이 절차의 목적은 생체 내 의 마이크로 튜블러 조직 과 역학을 평가하는 것입니다. 뉴런은 뚜렷한 축축, 수지상 및 시냅스 구획을 가진 편광 세포이며, 그들의 근본적인 세포골격에 의해 유지됩니다. 마이크로 투부는 신경 세포 골격의 대부분을 형성하고, 역학및 방향은 신경 발달과 성숙 도중 중요한 사건을 결정합니다.
마이크로튜블러는 알파및 베타 튜룰린 이종수로 구성되어 있으며, 본질적으로 매우 역동적인 플러스 엔드와 안정적인 마이너스 엔드로 양극화됩니다. 플러스 엔드에서 중합 하는 동안, 최종 결합 단백질의 다중 분자 복합체, 일시적으로 프로토 필라멘트와 연결 하 고 tubulin dimers의 조립을 촉진. 이 기술은 우리가 생체 내에서 신경 마이크로 투튜를 시각화하는 데 도움이 될 것입니다.
이 기술을 사용하여 C.elegans 뉴런의 개발 및 재생 중에 동적 마이크로튜부의 방향 과 다른 매개 변수를 결정할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 감각 신경에 있는 microtubule 역학을 시각화하기 위하여 이 기자를 이용합니다. 그러나, 하나는 이 세포에 있는 동적 microtubules를 구상하기 위하여 근육과 피부와 같은 그밖 세포 모형에서 이 기자를 표현할 수 있습니다.
여기에 GFP에 EBP와 같은 형광으로 표지된 최종 결합 단백질은 혜성으로 나타납니다. 이 혜성의 역학은 마이크로 튜부툴의 동반 성장과 상관 관계가 있으며, 마이크로 튜블러 역학 및 방향을 측정하는 주요 지표입니다. 특정 세포 유형에서 이러한 혜성을 관찰하기 위해, EBP-2 및 GFP의 DNA를 가진 전환유전자는 특정 프로모터의 밑에 표현된다.
PLM 뉴런에서발현을 위해, 이러한 트랜스진은 프로모터를 위한 메이크 하에 표현된다. 이 형질 전환 벌레는 분류 또는 장착하기 전에 형광이 설정된 스테레오 현미경으로 볼 수 있습니다. 이미징 EBP 혜성에 대한 웜을 장착하기 위해 M9 버퍼에서 10%의 아르고를 만듭니다.
유리 슬라이드에 한 방울을 놓습니다. 또 다른 슬라이드는 패드로 고성필름으로 드롭을 누르는 데 사용됩니다. 우리는 0.1 미크로넨, 폴리스티렌 구슬을 장착 매체로 사용하고, 몇 가지 웜을 골라 비드 용액에서 다시 일시 중단합니다.
벌레를 고정시키기 위해 덮개 슬립을 데렵하고 이미징을 위해 촬영됩니다. 장착된 것들은 고해상도 이미징을 위한 카메라로 모든 형광 현미경으로 이미지될 수 있습니다. 설정은 빠른 획득 및 감소 사진 표백 및 사진 독성을위한 회전 디스크 장치가 장착되어 있습니다.
슬라이드는 무대에 보관되며 웜 필드는 밝은 필드 조명을 사용하여 초점을 맞추고 중심을 이시합니다. 5X 또는 10X와 같은 낮은 배율 목표를 이 용도로 사용할 수 있습니다. 웜은 동일한 조명을 사용하여 63X와 같은 높은 배율 목표에 다시 초점을 맞출 수 있습니다.
이 목표는 혜성의 이미징에 대한 최적의 공간 해상도를 제공합니다. PLM 뉴런의 고정 된 중심은 Prum의 과도한 빛 노출 및 사진 표백을 방지하기 위해 형광 조명 하에서 수행됩니다. 이미지 수집을 위해 사이트에서 소프트웨어를 보내보냅니다.
브라이트필드 채널에서 라이브 이미징 구성을 사용하여 웜의 꼬리 영역을 집중하고 뷰 필드에 중심을 둡니다. 이어서 488 나노미터 의 발광광광을 이용한 광 이미징 구성을 사용하여 PNM 뉴런의 초점을 맞추고 있다. 시간 경과 획득의 경우 노출 시간, 시간 경과 시간 경과 및 프레임 사이의 간격이 이미징의 시간적 기술을 정의하는 실험 설정이 만들어집니다.
정량적 측정을 위해 EBP 혜성의 일부 영화를 오픈 소스 소프트웨어인 Image J에서 분석해야 합니다. 획득한 시간 경과는 영화로 미리 볼 수 있는 다중 이미지 가닥으로 열립니다. 이 특정 시간 경과에서 혜성은 PLM 뉴런의 세포 체, 전방 및 후방 과정에서 볼 수 있습니다.
세포 체에서 멀리 이동 하는 혜성 플러스 엔드 아웃으로 분류 됩니다., 그리고 세포 본체쪽으로 이동 하는 그 마이너스-엔드 아웃으로 분류 됩니다. 분석을 시작하려면 분할 된 선이 관심 영역을 통해 그려지며,이 경우 PLM 뉴런의 내부 과정이다. 이 선 세그먼트는 이미지의 다시 슬라이스 기능을 사용하여 kymograph로 변환됩니다.
키모그래프는 움직이는 혜성을 나타내는 대각선 주름이 있는 거리 시간 이미지입니다. 이러한 추적에 직선 세그먼트를 그릴 수 있으며 분석 메뉴를 사용하여 측정 매개 변수를 설정할 수 있습니다. 이러한 매개 변수는 Excel과 같은 데이터 분석 프로그램의 표준 측정 가능한 수량 및 단위로 변환할 수 있습니다.
추적의 너비는 성장 길이에 해당합니다. 최고는 성장 기간을 나타내며 주름의 각도는 혜성의 방향을 제공합니다. 이 혜성은 마이크로 투부의 상대적 방향을 찾기 위해 플러스 엔드 아웃 및 마이너스 엔드 아웃으로 더 분류 될 수 있습니다.
EBTA GFP의 트랜스제닉 발현은 새로운 재생과 같은 다양한 세포 맥락에서 미세조절 역학을 관찰하도록 조정할 수 있다. 축축을 평가하는 지역에서 미세 수염 역학을 관찰하기 위해 축축은 펨토초 레이저를 사용하여 부상을 입어 막대한 부수적 손상을 일으키지 않고 축축을 정확하게 분리할 수 있습니다. 부상 후, 웜은 나중에 관찰하기 위해 시드 엔진 플레이트에 복구 할 수 있습니다.
PLM 뉴런은 강력한 엑소네리 재생을 보여 주며, 부상 후 6시간 일찍 관찰할 수 있습니다. 새로운 권리를 재생하는 광독성을 방지하기 위해, 라이브 이미징은 회전 디스크 현미경으로 수행됩니다. 재생 축삭의 시간 경과 인수는 나중에 혜성의 분석을 위해 키모그래프로 변환 할 수 있습니다.
혜성의 거리 지속 시간 및 방향은 마이크로 튜블러 방향과 역학 측면에서 해석 될 수 있습니다. 나의 중요한 방향과 역학은 세포 분열, 이동 및 셀룰러 아키텍처의 유지 보수와 같은 민간 세포 프로세스의 주요 결정자입니다. 생체 내 측정에서 마이크로튜블러 역학을 측정하는 데 사용할 수 있는 많은 도구가 있지만 어려울 수 있습니다.
자동 동체, 사진 독성, 발현 유물 이상 및 가변보고 강도는 미세 투덜콩 역학을 평가하기 위해 최종 결합 단백질의 라이브 관찰 중에 발생하는 어려움 중 일부입니다. 이 연구는 추방 된 DNA의 낮은 농도와 낮은 조명 이미징을 가진 통합 된 형질전환법을 사용하여 이러한 도전 의 일부를 완화하는 방법을 해결했습니다. 여기에 설명된 이미징 및 분석 모듈은 다른 마이크로튜블러 기반 기자 및 단백질 수송쪽으로 확장될 수 있다.
이것은 C.우아함 뉴런뿐만 아니라 다른 세포 유형 및 모델 시스템에 적용 할 수 있습니다.
