인간의 뇌 오르가노이드는 쉽게 조작되고 인간 설정과 다중 세포 유형의 적절한 상호 작용을 통합하는 시스템에서 질병을 연구하는 중요한 도구입니다. 이 기술은 신경 발달 장애, 독성 모욕, 뇌암의 성장과 치료를 포함하여 뇌의 수많은 질병을 연구하기 위해 적용 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 광범위한 뉴런 세포 유형을 가진 매우 재현 가능한 뇌 오르가노이드를 생성하는 능력입니다.
이는 대부분의 실험실에서 수행할 수 있는 매우 단순한 워크플로우를 사용하여 수행됩니다. 그리고 이들은 전문 성장 인자 또는 정의되지 않은 행렬의 영향없이 일시적인 적절한 방식으로 생산되어 매우 간단하고 비용 효율적인 시스템입니다. 시작하려면 100 마이크로리터의 매트릭스와 5.9 밀리리터의 얼음 차가운 덜벡코의 수정된 이글 매체 또는 F12 미디어를 15밀리리터 원추형 튜브에 결합합니다.
멤브레인 매트릭스의 1 밀리리터로 6웰 플레이트에 각각 잘 코팅합니다. 접시를 파라핀 필름으로 감싸고 섭씨 4도에서 하룻밤을 보관하십시오. 다음 날, 각 우물에서 과잉 미디어를 흡인, F12와 우물을 헹구고, 잘 당 mTeSR1 미디어의 두 밀리리터의 총 볼륨에 H9 hESCS를 추가합니다.
매주 세포를 배양합니다. 매일 2밀리리터의 mTeSR1 미디어를 공급하고 5%의 산소와 5%의 이산화탄소를 가진 섭씨 37도 저산소 인큐베이터에 플레이트를 배치합니다. 유리 도구를 사용하여 통로 사이의 배양에서 분화 세포를 제거합니다.
매일 미디어를 새로 고칩니다. 세포는 오르가노이드 생산을 위한 H9 세포를 활용하기 전에 4~6일 전에 통과되어야 한다. 세포를 통과하려면 DMEM F12 미디어로 헹구고 과도한 액체를 흡입하여 시작합니다.
헹구고, 프로테아제용액을 추가하고 40분 동안 세포를 배양하여 식민지가 우물 내에 떠다닌다. 다음으로, DMEM F12를 사용하여 세포를 세 번 세척하고 필요한 경우 조각을 작게 만들기 위해 적정염을 만듭니다. 그런 다음 세포를 4개의 6웰 플레이트 위에 대략 1-8 비율로 분배하고 배양기안에 판을 놓고 매일 먹일 수 있습니다.
4~6일 후에, 세포는 대략 80%의 합류에 도달합니다. 일반 인큐베이터로 전환합니다. 프로테아제스 스톡 솔루션을 hESCS의 각 6웰 플레이트당 DMEM 또는 F12 배지 5밀리리터에 스톡 솔루션 1밀리리터를 추가하여 작업 농도로 희석합니다.
흡인 및 세포 배양 매체를 제거한 다음 프로테아제용액으로 hESCS를 덮는다. 플레이트를 인큐베이터에 10-15분 동안 또는 식민지 가장자리가 모이고 매트릭스와 분리되기 시작할 때까지 플레이트를 완전히 반올림합니다. 접시를 기울이고 프로테아제용액을 흡수한 다음, DMEM 또는 F12 2밀리리터로 셀을 세번 부드럽게 세척합니다.
식민지가 행렬에 부착되어 있는지 확인합니다. 따라서 ES 세포의 조각이 적절한 크기이므로 적절한 시간 동안 분리되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 그들이 너무 짧은 시간 동안 거기에 있다면, 그들을 플러시하고 분해하는 것은 매우 어려울 수 있습니다.
그리고 만약 그들이 너무 오래 거기에 있다면, 그들은 실제로 그냥 세척 단계 동안 벗어날 수 있습니다. 신선한 mTeSR 매체의 약 1~1.5 밀리리터를 각 웰에 다시 추가하고 부드러운 파이펫팅을 사용하여 플레이트에서 세포를 50 밀리리터 원추형 튜브로 플러시합니다. 원래 크기의 약 1/30에 도달할 때까지 플레이트 내에서 hESCS를 흡입하고 분배합니다.
이제 식민지 클러스터는 250 ~ 350 마이크로 미터 크기의 조각을 닮았다. bFGF 없이 mTeSR 매체의 30 밀리리터를 포함하는 단일 초저 부착 T75 플라스크로 세포를 전송합니다. 다음 날, 라이브 셀이 모서리에 풀수 있도록 플라스크를 기울입니다.
플라스크 의 바닥에 부착 된 세포의 많은 수가있는 경우, 새로운 플라스크에 세포를 전송하는 10 밀리리터 파이펫을 사용합니다. 처음 며칠 동안 죽은 세포의 높은 인구가 있을 것으로 예상. 일단 세포정착, 미디어에 대 한 떠나 미디어와 죽은 세포 떨어져 흡인 10 라이브 세포를 포함 하는 미디어의 밀리 리터와 추가 20 낮은 bFGF 미디어의 밀리 리터 보충 30 bFGF의 밀리 리터 당 나노 그램.
이틀 후 셀을 확인합니다. 세포의 대부분은 건강하고 밝은 봐야한다. 그러나, 세포의 3 분의 1 이상이 어두운 나타나는 경우, 플라스크를 기울이고 교체 20 낮은 bFGF 미디어의 밀리리터와 미디어의 밀리리터 20 bFGF의 밀리리터로 보충 20 bFGF의 밀리리터 당 나노 그램.
셋째 날에는 미디어의 절반을 제거하고 bFGF의 밀리리터당 10 나노그램으로 보충된 hESC 미디어의 15밀리리터로 대체하십시오. 5일째에는 미디어의 절반을 신경 유도 매체 15밀리리터로 교체하십시오. 그 후, 격일로, 신경 유도 매체로 매체의 절반을 대체합니다.
3주 간의 문화가 끝나면 100X 페니실린-스트렙토마이신을 1X의 최종 농도로 미디어에 추가하십시오. 격일로 미디어의 절반을 새로 고칩니다. 이 프로토콜에서 형성 된 뇌 오르가노이드는 이러한 클러스터의 중심에 어두운 죽어가는 세포없이 크기가 밝고 유사하게 보였습니다.
세포는 점차적으로 bFGF 떨어져 짜냈다. 5일째, 그들은 신경 유도 매체에 배치되었고 문화 기간 내내이 미디어에 남아 있었습니다. 오르가노이드가 시간이 지남에 따라 더 크고 이렇게 어두워졌지만 신경 장미와 같은 구조는 확장되어 신경 분화의 개시를 나타내고 배아 신경 관의 특징을 포함합니다.
세포 내의 유전자 발현을 보다 심층적인 면모로 보기 위해 qPCR 분석이 수행되었다. 글루타민트 수송기 VLGUT1은 2주 반만에 표현되었고, 5주 만에 증가했으며, 5개월간의 문화를 통해 일관되게 유지되었습니다. 전뇌 마커 Foxg1은 문화권에서 5주까지 낮은 수준으로 표현되었다.
깊은 층 마커 Tbr1은 약 5 주 피크와 그 후 감소. 상층 마커 Satb2, 복부 마커 Eng1, 힌드뇌 척수 마커 Hoxb4, 그리고 올리고덴드로시테 마커 Olig2의 발현이 시간이 지남에 따라 모두 증가했습니다. 대조적으로, 줄기 세포 마커 Sox2는 시간이 지남에 따라 감소.
신경교 마커 GFAP는 5 주에 정점에 있었고 그 이후에 상대적으로 일정하게 유지되었습니다. 초기 단계 오르가노이드에서 ES 세포를 취급할 때 항생제 없이 자라기 때문에 오염을 피하고 일정에 따라 먹이를 주는 것을 기억하십시오. 이 절차에 따라, 단백질 발현 및 국소화를 위한 유전자 발현 및 면역 형광을 위한 정량적 RT-PCR와 같은 기술을 사용하여 오르가노이드를 평가할 수 있다.
이 기술을 사용하여, 우리는 저산소증 챔버에서 모델로 인간 신생아 저산소 상해의 양상을 완화하기 위해 작은 분자의 능력을 연구 할 수 있었다. 이러한 인간의 뇌 오르가노이드가 생체 내 마우스 실험과 유사하게 행동한다는 것은 중요합니다.
