이 내피 세포 배양 시스템의 사용은 혈류의 상황을 동화 할 수 있습니다. 그리고 이러한 상황으로, 우리는 세균 성 벡터의 식별및 또한 이 과정에 관여하는 세포 벡터의 확인을 포함하여 세균성 감염 과정을 분석할 수 있습니다. 이 기술은 또한 형태 발생 메커니즘에 미치는 영향을 포함하여 혈관 무결성에 세균 감염의 영향을 탐구하는 방법을 포장, 염증 반응및 면역 조절에.
이 기술은 내피 세포의 몇 가지 특별한 처리를 필요로하므로 시각적 설명은 단지 구두 설명보다 낫다. 이 방법은 내피 세포 분화, 상처 치유, 종양 창세기 및 혈관 신생과 같은 침투 혈관 시스템과 상관 되는 연구의 여러 다른 영역에 대한 통찰력을 제공합니다. 주요 단계 중 하나는 표준화된 세포 재배뿐만 아니라 1차 내피 세포의 정확한 취급입니다.
이 기술은 단지 구두 설명에 의해 명확 할 수없는 몇 가지 특별한 세포 배양 처리를 필요로한다. 먼저 깨끗한 벤치를 사용하여 멸균 환경에서 작업하십시오. 파이펫을 사용하여 2% 멸균 여과 된 돼지 젤라틴 PBS 용액의 100 마이크로리터를 온도 평형 채널 슬라이드의 단일 저장소에 주입합니다.
젤라틴 코팅 채널 슬라이드를 얇은 폴리스티렌 또는 스티로폼 플레이트에 놓고 1밀리리터 루어 주사기로 슬라이드 온도가 떨어지는 것을 방지하여 밀리리터 HUVEC 서스펜션당 5분의 1의 100 마이크로리터를 슬라이드에 추가하여 씨를 뿌리고 HUVEC를 경작시합니다. 채널 슬라이드를 HUVEC와 함께 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 60분 동안 배양합니다. 그 후, ECGMS 배지의 60 마이크로 리터로 채널 슬라이드의 양쪽 끝에 각 중간 저수지를 채웁니다.
섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 1시간 더 인큐베이션을 사용한다. 다음으로, 미세유체 펌프를 조정하기 위해 먼저 펌프 장치에 설정된 평형 관류를 연결하고, ECGMS 배지의 13.6 밀리리터를 채우고 펌프 제어 소프트웨어를 시작합니다. 유체 단위 설정의 메뉴에서 스크롤 창을 사용하여 적절한 관류 세트와 챔버 슬라이드 유형을 선택합니다.
중간 점도에 대한 소프트웨어에서 평방 센티미터 당 0.007 다이네 초를 선택합니다. 인큐베이터 바깥쪽에는 건조실리카 구슬로 채워진 유리 병을 기압 튜브에 연결합니다. 소프트웨어 메뉴에서 유량 파라미터를 선택하고, 압력을 40밀리바르로 설정하고, 연속 배지 흐름을 시작하여 액체 배지로 펌프 튜브를 플러시한다.
우리는 서브컨컬러재배 의 HUVEC를 사용하여 단단한 셀 부착을 보장하고 또한 시스템에서 기포를 꺼내고 펌프 시스템에 대한 독립적 인 전원 공급 장치를 사용하는 데 중점을 둡니다. 튜브 연결을 탭하여 기포를 제거하고 펌프 시스템에서 기포가 순환되지 않도록 하십시오. 채널 슬라이드를 연결하기 위해 펌프 제어 소프트웨어의 유동 순환을 중지하고 Luer 연결 근처의 튜브를 고정하여 중간 흐름과 관류 튜브를 보유합니다.
채널 슬라이드를 연결하여 기포를 피하십시오. 펌프 제어 소프트웨어 고급 탭에서 소프트웨어 도구 주기 작성자를 사용하여 흐름 재배에 원하는 전단 응력 주기를 프로그래밍합니다. 흐름 순환에 대한 전단 응력 수준을 프로그래밍하고 장기 관류를 시작합니다.
30분 동안 분당 5.44밀리리터의 유속도에 해당하는 평방 센티미터당 5개의 다인으로 시작하여 분당 10.85 밀리리터에 해당하는 평방 센티미터당 10dyne의 전단 응력에서 연속 유동을 시작합니다. 균형 잡힌 저수지 펌핑을 제어합니다. 연결된 채널 슬라이드를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에 연결된 채널 슬라이드로 유체 장치를 배치합니다.
현미경 소프트웨어 제어를 시작하고 적절한 필터 설정을 선택하여 형광 현미경 모니터링에 대한 원리 설정을 조정합니다. 미세한 시각화를 위해 유체 장치를 섭씨 37도 의 가열 챔버에 놓습니다. 미리 따뜻해진 현미경의 무대에 채널 슬라이드를 놓습니다.
히스타민과 박테리아를 주입하기 전에 세포 형태와 HUVEC 층의 무결성을 유동 순환에 제어합니다. 흐름 설정을 유지 관리합니다. 관류 관에서 순환하는 ECGMS 배지에 주입 포트를 통해 100 밀리머 히스타민 스톡 용액의 136 마이크로리터를 주입하여 내피 성 가능한 팔라데 몸에서 VWF의 방출을 유도한다.
다중 머기 폭스바겐F 현의 면역 불발 검출을 위해, ECGMS 배지의 순환 13.6 밀리리터에 PBS의 200 마이크로리터의 부피에 VWF 특정 FITC 컨쥬게이드 항체의 20 마이크로그램을 주입한다. HUVEC 세포 표면에서 생성된 폭스바겐F 현에 대한 공압코칼 부착물을 정량화하기 위해, 주입 포트를 사용하여 ECGMS 배지에 최대 1밀리리터의 최대 부피로 Pneumococci를 발현하는 밀리리터 RFP당 8번째 CFU에 1.35배 10배를 주입한다. 현미경 배율에 대한 63X 오일 침지 목표를 선택하고 Pneumococci를 발현하는 RFP 검출 필터를 사용하여 현미경 소프트웨어의 형광 필터 설정을 RFP 채널로 조정한다.
VWF 문자열에 대한 세균 부착의 정량화를 위해, 약 10 개의 형태 그대로 HUVEC를 포함하는 적어도 30 개의 대표 필드 뷰의 Z 스택의 스냅 샷을 만들고 Pneumococci의 양을 계산합니다. 면역형성 염색 전에 고정 후 세균 부착을 평가하기 위해, 흐름을 멈추고, 펌프 저수지에서 ECGMS 배지의 10 밀리리터를 제거하고, 5%의 파라포름알데히드로 보충된 PBS의 10밀리리터를 추가하고 원고에 따라 진행한다. 이 프로토콜에서, 원리 실험 단계는 세포 배양 플라스크에 있는 섭년소에 1 차적인 내피 세포의 사전 재배로 시작합니다.
그런 다음 셀을 젤라틴 코팅 채널 슬라이드로 시드됩니다. 박테리아는 한천 판에서 재배되며, 복잡한 액체 배지에서 중간 로그 단계에서 재배합니다. 미세 유체 세포 배양의 경우, 내피 세포를 가진 채널 슬라이드는 펌프 시스템의 유체 단위의 관류 튜브에 연결되고 세포 분화를 위한 일정한 흐름을 실시한다.
VWF 현의 생성은 FITC 표지 폭스바겐F 특이적 항체를 사용하여 면역 형광 검출에 의해 현미경으로 모니터링되는 평방 센티미터 당 10 dyne 초의 전단 응력에서 히스타민 주입에 의해 유도되었다. 순환 매체에 박테리아를 발현하는 적색 형광 단백질을 주입한 후, 폭스바겐에 대한 폐렴구균 부착물은 450나노미터에서 형광 방출에 의해 실시간으로 현미경으로 시각화되었다. PFA를 사용하여 세포의 고정 후, 차동 면역 형광 염색은 특정 감염 시점의 세균 부착의 시각화를 제공합니다.
이 절차의 가장 중요한 단계는 생리적 전단 응력 수준을 조정하고 극단적 인 펌프 압력 변동을 피함으로써 슬라이드 표면에 단단한 세포 부착을 보장하는 것입니다. 현미경 시각화 외에도, 이 기술은 새로운 항 감염의 약리학적 효과를 연구하고 혈관 감염 과정의 장기적인 결과를 분석하기 위해 적용될 수 있다. 이 펌프 시스템은 에어로졸을 통한 변속을 방지하기 위해 기압으로 세균 병원균을 침투시킵니다.
생물 안전 예방 조치를 따르는 것이 좋습니다.
