. refolding의 A. 비율 직접 반딧불 루시페라제 활동에 의해 측정. 각 막대 차트는 다른 복구 시간 지점에서 분자 보호자의 (적색 바) 부재 (검은 막대)와 존재의 refolding의 비율을 나타냅니다. 부재 (검은 선)과 보호자의 존재 (빨간색 선)에 시간과 refolding 사이 B. 간 상관 관계. R 제곱 값은 좋은 상관 관계를 나타냅니다. Fi 인터넷에g.3A는 세포가 15, 30, 45, 60 120분 부재의 열 충격 (검은 막대) 후 분자 보호자의 존재 (빨간색 막대)에 수집된 담당자 결과를 볼 수 있습니다. 비율은 장기 복구 시간과 분자 보호자의 transfection과 루시페라제 증가 refolded. refolding와 시간 제어 (그림 3B, 블랙 라인)과 분자 보호자 - transfected 세포 (그림 3B, 레드 라인) 사이의 상관 관계가 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 대표 나쁜 결과. refolding의 A. 비율 직접 루시페라제 활동에 의해 측정. 각 막대 차트는 다른 복구 시간 지점에서 분자 보호자의 (적색 바) 부재 (검은 막대)와 존재의 refolding의 비율을 나타냅니다. 부재와 존재의 시간과 refolding 사이 B. 간 상관 관계 (빨간색 리터보호자의 오프라인). R 제곱 값은 나쁜 상관 관계를 나타냅니다. 그림 4A가. 제대로 수행되지 실험의 대표적인 결과를 보여줍니다. 제어 (검은 막대)와 분자 보호자 - transfected 세포 (적색 바) 모두 시간과 refolding 단백질의 증가를 표시하지 않았다. 또한, 분자 보호자의 transfection은 refolding의 증가의 결과 않았어요. 이 불쌍한 상관 관계는 그림에 확인됩니다. 컨트롤 (블랙 라인)과 분자 보호자 - transfected 세포 (빨간색 선)에 대한 각각 0.6619과 0.1882의 R 제곱 값을 보여주는 4B.

<ol>
	<li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+and+protein+quality+control.">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li><li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+heat+shock+response.">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li><li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins.">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li><li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+proteins+and+drug+resistance.">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li><li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology.">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li><li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer.">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG:+mechanisms+of+antitumour+activity.">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP70+for+cancer+therapy.">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li><li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats.">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li><li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK,+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage.">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li><li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate.">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li><li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease.">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li><li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity.">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

이 작품에서는 분자 보호자의 세포내 refolding 활동을 측정하는 프로토콜이 제공됩니다. 그림의 개요에 의해 그림과 같이 전체 분석은 3-4일에서 수행할 수 있습니다. 1. 반딧불과 renilla 루시페라제에 의해 만들어진 빛의 신호의 견고하고 선형이 프로토콜의 재현성위한 견고한 기반을 나타냅니다. 분석의 중요한 단계는 분자 보호자와 반딧불의 루시페라제의 overexpression을 보장하기 위해 효율적인 transfection 시약의 선택입니다. 리포터 유전자는 adenoviral 감염 12 electroporation과 같은 다른 방법 또한 제공 수 있습니다. 반딧불의 루시페라제의 유전자가 안정 transfected있는 동안 또 다른 가능성은, 보호자의 표현 (테트라 사이클린 - 응답 발기인 예를 들어) 13 화학적 inducible있는 유전자 변형 세포 라인의 사용이다. opti의 광범위한기능은 기본 세포를 포함한 여러 세포 라인에 분석의 응용 프로그램을 따라서 할 수 있습니다. 셀 라인 cycloheximide 치료에 특히 민감한 경우 또한, 반딧불 루시페라제 단백질 번역은 사용 repressible / inducible 시스템에 의해 체포 수 있습니다. refolding 활동은 분자 보호자 사이에 달라질 수 있으므로, transfected 수 보호자의 금액의 적정 항상 수행되어야합니다. 일단 특정 세포 라인에 설립, 기술은 작은 분자 및 / 또는 gentic 노는 보호자 활동에 영향을 미칠 수있는 방법을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 심지어 12 잘 플레이트 - 검정은 6 같은 작은 형식도 수행할 수 있습니다. 가장 매력적인 애플 리케이션 중 하나는 보호자 활동에 영향을 미칠 수있는 화합물의 전체 라이브러리를 테스트하는 가능성이다. 이 특정한 경우에는 셀 라인은 안정 리포터 유전자뿐만 아니라 채널로 transfectedaperone은 우선적으로 transfection 효율에 의한 변형을 최소화하기 위해 사용됩니다. 이 분석은 또한 공동 activators이나 단백질 refolding 또는 어떻게 다른 스트레스 자극 (열, 산화 스트레스는 단백질 반응을 펼쳐)시 refolding에 영향을 분자 보호자의 공동 억제의 역할을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 세포 기반 실험에서 화합물 및 / 또는 특정 보호자의 활동에 단백질의 효과보다 생리 판독을 가능하더라도, 여기 제시된 분석과 보호자 활동을 계량하는 것은 불가능합니다. 이 경우에는 반딧불 루시페라제 또는 β - 갈락토의 체외 refolding 분석 에서처럼 셀 - 무료 분석 더 적합한 것입니다.

본 실험에서는 Luminometer 양식 Perkin 엘머 &#39;1420 발광 카운터 &#39;벡터 라이트&#39;가 사용되었다 Luminometer를위한 프로그램 : Renilla : 펌프 1, 100 μl 주입 반응 버퍼 : Pump1, 70 μl 주입 Luciferin : Pump2, 30μl 주입 버퍼는 두 번 증류수에서 이러한 재고 솔루션을 준비 경우 : <ul style="list-style:none"><li> - 1M MgSO 4 : 일리터에서 246,48 g MgSO 4 * 7H 2 O </li><li> - 0,5 M EGTA : 일리터에서 190,18 g EGTA </li><li> - 1M KH 2 PO 4 : 일리터에서 136,09 g KH 2 PO 4 </li><li> - 1M K2 HPO 4 : 228,23 g K 2 HPO 일리터 4 * 3H 2 O </li><li> - 5M NaCl : 일리터에서 292,2 g NaCl </li><li> - 0,5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) : 일리터에서 186,12 g EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) * 2 시간 2 O &nbsp;</li></ul> GLY - GLY 버퍼 : <ul style="list-style:none"><li> - 25mM Glycylglycin </li><li> - 15mM MgSO 4 </li><li> - 4mm짜리 EGTA </li></ul> 에 대한 Glycylglycin의 1리터 사용 3,3 g, MgSO4 1M 솔루션과 0,5 M EGTA 솔루션의 8ml의 15ml. 물에 해결, 7,8로 산도를 조정 1 리터의 총 볼륨에 가져와. Renilla / Coelenterazine 버퍼에 대한 반응 완충액 : <ul style="list-style:none"><li> - &amp; NBSP, 13,4 MM KH 2 PO 4 </li><li> - 86,6 MM KH 2 PO 4 </li><li> - 0,5 M NaCl </li><li> - 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </li></ul> 1M KH 2 PO 4 용액의 1리터 사용 13,4 ML 들어, 0,5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 5M NaCl 솔루션과 2ml의 100ml 1M K 2 HPO 4 용액의 86,6 ML. <table border="1"><tr><td></td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 / 제품 수량 : </td></tr><tr><td> DMEM (Dulbecco의 수정된 이글 중간 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 골드 </td><td> PAA </td><td> A15 - 151 </td></tr><tr><td> X - treme 진 구 DNA의 Transfection 시약 </td><td> 호슈 </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS Dulbecco의 인산은 식염수 1X를 버퍼 </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> 맙스 3 - (N - Morpholino) Propanesulfonic 산성 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> 수동적 용해 완충액 5 배 </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (MgSO 4 * 7H 2 O) </td><td> 시그마 - 올드 리치 로스 로스 </td><td> G7278 3054.2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O) NaCl EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 로스 로스 로스 로스 </td><td> 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 </td></tr><tr><td> Luciferin 반딧불 </td><td> Biosynth </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> Biosynth </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (Dithiothreitol) </td><td> 로스 </td><td> 6908.2 </td></tr><tr><td> ATP (아데노신 Triphosphate) </td><td> 호슈 </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

intracellular refolding assay

이 프로토콜은 셀 기반 시스템 및 억제 / 자극 활동 화합물의 가능한 영향의 분자 보호자의 효소 활동을 측정하는 방법을 설명합니다. 분자 보호자는 1 접는 단백질의 조절에 관여 단백질이며 열충격 2, 영양 기아와 화학 물질 / 독극물 3 노출과 같은 스트레스를 모욕시 세포 생존을 증진에 중요한 역할을했습니다. 이러한 이유로 보호자는 종양이 개발, 암 세포 4 chemioresistance뿐만 아니라 neurodegeneration 5와 같은 행사에 참여하기 위해 볼 수 있습니다. 이러한 효소의 활동을 억제하거나 자극하는 작은 분자 수있는 디자인 따라서 암 치료 7 neurodegenerative 장애 9 가장 공부 전략 중 하나입니다. 여기에서 설명한 분석은 특정 분자 보호자의 refolding 활동을 측정하고 광고의 효과를 연구하기위한 가능성을 제공합니다그 활동 ounds. 이 방법에서는 조사 분자 보호자의 유전자는 반딧불 루시페라제 유전자에 대한 발현 벡터 인코딩과 함께 transfected이다. 그것은 이미 denaturated 반딧불 루시페라제이 분자 보호자 10,11으로 refolded 수 있습니다 설명했습니다. transfection 제어를 정규화로 renilla 루시페라제 유전자에 대한 벡터 인코딩 transfected이다. 이 프로토콜에 설명된 모든 transfections는 HEK - 293 세포에서 X - treme 진 11 (Roche는)로 수행됩니다. 첫 번째 단계에서 단백질 합성은 cycloheximide와 세포를 치료에 의해 저해됩니다. 이후 전개 단백질은 30 분 동안 45 ° C에서 열 충격에 의해 유발됩니다. 37 복구시 ° C는 단백질이 다시 접혀들의 적극적인 형태로와 반딧불의 루시페라제의 활동이 읽기 - 아웃로 사용됩니다 더욱 빛이 생산되고, 더 많은 단백질이 원래의 형태를 다시 놓이게됩니다. 비 열 충격 전지 참조 (refolded 100 %로 설정됩니다루시페라제).

Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Refolding Assay at JoVE.com

Intracellular Refolding Assay

이 프로토콜의 열충격 후 세포내 단백질 refolding을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 활동에 영향을 미칠 수있는 분자 보호자 및 공동 요소 또는 혼합물과 같은 foldases을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 반딧불 루시페라제 활동은 보호자 역할 refolding 활동을 측정하는 기자로 사용됩니다.

세포 Refolding 분석

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K 조회수.  Karlsruhe Institute of Technology. 이 프로토콜의 열충격 후 세포내 단백질 refolding을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 활동에 영향을 미칠 수있는 분자 보호자 및 공동 요소 또는 혼합물과 같은 foldases을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 반딧불 루시페라제 활동은 보호자 역할 refolding 활동을 측정하는 기자로 사용됩니다.

비디오: Intracellular Refolding Assay

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

Astrocytes의 플라즈마 막 글로벌 세포내 칼슘 역학 니어 측정

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

연구

생물학

Aortic Ring Assay

Angiogenesis, the sprouting of blood vessels from preexisting vasculature is associated with both natural and pathological processes. Various angiogenesis assays involve the study of individual endothelial cells in culture conditions (1). The aortic ring assay is an angiogenesis model that is based on organ culture. In this assay, angiogenic vessels grow from a segment of the aorta (modified from (2)). Briefly, mouse thoracic aorta is excised, the fat layer and adventitia are removed, and rings approximately 1 mm in length are prepared. Individual rings are then embedded in a small solid dome of basement matrix extract (BME), cast inside individual wells of a 48-well plate. Angiogenic factors and inhibitors of angiogenesis can be directly added to the rings, and a mixed co-culture of aortic rings and other cell types can be employed for the study of paracrine angiogenic effects. Sprouting is observed by inspection under a stereomicroscope over a period of 6-12 days. Due to the large variation caused by the irregularities in the aortic segments, experimentation in 6-plicates is strongly advised. Neovessel outgrowth is monitored throughout the experiment and imaged using phase microscopy, and supernatants are collected for measurement of relevant angiogenic and anti-angiogenic factors, cell death markers and nitrite.

Angiogenesis, the sprouting of blood vessels from pre-existing vasculature, is associated with both natural and pathological processes. Here we demonstrate an aortic ring assay that allows angiogenic potentiators and inhibitors to be directly added to aortic rings in culture. Sprouting and neovessel outgrowth can be determined by inspecting the aortic rings over a period of 6-12 days.

대동맥 링 분석

Angiogenesis, the sprouting of blood vessels from preexisting vasculature is associated with both natural and pathological processes. Various angiogenesis ...

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase. Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed. However, RhoC GTPase is expressed in metastatic cancer cells at relatively low levels. Therefore, few RhoC-specific reagents have been developed. We have adapted a Rho activation assay to detect RhoC GTPase. This technique utilizes a GST-Rho binding domain fusion protein to pull out active RhoC GTPase. In addition, we can harvest total protein at the beginning of the assay to determine levels of total (GTP and GDP bound) RhoC GTPase. This allows for the determination of active versus total RhoC GTPase in the cell. Several commercial versions of this procedure have been developed however, the commercial kits are optimized for RhoA GTPase and typically do not work well for RhoC GTPase. Parts of the assay have been modified as well as development of a RhoC-specific antibody.

This protocol utilizes a pull down assay to determine the levels of active RhoC GTPase within cells.

RhoC GTPase 활성화 분석

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

광활성 GFP와 응용 프로그램의 세포 내 인신 매매 이미징

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

정제 및 아밀로이드 피 브릴로 리 폴딩 (그의)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged 재조합 Shadoo 단백질의 봉입체로 표현<em&gt; 대장균</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

형광 유전자 인코딩 ph 지시자 초파리 melanogaster 말 관 Epithelia에 광학 정량화의 세포내 pH

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

동적에 대 한 렌즈 무료 비디오 현미경 및 부착 세포 배양의 정량 분석

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

세포 Refolding 분석

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터