우리는 자금 지원을 위해 막스 플랑크 사회, 인간 프론티어 과학 프로그램 (HFSP)과 베링거 인 겔 하임 드퐁 감사합니다.

1. 재료 준비 <ol><li> FEP 튜브의 제조 <ol><li> 튜브를 통해 (아래에 언급 된 단계에서) 액체를 세척하고 뭉툭한 끝 정맥 (그림 2B)에 부착 된 주사기를 사용하여 FEP 튜브 (그림 2A)를 청소 주 1 :.. 절차 전반에 걸쳐 사용 장갑을 주 2 : 우리는 추천 캘리포니아의 조각에 튜브를 절단. 1 m 세로 병렬 사람들을 청소. <ol><li> 첫 번째 반복 1 M NaOH로 튜브를 세척하십시오. 그런 다음 0.5 M NaOH로 가득 50 ML의 원심 분리기 튜브에 튜브를 전송하고 10 분 정도를 초음파 처리. </li><li> DDH 2 O와 작은 분지에 폴리머 튜브를 이동 첫 번째 DDH 2 O로하고 70 % EtOH로 튜브를 세척합니다. </li><li> 그 후 70 % EtOH로 신선한 원심 분리 관에 FEP 튜브를 전송합니다. 다시 10 분 동안 원심 분리기 튜브를 초음파 처리. </li></ol></li><li> 조각으로 청소 FEP 튜브를 절단필요한 경우의 약 3 센티미터 (제브라 피쉬의 설치 및 이미징에 사용되는 일반적인 길이)와 똑 바르게. DDH 2 O (그림 2C)로 가득 찬 신선한 50 ML의 원심 분리기 튜브의 청소 FEP 튜브를 저장합니다. </li></ol></li><li> Tricaine 원액의 제조 <ol><li> 97.9 밀리리터 DDH 2 O.에서 400 밀리그램의 Tricaine (MS-222)을 용해하여 0.4 % Tricaine 주식 솔루션을 준비합니다 분말이 완전히 용해 후, 2.1 ㎖의 1M 트리스 (pH를 9.0)을 사용하여 7.0의 pH를 조정한다. 빛으로부터 솔루션을 보호합니다. -20 ° C에서 저장 분주 </li></ol></li><li> 3 % 메틸 셀룰로오스의 제조 <ol><li> 후술하는 바와 같이 FEP 튜브의 내측 코팅에 대한 3 % 메틸 셀룰로오스 용액을 준비한다. 약 60 ~ 70 ° C의 유리 병에 E3 (11)를 가열하고 메틸 셀룰로오스 분말의 적절한 금액을 추가합니다. 교반 막대를 추가하고 4 ℃에서 교반 즉시 솔루션이 30 ° C 이하로 냉각 될 때, 마지막 C에 Tricaine의 솔루션을 추가oncentration 100 ㎎ / L. 4 ° C에서 밤새 교반하십시오. </li></ol></li><li> 1.5 %의 제조 및 E3에서 0.1 % 아가 <ol><li> 유리 플라스크에서 E3의 정의 된 부피에서 저 융점 아가로 오스 분말의 적당량을 녹인다. 전자 레인지에서 혼합물을 가열하고 아가로 오스 솔루션은 동종 나타날 때까지 남아있는 결정하지 않고, 가끔 흔들어. </li><li> 1.5 ml의 반응 튜브에 0.1 % 아가 용액 1 ㎖ 분취 량을 준비한다. 분주 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li><li> 코트 플라스틱 배양 접시에 1.5 % 용액을 사용합니다. 아가 로스 층의 두께는 CA이어야한다. 2mm. 아가로 오스가 고형화 된 후 건조를 방지하는 층의 상부에 E3 매체를 추가한다. 코팅 접시는 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol></li><li> 제브라 피쉬의 제조 <ol><li> 기존 프로토콜에 따라 11, 12, 28.5 ° C에서 제브라 피쉬 (다니오 rerio) 성인과 배아를 유지하고이를 처리 할 수 있습니다. </li><li> 오후에 남성과 여성의 물고기를 설정하고 분배기를 사용하여 구분합니다. 물고기의 짝짓기 시간 다음 아침에 디바이더를 제거합니다. </li><li> E3 가득 접시에 배아를 수집하고 실체 현미경을 사용하여 검사합니다. </li><li> 24 HPF (또는 관심의 발달 단계)에서, 형광 식에 대한 제브라 피쉬 배아를 선택하고 신선한 E3와 함께 새로운 요리에 긍정적 인 사람을 전송합니다. </li><li> 조심스럽게 두 개의 날카로운 집게 (그림 2D 및 2E)를 사용하여 배아를 dechorionate. 열린 찢어 그것을 해내 융모막 두 번째 집게를 잡고 개최하는 최초의 집게를 사용하여 주 1 :. 실체 현미경의 도움으로이 단계를 수행합니다. </li></ol></li></ol> 2. 다층 실장 <ol><li> FEP 튜브 코팅 <ol><li> 주사기에 뭉툭한 끝 정맥을 연결합니다. 청소의 한쪽 끝으로 약 3 mm를 위해 조심스럽게 캐 뉼러를 삽입 한 조각을 잘라. 장갑을 사용하고 관의 굽힘 또는 압착을 방지 : FEP 튜브 (그림 2 층과 2G) 참고 1. </li><li> 3 % 메틸 셀룰로오스에 FEP 튜브의 자유 단부 담그고 용액으로 충진 튜브. </li><li> 천천히 주사기에 밀어 메틸 셀룰로오스를 놓습니다. 솔루션을 폐기하십시오. </li><li> . 반복 E3 주 1을 사용하여 2.1.2와 2.1.3 단계 : 코팅 튜브는 즉시 설치에 사용되어야합니다. </li></ol></li><li> 아가로 오스에 제브라 피쉬 전송 <ol><li> 열 블록에 70 ° C에 0.1 % 아가로 오스의 한 나누어지는을 가열한다. 소용돌이 반응 관 짧게와 38 ° C (그림 2H)으로 설정 열 블록에 전송합니다. </li><li> 열 블록으로부터 반응 관을 가지고이 잠시 진정하자. 다시 133-200 ㎎ / L와 소용돌이의 최종 농도 (그림 2I)에 Tricaine을 추가합니다. </li><li> dechorionated zebrafish의 배아 중 하나 transfe를 선택. R이 유리 파스퇴르 피펫 (그림 2J 및 2K)를 사용하여 예열 된 0.1 % 아가로 오스와 반응 관에 1 주 : 가능한 한 적은 추가 E3를 전송 해보십시오. </li></ol></li><li> 제브라 피쉬를 장착 <ol><li> 주사기에 연결된 FEP 튜브 (그림 2 L)와 배아를 차지합니다. . 튜브는 튜브의 한쪽 끝 부근에 위치 배아와 헤드가 튜브의 개방를 가리키는, 0.1 % 아가로 오스 완전히 채워 져야 주 1 : 물고기를 복용하기 전에 약간의 아가로 오스를 차지해야합니다. 주 2 : 거품을 방지하기 위해 주사기에 매우 부드럽게 당겨 주 3 :. 콘텐츠 (그림 2M 및 2N)의 누출을 방지하기 위해 수평 방향으로 튜브를 유지. </li></ol></li><li> 튜브를 연결 <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg"SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2. 다층 제브라 피쉬 배아에 장착.) 플루오르 에틸렌 프로필렌 준비. B 전에 케이블 드럼 (FEP) 튜브) 부착 무딘 끝 정맥 주사기. C) 청소 및 FEP 관. D, 24 HPF의 E) Dechorionation 컷 용융의 반응 관 내부의 아가로 오스 0.1 % 열 블록에 전송하는 동안의 제브라 피쉬 배아. F) 뭉툭한 끝 정맥에 관을 부착. G) 정맥 튜브 부착과 주사기. H) 나누어지는. I) 소용돌이로 FEP 튜브. M, N)에 아가로 오스 주변 용융 아가로 오스의 배아. L) 섭취로 태아의 유리 피펫을 사용하여 dechorionated 배아의 아가로 오스. J) 통풍. K) 전송 FEP 튜브 내부의 제브라 피쉬 배아 . <stroNG&gt; O) 아가로 오스 - 코팅 접시를 사용하여 튜브를 연결해) 표본과 정맥. P 사이의 튜브를 절단. Q)는 배아 연결 관. R) 금속 홀더의 최종 샘플 준비 내부. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig2highres.jpg" target="_blank">을하려면 여기를 클릭하십시오 큰 이미지를 볼 수 있습니다.</a> <ol><li> 정맥 (그림 -20) 오프 튜브를 잘라 면도날을 사용합니다. </li><li> 천천히 튜브 (그림 2 P)을 연결하는 플라스틱 접시에 1.5 % 아가로 오스의 전체 층을 통해 물고기가 들어있는 튜브의 끝을 붙여 주 1 :. 거품의 형성을 피하고 잡고 똑 바른 마개 표면을 얻으려고 . 관 정확히 수직 아가로 오스 표면에 주 2 : 약간 좋은 플러그를 얻기 위해 튜브를 돌립니다. </li><li> 건조를 방지하기 위해 E3와 1.5 ㎖의 반응 튜브에 장착 된 표본을 보관하십시오. 이 샘플은 N입니다이미지가 준비 아야. 이미징 전에 물고기가 플러그 (그림 2 분기 및 2R)의 상단에 바로 앉아 있는지 확인합니다. 또한 설치 매체에서와 같은 농도에서 이미징 챔버 내부의 매체에 Tricaine를 추가해야합니다. </li></ol></li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

이러한 빛 시트 현미경 같은 고급 현미경 기술은 몇 일의 과정을 통해 높은 공간적 해상도로 이미지 데이터를 기록 할 수있게뿐만 아니라 개선하기 위해 샘플 장착 기술이 필요합니다. 우리는 지브라​​ 피쉬 개발의 빛 시트 현미경에 장착 다층의 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 구현이 간단하고 우리는 매일 우리의 실험실에서 사용합니다. FEP 튜브 우리 실장 전략의 주요 구성 요소는 플루오르 중합체 에틸렌 프로필렌 (FEP)로 이루어지는 튜브이다. 우리는 주로하기 때문에 물과 비슷하기 때문에 이상적으로 물 침지 목표와 수성 매체를 필요로하는 표본 빛 시트 현미경 적합 1.338의 굴절률,의 FEP를 사용하기로 결정했다. 0.8 mm, 내경 0.4 mm의 벽 두께를 매우 잘 개발 제브라 피트와 튜브는, 1.6 mm에 적합한 전형적인 샘플 홀더로 사용될 수있다모세 혈관 제시 설치 방법을위한 우리의 첫번째 선택이다. 우리는 우리의 가정 기본 설정뿐만 아니라 상용 시스템 칼 자이스 현미경으로 &quot;Lightsheet Z.1&quot;에서 철저히 테스트 및 FEP 튜브, 장기적인 안정성을 제공하는 광학 성능에 최소한의 영향을 미칠 및 비 형광 10 것으로 나타났습니다. 그러나, 이들은 예를 들어,이 시험편을 맑게 다른 굴절률을 필요 샘플 애플리케이션에 적합하지 않다. 튜브뿐만 아니라 FEP 만들어진 포일은 직경과 두께의 다양한 사용할 수 있습니다. 또한, FEP는 260 ° C에서 용융하여 맞춤 샘플 설치 지원을위한 거의 무한한 가능성을 제공 할 수 있습니다. 중합체 튜브 클리닝 프로토콜 유용한 광학 품질을 보장​​하기 위해 몇 가지 단계를 포함 이유있는, 비 멸균 공급되는 경향이있다. 메틸 셀룰로오스와 코팅은 성장하는 제브라 피쉬 배아의 어떠한 부분이 폴리머 붙어 있는지 확인합니다. 0.1 % 아가로 오스에 대한 결정은, 아가 로스 및 메틸 셀룰로오스 (10)의 다른 농도의 증가율 및 부동성의 광범위한 검사에 기초한다. 0.1 % 이상의 아가 로스 농도는 이미 24 HPF의 지브라 피쉬의 성장 속도에 심각한 영향을 보였다. 또한 우리는 마취 약물 Tricaine의 낮은 복용량을 사용합니다. Tricaine 블록의 활동 전위, 따라서 뇌와 근육 사이의 신호 전달을 억제하고 근육의 수축 16를 표시하지 않습니다. 133-200 ㎎ / L의 농도는 24 ~ 72 HPF 사이에 제브라 피쉬의 충분한 고정을 보장합니다. 그러나 Tricaine 및 기타 마취 약물 우리는 심장 부종 등의 표시 농도 의존적​​ 부작용을 테스트했다. 또한 Tricaine 필요한 용량은 배아의 발달 단계에 따라 달라집니다. 따라서 우리는 이미지를 만들 발달 단계에 필요한 금액에 Tricaine 농도를 줄이는 것이 좋습니다. 최고의 performan을 보장하기 위해CE 및 부산물 독성의 형성을 방지, 새로 제조 또는 해동 Tricaine 원액이 사용하는 빛으로부터 보호하고 30 ℃ 이상으로 가열해야하는지 FEP 튜브에 임베딩은 특정 요구를 고려하여 설치 매체의 쉽게 수정 할 수 있습니다. 마음의 시간 경과 영상을 위해, 우리는 3 % 메틸 셀룰로오스 100 ㎎ / L Tricaine 대신 0.1 % 아가로 오스 및 설치 200 ㎎ / L를 사용하는 것이 좋습니다. 메틸 셀룰로오스 0.1 % 아가로 오스 따라서 자체적 높은 부동성을 제공하고 더 적은 Tricaine는 배아의 협착을 보장하기 위해 사용될 필요가보다 점성이다. Tricaine는 30 ° C 이상의 온도에 민감하고 또한 성능과 배아의 수의 경련 감소로 이어지는, 영상 실에서 매체에 의해 희석 될 수있다. 따라서, 장착 표본이 잠겨있는 영상 매체도 Tricaine을 사용해야합니다. 당신의 실험은 높은의 사용을 필요로하는 경우온도는, 우리는 관류 시스템을 사용하여 수동으로 또는 두 시간 점 사이 관과 주사기 하나 촬상 챔버에서 매체를 교환 권장합니다. 중요한 단계 샘플의 실장 공정 중에 중요한 단계는 튜브에 시료의 흡기 및 아가 플러그의 삽입이다. 섭취 후 변경 성가신 배아의 초기 위치를 정의한다. 다수의 시료를 탑재 할 수 있어야하고 설치 품질은 실체 현미경으로 관찰해야한다. 샘플 방향이 만족스럽지 않은 경우이 종종 배아를 왜곡으로, 시료를 그림과 플런저의 후속 움직임을 피할 수있는 속도를 변경하는 데 도움이 될 수 있습니다. 1.5 % 아가 플러그는 0.1 % 아가로의 누설을 방지 할 필요가있다. 튜브 내부의 플러그의 표면은 개발 중에 샘플 방향에 영향을주지 할 평평해야합니다. 좋은 서핑을 달성하기 위해ACE, 아가 로스 층의 상이한 두께를 테스트해야하고 튜브의 표면에 수직 인 아가로 끼워 넣을 필요가있다. 관을 조금 회전 튜브를 당기는 조심스럽게 접시에서 플러그를 해제합니다. 장착의 품질은 영상 전에 실체 현미경으로 확인해야합니다. 멀티 뷰 영상 빛 시트 현미경의 하나의 주요 장점은 멀티 뷰 영상, 시편을 회전 여러 각도에서 Z-스택을 획득하고 이후에 등록을 융합 할 수있는 기능입니다. 3D 공간에서 Z-스택을 등록하는 방법은 확립 신탁 마커 (17)로 샘플을 둘러싼 형광 비드를 사용하여 비드 기반 등록이다. 그러나이 방법은 같은 1.5 % 아가로 오스 등의 고체 설치 매체에 의존하기 때문에 다층가 여기에 제시된 실장 호환되지 않는 것 같습니다. 그러나 여러 다른 솔루션은 애플리케이션에 따라 작동한다. 첫째, 형광 구슬은 수획득 동안 시야에 있 아가 플러그에 통합 될 수있다. 둘째, 스테이지 위치는 형광 비드와 함께 1.5 % 아가로 오스 컬럼을 사용하여 실제 실험 이전에 보정 될 수있다. 셋째, 이러한 형광 핵으로서 대체 마커는 서로에 대해 Z-스택의 위치를​​ 식별하기 위해 사용될 수있다. 증발 일반적인 광 시트 현미경 설정은 매체의 증발에 오픈 샘플 챔버, 피할 수없는 리드를 사용합니다. 매체가 설치 매체의 증발을 제한하는 표본의 생존과 광학 및 샘플 사이의 올바른 굴절률을 위해 필수적이기 때문에, 우리는 증발을 방지하기 위해 다음 방법 중 한 가지 이상을 복용하는 것이 좋습니다. 우선, 챔버 내의 매체는 끊임없이 관류 시스템에 의해 교환 될 수있다. 둘째, 매체 수동 리필 할 수있다. 셋째, 챔버 덮개 또는가요 성 호일로 커버 될 수있다. <p클래스 = &quot;jove_step&quot;&gt; 산소 공급 중합체는 FEP 화학 큰 다양성을 견딜 수 있도록 개발하고, 따라서 강력한 화학적으로 불활성 가스에 nonpermeable이다 하였다. 다층 실장 산소의 경우에만 아가 플러그 및 아가 - 공기 계면을 관통하지만, 중합체 튜브를지지 않고 아가 1.5 % 마운팅에 비해 다층 실장에 산소 공급이 심각하게 낮은 경우에는 표시 될 남아있다. 제브라 피쉬 모폴로지가 다층 실장 영향 전에 그러나, 1.5 % 아가로 장착으로 약 두 시간 동안 사용될 수있다 장기 이미징 뛰어난 전체적인 솔루션이 될 것으로 보인다. 개발의 초기 단계 이미징 설치 다층 지금 제브라 피쉬 세 이상 24 HPF의 시간 경과 빛 시트 현미경에 대한 우리의 표준 임베딩 기술이되고있다. 그 외에, 우리는 또한 초기 단계의 배아의 이미징 폴리머 튜브를 사용합니다. 전자mbryos 그들의 chorions에 남아 1mm의 내경 FEP 관에 장착 및 E3로 채워진다. 제브라 피쉬는 자유롭게 융모막 안에 개발할 수 있습니다 여전히 잘 빛 시트 현미경을 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. 시야 제시 다층 샘플 설치는 제브라 피쉬의 실시간 발달 생물학에 대한 빛 시트 현미경의 잠재력을 소개하고 있습니다. 그것은 쉽게 광 투영 단층 촬영 (OPT) 및 다른 생물과 같은 다른 현미경 기술에 채용 될 수있다. 우리는 표준 크기 FEP 튜브가 특정 요구에 맞게 샘플 장착 기법으로 단지 첫 번째 단계입니다 있다고 생각합니다.

배아 동안 복잡한 이벤트와 상호 작용을 이해하기 위해, 발달 생물학의 연구는 점점 더 전체 생물의 생체 내 이미징에 하나의 세포와 장기의 현미경에서 움직이고있다. 전통적인 현미경 기술은 일반적으로 장기간에 걸쳐 급속 이벤트를 수행하기 위해 공간 및 시간 해상도를 제공하지 종종 표백 또는 샘플 1에서 광독성 효과를 일으킨다. 우리와 다른 빛 시트 현미경 (그림 1) 제브라 피쉬 2-4의 생체 내 이미징을위한 이상적인 기술로 발견했다. 검출 축에 직교하는 레이저 광의 얇은 시트와 샘플의 조명은 높은 공간 해상도뿐만 아니라 최소화 광 독성 5 빠른 광학 절편을 제공한다. 동시에, 이로 인해 독특한 광학적 배치에, 페트리 접시 나 배양 챔버를 사용하여 기존의 시료 실장 기술은 적합하지 않다. 일반적인 빛시트 현미경 세 번역 모터 및 회전 모터가 정확하게 위치 할 수 있도록 샘플을, 보류, 설정 및 모든 방향에서 볼. 과거 표본 빛 시트 현미경 종종 유리 모세관 6,7 내부 아가로 오스 1 ~ 2 %에 포함되었다. 이 경우 임베디드 시편 고화 아가 실린더는 촬상 물 같은 매체로 채워진 샘플 챔버 내로 유리 모세관 밖으로 압출된다. 아가로 오스는 물에 가까운 굴절률을 가지므로 물 보정 조명 및 광학 검출을 용이하게 생체 빛 시트 현미경 완벽하게 적합합니다. 샘플 경질 아가 로스에 국한되어 짧은 시간 동안 잘 묘화 될 수 있지만, 몇 시간 7,8위한 묘화 형태 발생 때 변경 및 배아의 성장을 강력하게 손상된다. 다른 응용 프로그램에 대한 솔루션은 비 침습적 장기 시간 경과 제브라 피쉬에게 9을 개발되었지만<html> 광 시트 현미경 촬상 전위는 종래의 1.5 % 아가로 오스를 매립하여 악용 할 수 없습니다. 따라서 우리는 zebrafish의 배아 (10)의 생체 빛 시트 현미경을위한 새로운 설치 전략을 개발했다. 샘플을 광학적으로 맑은 중합체 불소화 에틸렌 프로필렌 (FEP)로 이루어지는 관 안쪽 200 ㎎ / L의 Tricaine으로 0.1 % 아가로 오스에 장착된다. 내장 된 배아 인해 매체의 저점에 일반적으로 개발하고 있습니다. 동시에, FEP 튜브는 실험 기간에 대한 중간 샘플을 한정한다. 여기에서 우리는 기존의 프로토콜을 통해 장점을 반영하는 새로운 설치 기술 및 현재 데이터의 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 우리의 방법 지브라 피쉬 개발하여 연속 이틀 이상에 걸쳐 높은 공간 및 시간 해상도로 묘화 될 수 있음을 보여준다. 5 인치 &quot;FO : SRC =&quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig1highres.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/51119/51119fig1.jpg &quot;/&gt; 도 1. 광 시트 현미경의 원리. 불소화 에틸렌 프로필렌 (FEP)로 이루어지는 튜브 내에 장착 지브라 피쉬는 번역 및 검출 목적의 초점 평면을 통해 회전 될 수있다. 레이저 광 (빛 시트)의 얇은 시트를 검출 목적의 초점면에 조명 목적에 의해 계획 및 시편의 두께가 얇은 광학 부분을 조명한다. 방출 된 형광 신호를 검출 대물 의해 수집하고 카메라 칩에 기록된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1097">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:268px;">Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) tubes</td>
			<td style="width:143px;">Bola</td>
			<td style="width:113px;">S 1815-04</td>
			<td style="width:573px;">0.8 / 1.6 mm inner / outer diameter, other sizes available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Omnifix-F Solo 1 ml Syringe</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9161406 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Sterican Single-Use Cannula, blunt</td>
			<td style="width:143px;">B. Braun Melsungen AG</td>
			<td style="width:113px;">9180109</td>
			<td style="width:573px;">0.8 x 22 mm, other sizes available, outer diameter of cannula has to fit inner diameter of FEP tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:143px;">Corning</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 M NaOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M NaOH&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70% EtOH</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">E3 medium (for zebrafish embryos)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">1.5 ml Reaction Tube</td>
			<td style="width:143px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:113px;">3810X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Agarose, low gelling temperature</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>supplied as powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Greiner</td>
			<td>633180</td>
			<td>plastic, 94 x 16 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Tricaine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td style="width:573px;">synonyms:&#160; Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, MS-222, TS 222, Tricaine methanesulfonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">10x/0.3 W Microscope Objective Lens</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:113px;">HCX APO L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:143px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:113px;">iXon 885 EMCCD</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish

빛 장 현미경은 제브라 피쉬 배아 발달을 연구하는 이상적인 이미징 기술입니다. 때문에 최소한의 사진 독성 및 표백에, 그것은 특히 몇 일까지 많은 시간에 걸쳐 장기적으로 시간 경과 영상에 적합합니다. 그러나, 적절한 샘플 설치 전략은 감금 및 샘플의 정상적인 발달을 모두 제공이 필요합니다. 다층 설치, 광학적으로 명확한 관에서 낮은 농도의 아가로 오스를 사용하여 새 임베딩 기술은 지금이 한계를 극복하고 실시간 발달 생물학에 대한 빛 시트 현미경의 잠재력을 소개하고 있습니다.

Zebrafish의 혈관 개발 며칠에 걸친 영상 장기 빛 시트 현미경 다층 설치 전략의 장점을 설명하기 위해 13 제브라 피쉬 : 우리는 (GFP kdrl) Tg는 DPF (1)를 사용합니다. 목표는 이미지는 2 일간의 과정을 통해 전체 제브라 피쉬의 혈관의 개발이다. 제브라 피쉬 배아는 메틸 코팅 폴리머 튜브 내부의 아가로 오스 0.1 %에 장착되었다. 여기에, 제브라 피쉬는 설치 매체에 의해 제한되지 않고, 일반적으로 개발할 수 있습니다. 머리 꼬리 (그림 3)을 확장하고 혈관 싹이 방해받지 나타납니다 발생합니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig3.jpg" /> 그림 3. 제브라 피쉬의 혈관 개발 며칠에 걸친 영상. multila의 혈관13 제브라 피쉬 이틀에 걸쳐 빛 시트 현미경에 방해받지 않고 개발 : YER은 (GFP kdrl) Tg는 DPF (1)를 장착. 488 nm의 레이저 광 시트는 여기되어 형광 신호가 10X/0.3 W 및 대물 EMCCD의 카메라를 이용하여 검출 하였다. Z-스택은 인접한 4 개의 위치마다 10 분에 취득 이후 피지 15 스티치되었다. 시간 점의 부분 집합의 최대 강도 예측이 표시됩니다. 스케일 바 :. 500 μm의 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig3highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 초기 제브라 피쉬 배아의 영상 여기, 우리는 수정 후 첫날 이른 제브라 피쉬 배아의 빛 시트 현미경 장착 지원으로 FEP 튜브의 기능을 보여줍니다. 8 HPF의 Tg (H2A : GFP)은 14 제브라 피쉬 배아는 I와 E3 채워진 튜브 내부의 손상 융모막 장착 된1mm의 nner 직경. 즉, 융모막의 약간의 체결 결과. 배아 동안 모든 발달 과정은 설치에 영향을받지 최적으로 빛 시트 현미경을 사용하여 시각하실 수 있습니다. 이 예제에서, 우리는 12 시간의 과정 (그림 4)을 통해 표본을 이미지. 1.5 % 아가로 오스의 융모막하지 않고 기존의 설치를 사용하는 경우 등의 노른자와 중간 선을 따라 조직의 비후의 증가 신장 등의 초기 배 발생시 일반적인 형태의 변화는 억압 될 것이다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51119/51119fig4.jpg" /> . 초기 제브라 피쉬 배아의 그림 4 이미징의 Tg (H2A : GFP). 14 제브라 피쉬의 초기 배 발생을 통과한다. 488 nm의 레이저 광 시트 흥분 및 GFP 형광 신호가 검출되었다10X/0.3의 W 목표와 EMCCD 카메라와 함께. 두 개의 각도에서 Z-스택은 12 시간의 과정을 통해 매 3 분을 인수했다. 시간 경과의 부분 집합의 정규화 된 최대 강도 예측이 표시됩니다. 아직 마취가 사용되지 않았다으로 취득하는 동안 배아 꿈틀 19 HPF 결과에서 눈에 보이는 모션 블러,. 스케일 바 :. 150 μm의 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51119/51119fig4highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

제브라 피쉬의 개발은 배아가 낮은 농도의 아가로 오스와 광학적으로 명확한 폴리머 튜브에 포함 된 빛 시트 현미경과 일에 따라 할 수있다.

다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.6K 조회수.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  제브라 피쉬의 개발은 배아가 낮은 농도의 아가로 오스와 광학적으로 명확한 폴리머 튜브에 포함 된 빛 시트 현미경과 일에 따라 할 수있다. 

비디오: Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

와이드 필드 현미경을 사용하여 장기 이미징 포유 동물 세포

연구

생물학

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these acrylics do not bond to the bone, screws have been used as anchors. However, in small experimental animals like finches or mouse, their craniums are very fragile and can not successfully hold the anchors. In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium. Therefore, anchor screws are not required and surgical field can be reduced considerably. Past experiences show that the bonding effect maintains more than 2 months. Conventional resin's window of time when the materials are pliable and workable is a few minutes. However, the window of working time for these dental adhesives is significantly wider and adjustable.

In this report, we propose a new application of light-curing dental resins for mounting base of electrodes or microdialysis probes in chronic experiments. This material allows direct bonding to the cranium.

만성 실험에 장착 전극 또는 Microdialysis 프로브를위한 라이트 - 치료 치과 접착제 수지의 응용

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature and genome sequence database. Cultured Drosophila S2 cells, the product of disassociated 20-24 hour old embryos1, possess all these properties. Consequently, S2 cells are extremely well-suited for the analysis of cellular processes, including the discovery of the genes encoding the molecular components of the process or mechanism of interest. The features of S2 cells that are most responsible for their utility are the ease with which they are maintained, their exquisite sensitivity to double-stranded (ds)RNA-mediated interference (RNAi), and their tractability to fluorescence microscopy as either live or fixed cells.
S2 cells can be grown in a variety of media, including a number of inexpensive, commercially-available, fully-defined, serum-free media2. In addition, they grow optimally and quickly at 21-24&deg;C and can be cultured in a variety of containers. Unlike mammalian cells, S2 cells do not require a regulated atmosphere, but instead do well with normal air and can even be maintained in sealed flasks.
Complementing the ease of RNAi in S2 cells is the ability to readily analyze experimentally-induced phenotypes by phase or fluorescence microscopy of fixed or live cells. S2 cells grow in culture as a single monolayer but do not display contact inhibition. Instead, cells tend to grow in colonies in dense cultures. At low density, S2 cultures grown on glass or tissue culture-treated plastic are round and loosely-attached. However, the cytology of S2 cells can be greatly improved by inducing them to flatten extensively by briefly culturing them on a surface coated with the lectin, concanavalin A (ConA)3. S2 cells can also be stably transfected with fluorescently-tagged markers to label structures or organelles of interest in live or fixed cells. Therefore, the usual scenario for the microscopic analysis of cells is this: first, S2 cells (which can possess transgenes to express tagged markers) are treated by RNAi to eliminate a target protein(s). RNAi treatment time can be adjusted to allow for differences in protein turn-over kinetics and to minimize cell trauma/death if the target protein is important for viability. Next, the treated cells are transferred to a dish containing a coverslip pre-coated with conA to induce cells to spread and tightly adhere to the glass. Finally, cells are imaged with the researcher's choice of microscopy modes. S2 cells are particularly good for studies requiring extended visualization of live cells since these cells stay healthy at room temperature and normal atmosphere.

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Drosophila Schneider (S2) cells are an increasingly popular system for the discovery and functional analysis of genes. Our goal is to describe some of the microscopic techniques that make S2 cells such an increasingly important experimental system.

의 준비 Drosophila</em라이트 현미경을 위해> S2 세포

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

갑각류와 장기 치명적인 독성 시험 Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

겔의 표면에 성장 식물 뿌리의 가벼운 시트 형광 현미경

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, 장기 시간 경과 이미징을 위한 초파리 유충을 장착하는 방법

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.

샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.