SW1353 연골 세포주의 세포는 친절 교수 PCW Hogendoorn와 라이덴 대학, 네덜란드의 교수 J. Bovée에 의해 제공되었다. 우리는 우리의 프로토콜의 개요의 전문적인 드로잉 J. Mestach 및 G. Wagemans 우수한 기술 지원 및 G. 드 Bruyne 감사합니다.

개요 그림 1을 참조하십시오 종양 물질 1. 종양 샘플을 얻기 및 준비 환자 물질의 사용을위한 윤리위원회의 승인이 필요하며, 동의는 환자에서 얻을 수합니다. <ol><li> 개입의 시점에서 수확 대표적인 물질 (최소 1cm 3), 생검 또는 육종의 절제 하나. 생검의 적절한 위치는 동적 대비 MRI를 사용하여 정의됩니다. </li><li> DMEM 1,000 U 페니실린 1 MG / ML 스트렙토 마이신과 보충 포함하는 멸균 병에 즉시 자료를 놓습니다. </li><li> 실험실 - 즉시 병 (90 분 30) 수송한다. </li></ol> 다음의 모든 절차는 층류에서 수행됩니다. <ol start="4"><li> 멸균 페트리 접시에 유리 병의 내용물을 붓는다. </li><li> 최대한 1m의 작은 부분에 종양 샘플을 넣어m 3 멸균 메스를 사용하여. 그들은 조직의 추가 처리를 손상하는 경향 모두 석회화 된 부분을 제거합니다. </li><li> 무작위 CAM의 응용 프로그램을위한 10 종양 이식을. </li></ol> 2. 종양 파생 된 단일 세포 현탁액의 준비 대략 시간 : 3 시간 <ol><li> 샘플의 잔여 조직을 무게. </li><li> 2 - dissociator 관 조직의 4g 하나 이상의 관은 나머지 모든 종양 조직을 소화해야 할 수 있습니다. </li><li> 2 소화 - 조직의 4g, 2.5 ML 콜라게나 제 2 용액 (500 U / ML RPMI 1640) 2.5 ML DNase의 용액 (22 KU / ML RPMI 1640)을 추가합니다. </li><li> dissociator의 h_tumor 프로토콜에 따라 조직을 처리합니다. 관은 30 분 동안 가볍게 흔들어 중일 때 37 배양의 2 ​​사이클 ° CO 2 배양기에서 C를 포함한다. </li><li> 150 μm의 셀 스트레이너를 통해 남아있는 현탁액을 필터링합니다. </li><li> 5 마일 1,000 rpm에서 해물을 원심 분리기N. </li><li> 상층 액을 제거합니다. </li><li> 일반 서스펜션 배양의 10 분을 허용, 적혈구 용해 버퍼 (ELB)의 10 ML에 펠렛을 resuspend을. </li></ol> 참고 : 적혈구 용해 버퍼는 다음과 같이 제조 : 0.037 g EDTA, 0.99 g K 2 HPO 4, 1,000 ml로 물에 8.29 g NH 4 망할 CIA를 추가, 0.22 μm의를 통해 압력 필터 7.3 산도를 조정하기 10 N 수산화 나트륨을 사용 필터링합니다. 4 ° C.에 저장 <ol start="9"><li> 반응을 정지 배양 배지 (DMEM이 10 % 태아 소 혈청, 100 U / ML 페니실린, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신과 보충)의 25 ML을 추가합니다. </li><li> 5 분 1,000 rpm으로 현탁액을 원심 분리기. 펠렛의 색은 이제 흰색이어야한다. </li><li> 상층 액을 제거합니다. </li><li> 펠렛 매체의 5 ML을 추가합니다. 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 필터링합니다. </li><li> 자동 셀 카운터를 통해 살아있는 세포 / ㎖의 수를 계산합니다. </li></ol> 3. Cancer 세포주 SAOS2 골육종 세포 (ATCC 번호 : HTB-85) 강화 된 녹색 형광 단백질을 발현는 제조 업체의 프로토콜에 따라 세포 라인 Nucleofector 키트 V를 사용하여 peGFP-C1 벡터에 electroporation하여 하였다. 안정적인 세포 라인을 확립하기 위해, 형질 세포는 이전에 설정된 프로토콜 20 라인에 4 주 동안 G418 (1 ㎎ / ml)에 선정되었다. 또한 정렬은 제조업체의 지침에 따라 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)에 의해 수행되었다. SW1353 연골 세포주 (ATCC 번호 : HTB-94)에서 세포 또는 갓 준비한 종양의 단일 세포 현탁액은 빨간색 형광 친 유성 막 얼룩을 사용하여 레이블이 표시됩니다. <ol><li> 솔루션, 트립신 (0.5 % 중량 / 부피) 에틸렌 산 (0.2 % 중량 / 부피 EDTA)를 사용하여 고전적인 방법으로 배양 플라스크에서 세포를 제거합니다. </li><li> 1,000 rpm에서 5 분 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> supern을 제거atant. </li><li> 혈청이없는 배지 5 μL DII (Vybrant 레드) / 10 6 세포의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 알루미늄 호일 유리 병을 포장하고 37 10 분 ° C.에 대한 CO 2 배양기에 넣어 </li><li> 1,000 rpm에서 5 분간 다시 원심 분리하여 그 상등액을 제거합니다. </li></ol> 융모 막 분석 1. 달걀 보육 <ol><li> 계란의 95 %의 수정을 보장하는 지역의 상업 부화장에서 수정란이 필요합니다. </li><li> 유정란 10 일 RT에서 최대 저장할 수 있습니다. </li></ol> 참고 : 부화를 시작하기 전에, 먼지, 깃털과 배설물주의 깊게 오히려 부드러​​운 표면 구조보다 거친이 종이 수건, 마른 걸레질에 의해 기계적으로 달걀 껍질에서 제거됩니다. 70 % 변성 에탄올 또는 다른 청소 시약 계란을 닦아 상당히 병아리 배아의 생존율을 감소시킨다. <ol start="3"><li> incub에 계란을 넣어한쪽 ATOR, 상부면을 표시. 계란 인큐베이터에 넣을 수있는 날이 배아 발달의 0 일 지정됩니다. </li><li> 37.8 ° C에서 배양 온도 및 47 %의 습도를 설정합니다. 자동 회전 옵션이 꺼져 있는지 확인합니다. </li></ol> 2. 계란 열기 기간 : 25 계란 ± 60 분 개발 3 일에, 계란은 층류에서 열립니다. 막 껍질에 집중하는 경향으로, CAM에 손상이 더 발달 단계의 결과에서 알을 열기. 적외선 램프 절차를 수행하는 동안 알을 따뜻하게 유지하는 데 사용됩니다. 불임을 개선하기 위해, 우리는 손 장갑의 사용을 권장합니다. <ol><li> 위쪽을 향하도록 표시된면, 껍데기에 계란을 넣습니다. </li><li> 계란의 끝에 삽입 18 G 바늘을 통해 알부민의 두 ML을 제거하여 CAM 수준을 낮 춥니 다. 바늘이 여러 천공 후 무딘 경우달걀 껍질은 바늘을 교체합니다. 그렇지 않은 경우, 너무 많은 힘은 계란 노른자 나 쉘의 골절에 손상이 가해 져야한다. 때때로 바늘 chalazae, 알부민의 노른자를 중단 2 나선형 밴드 중 하나에 의해 차단됩니다. 이 블록이 해결 될 때까지 조심스럽게 아래로 플런저를 밀어 해결할 수 있습니다. 달걀 노른자는 주사기로 흡입하는 경우, 바늘뿐만 아니라 주사기를 교체하십시오. 때때로 배아는이 이벤트 후에 죽는다. 알부민의 부족 금액이 제거되면 쉘이 제거 될 때, CAM이 손상 될 수 있습니다. </li><li> 창을 절단하면서 CAM에 쉘 입자의 유출을 방지하기 위해 쉘 표시된 상단에 반투과성 접착 필름을 적용합니다. </li><li> 계란의 표면에 작은 송곳 소개 구멍을 만든다. </li><li> 멸균 뾰족한 외과 가위를 사용하여, 쉘에서 1cm 2의 창을 잘라. </li><li> 태아의 박동 심장과 인접한 혈관이 일에 관찰 할 수있다계란 노른자의 전자 표면. 비 수정란이나 죽은 태아를 제거합니다. 혈관의 중단 점은 죽은 배아를 특징. </li><li> 반투과성 접착 필름 창을 밀봉하십시오. 쉘이 바늘의 삽입시 금 않는 한 그것은 빵꾸 사이트를 포함 할 필요가 없습니다. </li></ol> 3. 접종 절차 기간 : 셀 라인 당 ± 1 시간 병아리 배아 발달의 날 9, 계란 층류에서 접종한다. CAM에 걸쳐 확산 암 세포의 평가는 접종 기간 동안 제한된 표면 세포의 억제가 필요합니다. 마트 리젤 자주 실험 세포 배양 조건에서 사용되는 Engelbreth-홀름 - 떼 마우스 육종에서 세포 외 기질 (ECM) 젤입니다. 그것은 냉각하면 액체이지만, 20 왔을 때 열적 활성화 중합을 받게 될 것이다 - 40 ° C, 따라서 안정된 겔을 형성합니다. 시실험은 마트 리젤은 얼음이 녹는를 포함하는 상자에 보관됩니다. 참고 : 천공의 coverslips를 사용하지 않는 주장한다. 따라서 우리는 막 자체에 세포의 성장 잠재력을 바이어스 플라스틱 디스크에 부착 및 이식 암 세포의 성장을 관찰했다. <ol><li> 10 6 cells/100 μL ECM 젤의 농도로 냉각 ECM 젤의 세포 펠렛을 resuspend을. 얼음이 녹는에이 솔루션을 유지한다. </li><li> 층류에 따라 불임 수술의 한 쌍의 반 투과 막 소비세 부분입니다. 접착 필름이 완전히 제거되면,이 오염에 의한 배아 사망의 더 큰 비율로 발생합니다. </li><li> 상피 세포 층을 제거하기 위해, 멸균 유리 봉으로 가볍게 쉘 창 아래 CAM 오른쪽을 터치합니다. 멸균 유리 막대와 CAM을 터치하면 메스 N ° 11, 더 솜씨 좋음과 경험을 필요로 사용하는 것보다 적은 충격으로 증명한다. 작은 출혈이 발생할 수 있습니다. </li><li>종양의 자료를 dding. </li><li> 종양 이식의 경우 : 그것을 짜지 않고 멸균 포셉 한 쌍의 CAM 상 조직의 부드럽게 낮은 원피스. </li><li> ECM 젤 절차 : ECM 젤 응용 프로그램 사이에서 중합 할 수 있도록 서로의 상단에 CAM에 세포 ECM 겔 현탁액의 배 25 μl를 추가합니다. 이 방법으로 암 세포를 포함하는 접착 플라크가 생성됩니다. </li><li> 반투과성 접착 필름으로 다시 쉘 창을 밀봉하십시오. </li></ol> 4. 이미징 및 CAM의 수확 기간 : 25 계란 2 시간 병아리 배아 발달의 날 16 일 캠 수확된다. 층류에서 작업 할 필요가 없습니다. <ol><li> 외과 가위로 창을 확대합니다. 손상된 혈관의 출혈의 결과로, 그렇지 않으면 CAM이 손상 될 수 있습니다, 너무 낮은 잘라하지해야합니다. </li><li> 300를 추가 - PBS D 500 μl를 CAM 분파 위에 피펫접종 물질을 포함하는 이온. 아무 형광 프로브를 사용하지 않는 경우이 막 엄격한 만들면서, 버퍼 포름 알데히드는 멤브레인의 절단을 용이하게 사용할 수 있습니다. </li><li> GFP 또는 DSR 필터 및 필터 없음 모두를 사용하여 디지털 컬러 카메라가 장착 된 스테레오 형광 현미경을 통해 계란 CAM의 사진을 확인합니다. 종양 이식의 경우, 모든 사진은 필터없이 만들어집니다. LED 조명으로 위의 조명은 강하게 (그림 2) 촬영 중에 권장합니다. </li><li> 레이블 세포에 대한 기록 종양 세포의 이동. 종양의 경계가 불규칙 마모 될 수 있습니다. 흩어져 세포는 종양의 국경 근처에있을 수 있습니다. 일부 표본에서 종양 세포의 행 (그림 3) 관찰 할 수 있습니다. </li><li> 쉘에 누워 국경에서 멸균 가위로 막 잘라. </li><li> PBS D로 가득 차 또는 버퍼 멸균 페트리 접시에 수확 CAM를 배치maldehyde. </li><li> 상부와와와 필터가없는 두 CAM의 아래쪽, 모두의 사진을 확인합니다. </li><li> 최소 72 시간 동안 버퍼 포름 알데히드라는 컨테이너에 막 넣어. </li><li> 파라핀 캠을 포함하고 조직 학적 검사를 위해 그들을 준비합니다. 절단 표면 카세트의 바닥에 평행하게 확인하고, 결절의 중심에 종양 이식을 절단하는데주의를 기울여야. 그렇지 않은 경우, CAM 및 종양 이식 사이의 상호 작용은 표시되지 않습니다. 같은 전략은 ECM 젤 패에 적용 칼날에 직면 표면은 플라크에 수직이어야한다. </li></ol> 5. 조직 학적 평가 필요한 경우 헤 마톡 실린 - 에오신 염색 및 기-67 면역은 자세한 설명을 위해 수행되었다. 면역은 따라 자동 슬라이드 염색기를 사용하여 두께 3.5 ㎛의 포르말린 고정 파라핀 조직 절편에서 수행되었다제조업체의 지침에. 기-67 (클론 MIB-1, 희석 1 / 100)에 마우스를 기본 단클론 항체를 사용 하였다. 열을 유발 에피토프 검색은 세포 컨디셔닝 1을 사용하여 수행되었으며, 시각화 범용 DAB 검출 키트에 달성되었다, 제조 업체의 지침에 따라. 조직 섹션의 Dehydratation은 자동 coverslipper를 사용하여 수행 하였다. SAOS2과 SW1353 세포주, Ki67 양성과 Ki67 부정적인 세포 nuclei/100 μm의 2의 수는 세 영역에서 계산 하였다 : 하나 가까이 CAM의 경계로, 하나는 중앙의 표면을 닫습니다 ECM 젤 패. 이 절차는 각 기-67 스테인드 슬라이드 배 반복되었다. 증식 지수는 계산 세포의 총 수에 의해 Ki67-양성 세포의 수를 나누어 각 슬라이드에 대해 결정되었다. 괴사 파디 함께 세포의 핵에서 염색질의 좋은 분산의 손실에 의해 정의된다별개의 셀 여백의 NG​​. 이종 이식의 경우, 괴사 완료 (보통 표면) 부분, 또는 결석으로 채점됩니다. CAM에 종양 세포의 침윤은 CAM의 중배엽에서 종양 세포의 관찰에 의해 정의되며, 현재 또는 결석으로 채점됩니다. 세 가지 항목은 호스트 동작을 채점됩니다. 섬유 아세포의 침윤은 길쭉한 세포가 CAM을 떠나 종양 이식 / 패를 침입으로 정의되며, 현재 또는 결석으로 채점됩니다. 혈관 안쪽으로의 성장은 핵 병아리 적혈구의 존재에 의해 특징 병아리 혈관을 증식의 안쪽으로의 성장으로 관찰 할 수있다.

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+Chorioallantoic+membrane+(CAM)+Assay+as+an+in+vivo+model+to+study+the+effect+of+newly+identified+molecules+on+ovarian+cancer+invasion+and+metastasis.">Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).</li><li>Vargas, A., Zeisser-Labou&#232;be, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo+and+its+chorioallantoic+membrane+(CAM)+for+the+in+vivo+evaluation+of+drug+delivery+systems.">The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).</li><li>Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model.">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).</li><li>De Wever, O., Hendrix, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+quantification+of+cancer+cell+invasion+through+collagen+type+I+matrices.">Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices.</a> International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).</li><li>Albini, A., Benelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemoinvasion+assay:+A+method+to+assess+tumor+and+endothelial+cell+invasion+and+its+modulation.">The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation.</a> Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).</li><li>Hanahan, D., Coussens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

접종 수확 시간 예방 접종의 날이 ECM 젤 (36 캠의)에 SAOS2을 사용하여 수행 및 배아 발달의 날 5와 10 사이에서 변화시켰다 타이밍. 배양 9 일 전에, CAM는 지속적으로 우리가 적용 ECM 젤을 지원하기에 충분히 큰되지 않았습니다. 수확에서 종양 세포는 때때로 깊은 CAM에서 검색 할 수 있고, 일부 ECM 젤 샘플은 알부민 또는 CAM에 느슨한 거짓말을 하였다. 일 5, 6, ?...

육종 치료 저항 1,2로 인해 높은 사망률을 가진 결합 조직의 드문 종양이다. 환자의 생존에 진행 그들의 낮은 연간 발생률, 자신의 폭 넓은 다양성 및 육종 세포가 체외 3,4의 문화를 열심히보고 있다는 사실에 의해 방해된다. 임상 치료 평가를위한 배양 세포의 사용은 체외에서 새로운, 분명히 활성 분자가 항상 임상 결과를 반영하지 않는 것으로 나타났습니다. 또한, 유전자 발현 배열에 의해 밝혀 게놈 변이는 항상 5-7 개별 환자에서 종양의 행동 특성에 상관하지 않습니다. 이러한 문제를 시도하고 해결하기 위해, 맞춤 의학은 이종 이식 모델에 8-12에 대한 증가 된 검색에 반영됩니다 중요성에 얻고있다. 생체 분석의는 C 사이의 복잡한 상호 작용을 반영하는 장점이 있습니다암 증식과 침윤 13에 필요한 ancer 세포와 고체 종양의 호스트 조직 환경. 현재 우리는 육종 14,15을위한 재현 이종 이식 모델로 리오 - Allantoic 막 분석 (CAM-분석)의 사용을 공부합니다. 이 분석은 널리 종양의 혈관 신생 16,17의 연구에 사용됩니다. 다른 연구는 서로 다른 프로토콜 18,19에 따라 성장 또는 혈관에 표시된 차이를 관찰하면서 문학에서는, 그러나, 우리는이 분석을 위해 다른 프로토콜을 발견했습니다. 이 문서에서 우리는 종양 이식, 종양 파생 된 단일 세포 현탁액과 전통 육종 세포 배양을 사용하여 세포 행동에 CAM-분석의 조건을 변화의 효과를 조사합니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line Nucleofector Kit V</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>VCA-1003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11811031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1270</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse primary monoclonal antibody Ki67</td>
			<td>Dako Denmark</td>
			<td>MIB-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>D76240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20012019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSD</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040083</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peGFP-C1 vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22409-015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant cell-labeling DiI</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>22885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital color camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC 340 FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Egg Incubator</td>
			<td>Auto Elex Co</td>
			<td>R-COM 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSAriaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs C-Tube</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-237</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>semipermeable adhesive film (Suprasorb F)</td>
			<td>Lohmann&amp;Rauscher</td>
			<td>20468</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 FA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Film automated Coverslipper</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultraView Universal DAB Detection Kit</td>
			<td>Ventana Medical Systems Inc</td>
			<td>760-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventana Automated Slide Stainer</td>
			<td>Ventana Medical Systems</td>
			<td>Benchmark XT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the in ovo cam-assay as a xenograft model for sarcoma

육종은 모든 새로운 치료법의 개발을 방해, 자연 이기종 매우 드문 질환이다. 육종 환자는이 질병에 대한 재현성과 낮은 비용 xenotransplant 모델을 개발하여 현재 관심을 설명하는 층화 한 후 맞춤 의학을위한 이상적인 후보입니다. 병아리 융모 막은 종 별 제한없이 이식 조직과 세포를 유지 할 수있는 자연 면역 결핍 호스트입니다. 또한, 그것은 쉽게 액세스, 조작 및 광학 및 형광 실체 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 조직학 더 이형 세포 상호 작용에 대한 자세한 분석을 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 자세히 설명 신선한 육종 파생 된 종양 조직들은 단일 세포 현탁액, 영구 및 임시 찬란 설립 육종 세포주 (SAOS-2 SW1353)와 융모 막으로 접목 OVO에서. 병아리 생존 쥐ES는 75 %입니다. 모델은 이식편 (생존, Ki67 확산 지수, 괴사, 침투) 및 호스트 (섬유 아세포의 침윤, 혈관 안쪽으로의 성장) 행동을 연구하는 데 사용됩니다. 단일 세포 현탁액의 접목 지역화를 들어, ECM 젤 불활성 억제 물질에 비해 상당한 이점을 제공합니다. Ki67 확산 지수는 CAM의 표면에서 세포의 거리와 CAM, 치료 제품의 추가에 대한 시간 프레임을 결정하는 후자의 응용 프로그램의 지속 기간에 관련되어 있습니다.

CAM의 평가 종양 이식은 CAM (그림 2A)에 부착된다. 환자의 자료에서 단일 세포 현탁액 자주 건조, 약간 올라와 플라크 (그림 2D)를 표시합니다. CAM의 절단 후, 막의 주름 (2E와 2F 그림) 발생 표시. 상업 세포주 플라크는 세포 증식을 나타내는 시간에 더 많은 불투명됩니다. ECM 젤 다른 세포 라인은 CAM에 별개의 성장 패턴이 ?...

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The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

<em&gt; OVO에서</em&gt; 융모 막 (CAM)는 신선한 육종 파생 된 종양 조직들은 단일 세포 현탁액, 영구 및 임시 찬란 설립 육종 세포주에 이식합니다. 모델은 이식편 (생존, Ki67 확산 지수, 괴사, 침투) 및 호스트 (섬유 아세포의 침윤, 혈관 안쪽으로의 성장) 행동을 연구하는 데 사용됩니다.

<em&gt; OVO에서</em육종을위한 Xenograftmodel으로&gt; CAM-분석

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

the-in-ovo-cam-assay-as-a-xenograft-model-for-sarcoma

Research

JoVE Journal

Medicine

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

25.2K 조회수.  Ghent University Hospital.  OVO에서 융모 막 (CAM)는 신선한 육종 파생 된 종양 조직들은 단일 세포 현탁액, 영구 및 임시 찬란 설립 육종 세포주에 이식합니다. 모델은 이식편 (생존, Ki67 확산 지수, 괴사, 침투) 및 호스트 (섬유 아세포의 침윤, 혈관 안쪽으로의 성장) 행동을 연구하는 데 사용됩니다.

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A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

같은 자폐증과 정신 분열증과 같은 일반적인 장애에 드 노보 변이를 식별하는 전략

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

연구

의학

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma (glioma) and medulloblastoma. The widely used stereotactic approach only allows for the injection of a single animal at a time, is labor intensive and requires highly specialized equipment. The guide screw method, initially developed by Lal et al.,1 was developed to eliminate cumbersome stereotactic procedures. We now describe a modified guide screw approach that is rapid and exceptionally safe; both of which are critical ethical considerations. Notably, our procedure now incorporates an infusion pump that allows up to 10 animals to be simultaneously injected with tumor cells.
To demonstrate the utility of this procedure, we established human U87MG glioma cells as intracranial xenografts in mice, which were then treated with AMG102; a fully human antibody directed to HGF/scatter factor currently undergoing clinical evaluation2-5. Systemic injection of AMG102 significantly prolonged the survival of all mice with intracranial U87MG xenografts and resulted in a number of complete cures. 
This study demonstrates that the guide screw method is an inexpensive, highly reproducible approach for establishing intracranial xenografts. Furthermore, it provides a relevant physiological model for validating novel therapeutic strategies for the treatment of brain cancers.

In order to evaluate novel therapeutic paradigms for the treatment of glioma, physiological relevant models are essential. We utilize an implantable guide screw procedure for establishment of intracranial xenograft models that is more rapid and safer than stereotactic approaches.

마우스에 Intracranial 이종 이식 연구에 대한 간단한 안내 스크류 방법

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

인간 Neuroendocrine 종양 치료의 연구를위한 3 차원 모델로 인간 Neuroendocrine 종양 세포 라인

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

같은 뇌 Microslices의 흥분 독성 자극<em&gt; 체외</em&gt; 스트로크의 모델

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Glutamate and Hypoxia as a Stress Model for the Isolated Perfused Vertebrate Retina

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal vascular occlusion, retinal detachment, and diabetic retinopathy. It was the object of this study to introduce a standardized stress model for future preclinical therapeutic testing.
Bovine retinas were prepared and perfused with an oxygen saturated standard solution, and the ERG was recorded. After recording stable b-waves, hypoxia (pure N2) or glutamate stress (250 &#181;m glutamate) was exerted for 45 min. To investigate the effects on photoreceptor function alone, 1 mM aspartate was added to obtain a-waves. ERG-recovery was monitored for 75 min.
For hypoxia, a decrease in a-wave amplitude of 87.0% was noted (p &#60;0.01) after an exposition time of 45 min (decrease of 36.5% after the end of the washout p = 0.03). Additionally, an initial decrease in b-wave amplitudes of 87.23% was recorded, that reached statistical significance (p &#60;0.01, decrease of 25.5% at the end of the washout, p = 0.03).
For 250 &#181;m glutamate, an initial 7.8% reduction of a-wave amplitudes (p &#62;0.05) followed by a reduction of 1.9% (p &#62;0.05). A reduction of 83.7% of b-wave amplitudes (p &#60;0.01) was noted; after a washout of 75 min the reduction was 2.3% (p = 0.62). In this study, a standardized stress model is presented that may be useful to identify possible neuroprotective effects in the future.

With this study, we introduce a standardized stress model for the isolated superfused bovine retina for future preclinical therapeutic testing. The effect of either hypoxia (pure N2) or glutamate stress (250 &#181;M glutamate) on retinal function represented by a- and b-wave amplitudes was evaluated.

고립 된 관류 척추 동물의 망막에 대한 스트레스 모델로 글루타민산과 저산소증

Neuroprotection has been a strong field of investigation in ophthalmological research in the past decades and affects diseases such as glaucoma, retinal ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

<em&gt; 비켜에서</em간세포 암의 효율적인 이종 이식 모델로&gt; 병아리 융모 막 (CAM) 분석

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

닭에서 인간의 다발성 골수종 이종 이식 모델의 설립은 종양의 성장, 침략과 혈관 신생을 공부하기

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Oleic Acid-Injection in Pigs As a Model for Acute Respiratory Distress Syndrome

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit patients. Despite treatment advances over the last decades, ARDS patients still suffer mortality rates between 35 and 40%. There is still a need for further research to improve the outcome of patients suffering from ARDS. One problem is that no single animal model can mimic the complex pathomechanism of the acute respiratory distress syndrome, but several models exist to study different parts of it. Oleic acid injection (OAI)-induced lung injury is a well-established model for studying ventilation strategies, lung mechanics and ventilation/perfusion distribution in animals. OAI leads to severely impaired gas exchange, deterioration of lung mechanics and disruption of the alveolo-capillary barrier. The disadvantage of this model is the controversial mechanistic relevance of this model and the necessity for central venous access, which is challenging especially in smaller animal models. In summary, OAI-induced lung injury leads to reproducible results in small and large animals and hence represents a well-suited model for studying ARDS. Nevertheless, further research is necessary to find a model that mimics all parts of ARDS and lacks the problems associated with the different models existing today.

In this article, we present a protocol to induce acute lung injury in pigs by central-venous injection of oleic acid. This is an established animal model for studying the acute respiratory distress syndrome (ARDS).

올레산 급성 호흡 곤란 증후군에 대 한 모델로 돼지에 주입

The acute respiratory distress syndrome is a relevant intensive care disease with an incidence ranging between 2.2% and 19% of intensive care unit ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Myography 와이어를 사용 하 여 마우스 Mesenteric 동맥의 isometric 수축 측정

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Corneal Epithelial Abrasion with Ocular Burr As a Model for Cornea Wound Healing

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to injury. In fact, the most common type of eye injury found in clinic is a corneal abrasion. Here, we utilize an ocular burr to induce an abrasion resulting in removal of the corneal epithelium in vivo on anesthetized mice. This method allows for targeted and reproducible epithelial disruption, leaving other areas intact. In addition, we describe the visualization of the abraded epithelium with fluorescein staining and provide concrete advice on how to visualize the abraded cornea. Then, we follow the timeline of wound healing 0, 18, and 72 h after abrasion, until the wound is re-epithelialized. The epithelial abrasion model of corneal injury is ideal for studies on epithelial cell proliferation, migration and re-epithelialization of the corneal layers. However, this method is not optimal to study stromal activation during wound healing, because the ocular burr does not penetrate to the stromal cell layers. This method is also suitable for clinical applications, for example, pre-clinical test of drug effectiveness.

This protocol describes a method to inflict an abrasion to the ocular surface of the mouse, and to follow the wound healing process thereafter. The protocol takes advantage of an ocular burr to partially remove the surface epithelium of the eye in anaesthetized mice.

각 막에 대 한 모델로 눈 버와 각 막 상피 마모 상처 치유

The murine cornea provides an excellent model to study wound healing. The cornea is the outermost layer of the eye, and thus is the first defense to ...