We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

방법은 유 중수 에멀젼 방울에 기본 유사 분열 스핀들을 재구성하기 위해 여기에 존재하는 최근의 노력을 설명했다. 기하학적 경계 내에서 스핀들 어셈블리를 공부하는 것은 많은 장점을 제공한다. 주요 피드백 메커니즘 방추사의 미세 소관 그들이 조립 된 기하학적 제한 사이에 존재한다. 미세 소관은 유사 분열 스핀들 변위가 발생할 수 있습니다 기하학적 경계로 성장할 때 힘을 밀어 생성 할 수 있습니다. 또한, 물리적 인 장벽으로 성장하면 미세 소관 재해를 유발할 수있다. 또한, 밀폐 된 형상 내의 스핀들 조립체는 차례로 직접 미세 소관 증가율 (36)에 영향을 미치는 등의 튜 불린 등의 개별 구성 요소의 점진적인 고갈을 초래할 수있다. 이들은 여기에 설명 된 분석법을 이용하여 연구 할 수 스핀들 조립체의 모든 중요한 결정 요인이다. 설명 된 분석은 작은 농도 differe에 매우 민감하다액적 성분 NCES. 이것은 작은 농도 차이가 너무 느리거나 너무 빠른 미세 소관의 성장을 초래할 수 tubulin에 대한 경우이다. 이 경우, 미세 소관 성장률들은 여전히​​ 실험의 첫 번째 ~ 30 분 동안 온도를 조정함으로써 보정 할 수있다. 방추사 조립체 및 위치도 (피질) 힘 발생기의 농도의 변화에​​ 매우 민감하다. 이렇게 정제 된 성분의 농도, 순도 및 활성에 의존 할 가능성이 모든 새로 정제 된 단백질을 적정 신중해야한다. 또한, 특정한 절충은 분석의 특성에 따라, 촬상 설정에서 수행 될 수있다. 먼저, 수용성 형광 튜 불린 이량 높은 수준의 화상 개별 미세 소관을 어렵게 만든다. 미세 소관은 이상 성장 수용성 튜 불린 천천히 고갈 된 바와 같이, 신호 대 잡음비가 점점 높아져 individu의 이미징을 허용알 미세 소관. 오픈 시스템 설정과는 달리 기하 구속 상당한 표백 결과, 벌크 저장소 내의 형광 분자 산소 제거제 시스템 부품의 교환을 방지한다. 특히, 시간이 지남에 따라 스핀들 어셈블리 및 위치 모니터링, 그것도 강력한 탈산 소제 시스템의 존재하에 낮은 광도를 가진 이미지에 요구된다. 이들 방법은 시험 관내 간략화 스핀들 형 구조의 상향식 재구성을 가능하게한다. 여기에 소개 된 구성 요소에 더하여, 다른 많은 요인 등 3 바이폴라 스핀들 형성, 위치, 방향, 정형을, 영향을 설명 하였다. 이 시스템은 추가의 힘 발생기의 개별 및 결합 효과를 연구하기 위해 확장 될 수있다. 이 시스템에서 현재 존재하지 않는다 스핀들 형성에 중요한 기여는 유사 분열 염색체 수 있습니다. 유사 분열 염색질은로 표시되었습니다&#39;극성 토출 힘&#39;(3), (2) 염색질 바인딩 RanGEF RCC1 (38)에 의해 RanGTP 구배의 형성, (3) kinetochores (해중합과 상호 작용할 수있는 소위 생성 할 수 있습니다 (1) chromokinesins에 의해 직접 스핀들 형성 ) 미세 소관 (39) 및 (4) 반대 미세 소관 (40) 사이에-기계 스프링 역할을 할 수있는 염색질 자체. 마지막으로, 기술 시스템은 현재 제한된 시간과 공간 활동을 제어 도입 힘 발전기의 국산화를 제공합니다. 세포, 많은 스핀들 어셈블리 요소는 특정 구획에 지역화 또는 제한된 시간 창에서 활성화됩니다. 현저한 예는 구체적으로는 (C)의 후방 측에 충실 네인의 활성 인 엘레 한 세포 단계의 배아는 비대칭 스핀들 포지셔닝 및 세포 분열을 촉진한다. 이 시스템에서, 우리는 현재와 같은 t을 흉내 낸의 가능성을 모색하고 있습니다광학 유전 기술에서 차용 emporal 및 비대칭 활동에 사용하는 방법. 또한, AS는 C.의 경우와 엘레 배아와 단단한 세포벽과 세포는 많은 세포 유사 분열에서 반올림하지 않습니다. 기하학적 구속 형상은 스핀들 (41)에 작용하는 힘에 기초 영향을 미칠 것이다. 따라서, 잠재적으로 정형 및 에멀젼이 기억 42,43 방울 허용 더 복잡한 마이크로 유체 시스템의 사용뿐만 아니라 비 구형 방울 스핀들 어셈블리 및 위치를 재구성하는 것이 중요 할 것이다. 마지막으로, 조직에서 세포 - 세포 및 세포 - 기질 시그널링 및 첨부들은 상피 세포에서 관찰 된 바와 같이, 스핀들 방향 지시로 번역 될 수있는 외부 신호를 제공하고, 줄기 세포. 이러한 전문적인 측면 모두이 현재 연구에서 고려되지 않은 및 유사 분열 스핀들 assemb의 생체 -like 더 reconstitutions으로 구축하는 미래의 도전을 제공 할 수 있습니다LY 및 위치.

유사 분열 동안, 복제 된 게놈이 염색체 새로 형성된 딸세포 위에 자매 염색 분체의 동일한 분포가되도록하여 셀 적도 구성된다. 염색체 위치 및 분리는 두 개의 반대 중심체에서 발생하는 스핀들 미세 소관에 자신의 첨부 파일에 의해 매개된다. 충실 염색체 분배를 보장 외에도 방추사의 방향은 또한 세포 분열 평면 일을 지시. 세포 분열의 조정 방향은 개발의 여러 단계 동안 조직의 항상성이 필수적이다. 특히, 규제 유사 분열 스핀들의 위치는 휴대 내용의 비대칭 분포 될 수 있습니다 또는 다른 크기 2의 딸 세포를 생산하고 있습니다. 유사 분열 스핀들 조립 및 방향 의향에 시작 협력과 힘 발전소 3,4를 길항 사이의 복잡한 상호 작용에 의해 조율된다. 생성 된 힘은 B 구성OTH 당기고 미는 힘. 이러한 힘은 세포 외피와 스핀들 주소록에서뿐만 아니라 발 스핀들 내에 모두 기인 한 미소 관 역학뿐만 아니라 분자 모터 및 가교제 (도 1)에 의해 생성 될 수있다. 미세 소관은 세포 외피로서 단단한 구조에 대해 증가 할 때 가압력을 생성 할 수있다. 시스템 내에서 발생하는 총 저항력에 따라이는 유사 분열 스핀들 (낮은 힘)의 재배치가 발생하거나 미세 소관의 좌굴 또는 재앙 (높은 힘) 5-8를 트리거 할 수 있습니다. 길이가 9 미세 소관이 좌굴 강한 결정이므로 누름으로써 생성 될 수 힘의 크기는 미세 소관의 길이에 의존한다. 또한, 하나의 중심체에서 발생한 미세 소관, 다른 중심체 대해 초기 의향에 3,10- 중심체 분리 구동 제안 된 메커니즘을 밀 수있다. 광고에서성장 미세 소관에 의해 생성 된 힘을 추진, 미세 소관이 접촉 단부 셀 피질시 조건은 힘 (11)를 당겨 중재 할 수 있습니다. 여러 실험실에서 연구 피질 힘 발생기의 조절 활성을 생체 (1) 유사 분열 스핀들의 비대칭 위치 결정을 위해 필요한 것으로 나타났다. 이 당기는 힘에 필수는 (이하 &#39;네인&#39;이라 함) 피질 지역화 세포질 네인, 마이너스 엔드 감독 미세 소관 모터 단백질 8,12,13이다. 예를 들어, 효모, 피질 (14)을 따라 슬라이딩 모터에 의존하는 미세 소관의 미세 소관 격자 결과 대뇌 피질의 네인의 측면 상호 작용을 신진한다. 그러나, 피질 당기는 힘은 미세 소관 8 해중합에 말에 첨부 형성 네인의 ​​기능에 의해 생성 될 수있다. 미세 소관의 수축에 의해 생성 된 에너지는 일반적으로 높은 차수의 힘으로 이어질 수있다 (~ 50 PN (15 참조 </s최대&gt;)) 개별 모터 단백질에 의해 발생되는 힘보다 (~ 7-8 PN (참조. 16)). 해중합 미세 소관에 대뇌 피질의 네인의 최종에 첨부 신진 효모 (17)와 C에 스핀들 위치를 촉진 엘레 13. 모터에 의존하는 슬라이딩 및 미세 소관 해중합 구동 모두 대뇌 피질의 당기는 힘이 협력 또는 생체 내에서 상호 배타적 수 있는지 여부는 현재 알 수없는이다. 미세 소관 가압력과 네인 매개 피질 당기는 힘 이외에, 중심체의 위치는 다수의 다른 단백질에 의해 방추사 내에서 제어된다. 키네신 -5- 모터는, 예를 들면, 외측으로 슬라이딩 힘 18-20의 발생을 초래 평행 극간 소관 링크를 교차 할 수 사량 체로서 존재한다. 키네신-5 모터 가족의 일원은 C.를 제외하고, 연구 모든 진핵 생물의 중심체 분리 및 바이폴라 스핀들 조립에 필요한 엘레<html> (참고 21에서 검토). 또한, Ase1 / PRC1 가족의 확산 가교제는 생체 내에서 체외 22-27에서 극간 미세 소관의 미세 소관 영역을 중복으로 지역화하는 것으로 알려져있다. 중복 미세 소관 영역의 Ase1 중심의 확장에 의해 생성 된 힘은 시험관 (28, 29)에 키네신-14 매개 슬라이딩 힘을 상쇄 할만큼 크다. 세포에서 Ase1 / PRC1는 스핀들 midzone 25-27,30에 미세 소관 중복 영역 확산 가교제에 의해 발생하는 힘이 크게 스핀들 조직에 기여할 수 있다는 것을 암시 안정적인 형성을 위해 필요하다. 마지막으로, 유사 분열 염색질에서 힘과 kinetochores 다양한 경로 3을 통해 유사 분열 스핀들 어셈블리 및 위치에 영향을 미친다. 이들 구성 요소는 여기에 기재된 재구성 분석법의 일부가 아닌 때문에, 상세히 설명되지 않을 것이다. jove_content &quot;&gt; 다른 이론은 위에 설명 된 다른 분자 구성 요소와 세력이 주축 조립 및 위치에서 협력하는 방법에 존재하지만, 우리는 정량적 인 이해에서 멀리 아직도이다. 또한 실험에 살아있는 세포에, 정제 된 구성 요소와 생체 외 실험은 강력한를 제공 경로가이 목표를 달성 할 수 있도록. 여기에 우리가 기본 스핀들 유 중수 에멀젼 방울에서 재구성되는 최근 발표 된 방법의 적용 및 확장 버전 (로스 등. 31)에 대한 시각적 가이드를 제공하는로 시작 마이크로 유체 기술을 이용하여 부품의 최소 개수. 구면 방울이 분열 세포에 필적 크기로 생성된다. 이러한 액적 내에 정제 중심체와 튜 불린은 미세 소관 애 역학 연구 생성 및 애 - 애 상호 작용을 강제하기 위해 결합 될 수있다.하여 대뇌 피질 (예 : 네인 등) 간 극성 (예 : 키네신-5 / Ase1) 강제 발전기를 도입, 우리생체 내 상황을 닮은 시작 점점 복잡 스핀들 형 구조를 재구성한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Preparation of microfluidic chips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomask (Photomask on film substrate)</td>
			<td>Selba S.A. Switzerland</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025</td>
			<td>MicroChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron &#60;1-0-0&#62; 10-20 &#937;-cm, 500-550&#956;m, SSP, w/2 flats)</td>
			<td>WRS Materials</td>
			<td>4P0SSP-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater&#160;</td>
			<td>Polos</td>
			<td>SPIN150I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS pre-polymer RVT615 A+B</td>
			<td>Lubribond</td>
			<td>9481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corona treater</td>
			<td>Electro-technic products</td>
			<td>BD-20ACV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Microfluidic setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl))</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870285</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>650498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Laboport</td>
			<td>KNF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum chamber</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>Polypropylene Vacuum Desiccator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surfactant (Span80)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>M2800H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>24x60mm, thickness 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>26x76mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puncher</td>
			<td>Harris Uni-Core</td>
			<td>135840/135841/135843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Home made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brightfield Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>PMIRB&#160;</td>
			<td>Any inverted brightfield would suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure controler</td>
			<td>Fluigent</td>
			<td>MFCS-FLEX-4C-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK Tubing</td>
			<td>Cluzeau Info. Labo, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml)</td>
			<td>VWR, The Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Reconstituting spindle formation and positioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-647nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA - Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (DL-dithioltheitol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase (Catalase form bovine liver)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin (Tubulin from bovine brain)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain)</td>
			<td>Cytoskeleton Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (Guanosine-&#39;5-triphosphate, sodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#954;-casein (&#954;-casein from bovine serum milk)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airfuge (Air-driven ultracentrifuge)</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>CLS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Introducing spindle-assembly factors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (Adenosine-&#39;5-triphosphate, disodium salt hydrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate &#8805; 97% (enzymatic))</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0294</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.

이전 섹션에 제시된 방법은 유 중수 에멀젼 액 적의 형상을 한정하여 복잡성이 증가함에 따라, 스핀들 형 구조의 재구성을 허용한다. 이 섹션에서는 성적이 분석의 능력을 보여 대표적인 결과를 설명합니다. 바이폴라 스핀들 조립 될 때 유사 분열 동안, 세포는 인간 세포에 대해 측정 된, 약 15 ㎛의 직경을 갖는 구체를 형성하는 라운드. 이 특성 유사 분열 세포 형태는 제한하고 모두 스핀들 크기와 방향 (35, 36)를 지시하는 기하학적 경계를 제공합니다. 미세 유체 기술은 정확하게 살아있는 세포에서 관찰 된 상황과 유사하기 때문에 체외에서 유사 분열 스핀들 상향식 재구성을 허용 기하 구속의 레벨을 제공한다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-미세 소관의 성장이 기하학적 경계에 의해 제한되는 경우 페이지 = &quot;1&quot;&gt; 미세 소관의 과꽃은 이미 그 자체로 복잡한 행동을 할 수있다. 미세 소관이 증가함에 따라, 새로운 튜 불린 이량 체의 혼입에 의해 생성 된 가압력은 에멀젼 소적의 대향 측면에 두 중심체를 구동한다. 처음에는 중심체 자유롭게 제한 볼륨 (그림 4a, 왼쪽 패널) 내에서 확산. 약 20 ~ 30 분 후, 첫 번째 미세 소관은 미세 소관은 모든 방향으로 피질에 성장 표시 및 중심체 확산이 제한된다됩니다. 중간 길이 (액적 직경의 약 50 %)의 미세 소관과 과꽃은 (입체), 다른 중심체와 피질 서로 밀어 미세 소관으로, 각각 다른 물리 칠 수 있습니다. 이것은 서로 (그림 4a, 가운데 패널)을 반대하는 두 개의 중심체 전형적인 &#39;양극&#39;스핀들과 같은 배열을 초래한다. 미세 소관은 액적 직경의 ~ 50 % 이상 증가하는 경우미터는 중심체는 방울 피질 (그림 4a, 오른쪽 패널)을 따라 성장하는 미세 소관으로, 액체 방울의 반대 경계에 더 밀어 얻을. 이들 분석에서 미세 소관 성장률 온도-tubulin의 농도 모두에 매우 민감하다는 것이 중요하다. 핵이 처음 발견 될 때 정상 상태 애 위치에 도달하면이 매개 변수는 따라서 강력하게 시간에 영향을 미칠 것입니다. 세포에서 대뇌 피질의 당기는 힘은 미세 소관 플러스 엔드 및 피질 관련 네인 사이의 부하 베어링 첨부 파일의 형성을 통해 생성된다. 동물 세포에서이 협회는 Gαi 1의 N 말단 미리 스토 일화를 통해 세포막을 대상으로하는 Gαi / LGN / NUMA 단지에 따라 달라집니다. 이러한 재구성 분석법에서 Gαi / LGN / NUMA 착물의 요구를 직접 통해서 비오틴 네인 지질에 결합하여 우회비오틴 - 스트렙 트 아비딘 - 비오틴 복합체의 형성. 이 채권은 상대적으로 안정적 (K D ~ 10 -14 M) (37)이며, 빠르게 형성 (일반적으로 미세 소관의 핵 명백한되기 전에, 에멀젼 액적 형성 후 10 분 이내) (그림 4B). 네인의 부재에서, 중심체가 액적 피질 (도 4c)의 양측에 가압되는 반면 피질 네인의 존재 중심체는 일반적 이상의 중앙 위치를 유지한다. 우리는이 방지하고 미세 소관 추진 세력에 대항 두 가지 효과의 결과이다 추론. (1) 네인 직접 미세 소관의 재해하여 미세 소관의 길이를 제한하는 과도한 미세 소관의 좌굴을 방지하고, (2) 대뇌 피질의 당기는 힘이 애 - 애 스터의 반발 세력에 대항 개별 과꽃 8에 그물 중심 세력으로 이어질를 촉진한다. Ase1는 F를 유도 확산 성 가교제경향 orces는 반 평행 미세 소관 (29)의 중첩 영역을 증가시킵니다. 이과 일치는, (네인 및 부재)를 Ase1의 존재 중심체는 Ase1이 극간 미세 소관 (그림 4D)를 번들로 제공하는 현지화와 가깝게 찾을 수 있습니다. 키네신-5 가족의 구성원은 (소개 참조) 스핀들 내에서 추진하는 힘을 제공하여 중심체 분리를 구동한다. Cut7합니다 (S. pombe 키네신 -5- ortholog)의 존재 하에서조차 Ase1 중심체 (도 4E)의 존재하에 에멀젼 소적의 양측에 가압된다. 피질 간 극성 동력 발전기를 결합함으로써, 복잡도의 레벨은 상기 바이폴라 결국 분열 스핀들 조립체의 포괄적 인 이해에 이르는 이들 실험에서 증가 될 수있다. 이러한 결과의 상세한 정량적 설명은 미래에 사용할 수 있습니다 (로스 외., 준비 원고). <p class="jove_content" fo:keeP-together.within 페이지는 = &quot;1&quot;&gt; 시간 고정 순간에 중심체의 위치를​​ 관찰하고, 미세 소관의 관측 길이 그들의 행동 관련 외에도 가치있는 정보를 통해 위치 결정 처리를 수행하여 얻을 수있다 시각. 노출 시간 및 레이저 강도를 감소시킴으로써, 단지 ~ 30 % 표백 적어도 1 시간 동안 2 분 간격으로 애 위치 결정을 수행하는 것이 가능하다. 이 중앙 집중화를 통해 자유롭게 확산 중심체에서 애 조립 및 위치 모니터링 (0 분). 수 (12 분.) 분산 과꽃 (36 분 추가) (도 5c)에. 이것은 정상 상태 동작과 스핀들 조립 속도론 모두의 연구를 용이하게한다. 동일한 샘플의 서로 다른 내용으로 방울을 조합함으로써, 예를 들면, 가능한 직접 (도 5b)와 피질 힘 발생기 않고 물방울 중심체 위치 스핀들 조립체 동력학과 비교된다. 그림 1 : 힘은 유사 분열 스핀들에 작용하는 여러 힘 생성 분자는 스핀들 형성 및 위치를 촉진하기 위해 유사 분열 스핀들의 미세 소관에 작용한다.. 셀 피질로 성장 미세 소관은 중심체의 미는 힘을 생성합니다. (보라색) 두피 네인은 해중합 미세 소관을 캡처하고 중심체에 당기는 힘을 생성합니다. PRC1 / Ase1 가족의 가교제가 힘을 슬라이딩 바깥쪽으로 반대 생성하는 반면, 스핀들 내에서 키네신-5 / Cut7 모터 단백질, 반 평행 미세 소관에서 바깥쪽으로 슬라이딩 힘을 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> 그림 2 :. 4 마이크로 유체 칩을 포함하는 4 인치 포토 마스크의 미세 유체 칩 설계 (A) 디자인. (B)는 단일 칩의 상세한 표현. 칩은 하나의 출구 채널 및 먼지 필터 뒤에 세 개의 유입 채널을 포함한다. 입구 채널 (1)이 물 단계를 포함 지질 / 오일 상 및 제 3 채널이 채널은 추가적인 지방 / 오일 상으로 형성된 방울을 희석 할 수있다. (C) (상단과 하단에서 오는) 지질 / 오일 위상 (왼쪽에서 오는) 물 위상에 맞는 접합의 상세한 표현입니다. 교차로에서 물방울이 형성되고 오른쪽에있는 출구 통로쪽으로 흐른다. (D) 2 μm의 채널 먼지 필터의 상세한 표현입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> 그림 3 :. 유 중수 에멀젼 액적 형성을위한 방법론 (A) 밝은 필드 현미경 미세 유체 칩과 마이크로 유체 관. 모두 물과 지방 / 오일 상 관이 각각 칩 입구 (1)과 (2)에 접속된다. 발수 지질 / 오일 위상이 충족 마이크로 유체 칩 (B) 제한. 압력을 변화시킴으로써, 소적 크기는 조절 될 수있다. PDMS 코팅 플로우 셀 (C) 설계. 플로우 셀에 방울을 넣은 후, 구단은 추가 Valap 폐쇄된다. (D)의 액적 형성의 회로도. 방울 중심체, 튜 불린 및 방추사 형성에 필요한 추가의 성분을 캡슐화하는데 사용된다. 대뇌 피질의-네인 타겟팅 (E) 도식. 바이오틴 (바이오) 네인은 스트렙 타비 딘 (STRP)를 통해 바이오틴 지질을 대상으로한다. <a= &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;HREF&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> 그림 4 :. 복잡성 증가와 스핀들 - Reconstitutions의 대표 결과 (A), 짧은 중간, 긴 미세 소관의 예를 보여주는 두 개의 중심체가 포함 된 물방울의 최대 강도 예측. 중심체와 미세 소관은 10 % HiLyte 488 튜 불린 표지의 첨가에 의해 가시화된다. 스케일 바는 10 μm의 =. (- 왼쪽)와 스트렙 타비 딘 (STRP)의 존재 (+, 오른쪽)이 없을 GFP - 비오틴 네인 - TMR의 (B) 버전. 대뇌 피질의 GFP - 비오틴 - 네인 - TMR의 (오른쪽 +,) - (왼쪽) 또는 존재 (C) 미세 소관의 애의 부재에 위치. (D) 미세 소관의 애 (왼쪽 패널, GREEN Ase1의 존재) 위치 (가운데 패널, 레드). Ase1 및 Cut7 (키네신-5) (중간 패널, 레드)의 존재 (E) 미세 소관의 애 (왼쪽 패널, 녹색) 위치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> 그림 5 : 체외에서 이미징 애 위치 역학 (A) 몇 시간까지 액적 이미징을 할 수있는 PDMS 컵의 디자인.. (B) 생성, 저장 및 액적 이미징 형광 덱스 트란의 부재 (왼쪽) 포함 (우) (알렉사 647)에 의해 도시 된 다른 내용을 포함하는 (송신). (C) 60 분의 시간 경과의 단일 평면 이미지 (2 분 간격) 광고의 Z-스택 (2 μm의 거리)에서 촬영하나의 중심체를 포함 roplet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

구형 에멀젼 방울의 기본 유사 분열 스핀들의 재구성

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

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9.7K 조회수.  Delft University of Technology. The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.

비디오: Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Title Cell Encapsulation by Droplets

흩뿌려진의 제목 셀 캡슐화

연구

생물학

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the richness of biological information it provides. MR does not require any ionizing radiation and can noninvasively provide higher resolution and better signal-to-noise ratio in comparison to other tomographic or spectroscopic modalities. In this protocol, we will focus on small animal MR imaging and MR spectroscopy (MRI/MRS) to noninvasively acquire relaxation weighted 1H images of mouse and to obtain 31P spectra of mouse muscle. This work does not attempt to cover every aspect of small animal MRI/MRS but rather introduces basic procedures of mouse MRI/MRS experiments. The main goal of this work is to inform researchers of the basic procedures for in vivo MR experiments on small animals. The goal is to provide a better understanding of basic experimental procedures to allow researchers new to the MR field to better plan for non-MR components of their studies so that both MR and non-MR procedures are seamlessly integrated.

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

This work describes basic procedures of noninvasive small animal MRI and MRS in vivo.

비침 투 VIVO에서 스몰 애니멀 MRI 및 MRS : 기본 실험 절차

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, including transcription factors (e.g. nuclear receptors, p53) and protein kinases (e.g. Src, Raf, Akt kinase) involved in cell cycling, tumorigenesis, apoptosis, and multiple eukaryotic signaling pathways 1,2. Of these many 'client' proteins for hsp90, the assembly of steroid receptor&bull;hsp90 complexes is the best defined (Figure 1). We present here an adaptable glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitation assay and in vitro GR&bull;hsp90 reconstitution method that may be readily used to probe eukaryotic hsp90 functional activity, hsp90-mediated steroid receptor ligand binding, and molecular chaperone cofactor requirements. For example, this assay can be used to test hsp90 cofactor requirements and the effects of adding exogenous compounds to the reconstitution process. 
The GR has been a particularly useful system for studying hsp90 because the receptor must be bound to hsp90 to have an open ligand binding cleft that is accessible to steroid 3. Endogenous, unliganded GR is present in the cytoplasm of mammalian cells noncovalently bound to hsp90. As found in the endogenous GR&bull;hsp90 heterocomplex, the GR ligand binding cleft is open and capable of binding steroid. If hsp90 dissociates from the GR or if its function is inhibited, the receptor is unable to bind steroid and requires reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex before steroid binding activity is restored 4 . GR can be immunoprecipitated from cell cytosol using a monoclonal antibody, and proteins such as hsp90 complexed to the GR can be assayed by western blot. Steroid binding activity of the immunoprecipitated GR can be determined by incubating the immunopellet with [3H]steroid. 
Previous experiments have shown hsp90-mediated opening of the GR ligand binding cleft requires hsp70, a second molecular chaperone also essential for eukaryotic cell viability. Biochemical activity of hsp90 and hsp70 are catalyzed by co-chaperone proteins Hop, hsp40, and p23 5. A multiprotein chaperone machinery containing hsp90, hsp70, Hop, and hsp40 are endogenously present in eukaryotic cell cytoplasm, and reticulocyte lysate provides a chaperone-rich protein source 6. 
In the method presented, GR is immunoadsorbed from cell cytosol and stripped of the endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery using mild salt conditions. The salt-stripped GR is then incubated with reticulocyte lysate, ATP, and K+, which results in the reconstitution of the GR&bull;hsp90 heterocomplex and reactivation of steroid binding activity 7. This method can be utilized to test the effects of various chaperone cofactors, novel proteins, and experimental hsp90 or GR inhibitors in order to determine their functional significance on hsp90-mediated steroid binding 8-11.

An in vitro method for preparing functional glucocorticoid receptor (GR)&#x2022;hsp90 protein complexes from purified proteins and cellular lysates is described. The method utilizes immunoadsorption of recombinant GR followed by salt-stripping and protein complex reconstitution. The importance of cofactors and buffer conditions are discussed, as are potential method applications.

스테로이드 수용체의 생화 학적 리간드의 Reconstitution • Hsp90 단백질 단지와 재가입 바인딩

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle microtubules to prevent anaphase onset until the chromosomes are properly connected. Cells use this mechanism to prevent aneuploidy or genomic instability, and hence cancers and other human diseases like birth defects and Alzheimer's1. A number of the SAC components such as Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10, Rod and Aurora B kinase have been identified and they are all kinetochore dynamic proteins2. Evidence suggests that the kinetochore is where the SAC signal is initiated. The SAC prime regulatory target is Cdc20. Cdc20 is one of the essential APC/C (Anaphase Promoting Complex or Cyclosome) activators3 and is also a kinetochore dynamic protein4-6. When activated, the SAC inhibits the activity of the APC/C to prevent the destruction of two key substrates, cyclin B and securin, thereby preventing the metaphase to anaphase transition7,8. Exactly how the SAC signal is initiated and assembled on the kinetochores and relayed onto the APC/C to inhibit its function still remains elusive.
Drosophila is an extremely tractable experimental system; a much simpler and better-understood organism compared to the human but one that shares fundamental processes in common. It is, perhaps, one of the best organisms to use for bio-imaging studies in living cells, especially for visualization of the mitotic events in space and time, as the early embryo goes through 13 rapid nuclear division cycles synchronously (8-10 minutes for each cycle at 25 &deg;C) and gradually organizes the nuclei in a single monolayer just underneath the cortex9.
Here, I present a bio-imaging method using transgenic Drosophila expressing GFP (Green Fluorescent Protein) or its variant-targeted proteins of interest and a Leica TCS SP2 confocal laser scanning microscope system to study the SAC function in flies, by showing images of GFP fusion proteins of some of the SAC components, Cdc20 and Mad2, as the example.

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

The kinetochore is where the SAC initiates its signal monitoring the mitotic segregation of the sister chromatids. A method is described to visualize the recruitment and turnover of one of the kinetochore proteins and its coordination with the chromosome motion in Drosophila embryos using a Leica laser scanning confocal system.

생활에서 보여주는 동적 Kinetochore 단백질 행동과 염색체 모션으로 Mitotic 검사 점 유학<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytial 태아

The spindle assembly checkpoint (SAC) mechanism is an active signal, which monitors the interaction between chromosome kinetochores and spindle ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has been used to study protein turnover in many cellular contexts, including the cell cycle and signal transduction pathways1-3. Herein, a method is described for isolating Xenopus egg extract that has been optimized to promote the degradation of the critical Wnt pathway component, &beta;-catenin. Two different methods are described to assess &beta;-catenin protein degradation in Xenopus egg extract. One method is visually informative ([35S]-radiolabeled proteins), while the other is more readily scaled for high-throughput assays (firefly luciferase-tagged fusion proteins). The techniques described can be used to, but are not limited to, assess &beta;-catenin protein turnover and identify molecular components contributing to its turnover. Additionally, the ability to purify large volumes of homogenous Xenopus egg extract combined with the quantitative and facile readout of luciferase-tagged proteins allows this system to be easily adapted for high-throughput screening for modulators of &beta;-catenin degradation.

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

A method is described for analyzing protein degradation using radiolabeled and luciferase-fusion proteins in Xenopus egg extract and its adaptation for high-throughput screening for small molecule modulators of protein degradation.

β-catenin의 저하의 재구성<em&gt; Xenopus의</em&gt; 계란 추출

Xenopus laevis egg extract is a well-characterized, robust system for studying the biochemistry of diverse cellular processes. Xenopus egg extract has ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

삼투 물 투수 계수 (P 측정<sub&gt; F</sub&gt;) 구형 세포 : 예를 들어 식물 절연 원형질체

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

식물과 녹조류의 빛 수확 단지의 체외의 재구성에

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.