막 단백질이 연구를 위해 추출되는 고전적인 방법은 세제의 간단한 용해도에 의한 것입니다. 이것은 간단하고 보편적인 방법을 제공하지만, 세제는 이러한 민감한 단백질의 기본 구조, 기능 및 활동을 변경하는 것으로 나타났습니다. 여기서 우리는 펩티디스크를 세제 없는 용액에서 막 단백질을 안정화하기 위한 해결책으로 제시합니다.
Peptidisc 시스템은 무수한 막 단백질의 크기, 모양 및 유형학에 자발적으로 적응합니다. 이것은 종종 지루한 최적화를 필요로 하는 그밖 막 모방과 대조적입니다. FhuA, 대장균 외부 막 단백질, 본 프로토콜에서 재구성되는 모형 표적 단백질로 사용될 것이다.
외부 막 소포는 막 단백질을 용해시키기 위해 세제를 첨가한 후 격리될 것이다. 펩티디스크 펩타이드는 용해화에 첨가되고 세제는 희석되어 펩티디스크 입자를 자발적으로 형성한다. 이러한 안정화된 용해성 입자는 이제 수많은 다운스트림 응용 제품에 적합합니다.
이 프로토콜은 펩티디스크 기술의 적용으로 바이오 층 간섭을 검사합니다. 이 프로토콜은 멤브레인 단백질의 동시 정화 및 재구성을 용이하게 하는 유용한 기술인 PeptiQuick 재구성 방법에 초점을 맞출 것입니다. 온비즈 재구성의 PeptiQuick 방법은 세제에서 미리 평형된 표준 니켈-NTA IMAC 중력 컬럼에서 수행됩니다.
용해성 멤브레인은 수지에 적재되고 비표적 단백질은 씻어낸다. 이 펩티드가 컬럼에 첨가되고 세제가 급속히 희석된 후. 펩티디스크 펩티드의 소수성 면은 노출된 소수성 부위와 연관되어 있다.
펩티드의 친수성 면은 단백질을 용액에 용해상태를 유지합니다. 과잉 펩티드는 씻어냅니다. 이미다졸은 재구성된 분노를 털어내는 데 추가됩니다.
Peptidisc 스캐폴드는 메모리 단백질을 간접적으로 라벨로 표시하여 더 광범위한 다운스트림 분석 세트에 문을 열도록 기능화될 수 있다. 여기서 우리는 BLI 분석을 위해 스트렙타비딘 코팅 센서에 부착하기 위해 바이오티니징 펩티드를 이용합니다. 바이오 층 간섭법은 용액의 생체 분자 상호 작용을 조사하기위한 강력한 라벨없는 기술입니다.
단순히 상호 작용을 시연할 뿐만 아니라 이 기술은 실시간 운동 판독을 제공하고 바인딩 해리를 일정하게 계산할 수 있습니다. 이 프로토콜을 통해, 우리는 이것이 활동을 바꿀 수 있기 때문에 BLI 분석 도중 세제에 대한 필요성을 제거합니다. 바이오레이어 간섭은 상호작용 중에 센서 또는 팁, 결합된 매크로 분자로부터 반사되는 백색광의 간섭 전달을 분석합니다.
상호 작용을 측정하기 위해 감각 팁은 솔루션과 각 단계에서 기록된 신호 간에 전달됩니다. 각 팁은 센소그램에 자신의 흔적을 제공합니다. 첫째, 버퍼의 기준선만 설정됩니다.
둘째, 리간드가 구속됩니다. 이 경우 FhuA 및 생체 화 된 펩티 디스크는 연쇄타비딘 코팅 팁을 결합합니다. 다음으로 팁은 버퍼로 세척되어 바인딩되지 않은 FhuA를 제거합니다.
이제 팁은 알려진 인질처리량인 ColM으로 이동됩니다. 상호 작용이 발생하면 바인딩 곡선이 됩니다. 마지막으로 팁이 버퍼로 이동하고 해리가 측정됩니다.
각 컬럼 농도에서의 연관 및 해리에 대한 관찰된 비율을 사용하여 해리상수를 계산할 수 있다. 헥사히스티딘 태그 FhuA는 아민 미디어에서 18 시간 동안 E-coli 균주 AW740에서 표현된다. 박테리아는 섭씨 4도에서 5, 000 G의 10 분에 원심 분리에 의해 수확됩니다.
결과 세포 펠릿은 TSG 버퍼에서 다시 일시 중단된 다음 세포 덩어리를 분해하고 철저한 용액을 보장하기 위해 두드리고 있습니다. TMSF는 리시스 직전에 1 밀리머의 최종 농도로 다시 중단된 세포에 첨가된다. 세포 용해는 15, 000 PSI 또는 8, 000 PSI에서 프랑스 프레스에서 미세 유체제제 중 하나를 통해 세 구절에 의해 달성된다.
용액 세포는 수집되고 4도에서 10 분 동안 5, 000 G에서 저속 원심 분리가 수행됩니다. 저속 스핀의 상체는 TI70 초원심분리기 로터에 적재되고 원심분리기는 200G, 000 G의 40분 동안 40분간 원유 대장균 멤브레인을 펠렛합니다. 초원심분리에 따라, 상체는 버려지고 원유 멤브레인 펠릿은 최소한의 TSG 버퍼로 다시 중단됩니다.
원유 멤브레인은 균질성을 보장하기 위해 두드리고 있습니다. 브래드포드 분석은 다시 중단 된 조막의 단백질 농도를 확인하기 위해 수행됩니다. TSG 버퍼는 용해화 전에 밀리리터 당 약 3 밀리그램으로 원유 멤브레인을 희석하는 데 사용됩니다.
트리톤 X-100은 세균 내막을 선택적으로 용해시키기 위해 1%의 최종 농도에서 재중단된 원유 멤브레인에 첨가된다. 용해성은 4도에서 1 시간 동안 수행되며 부드러운 흔들림이 있습니다. 용해되지 않은 외부 멤브레인은 4도에서 200G, 000 G의 초원심분리에 의해 40분 동안 격리됩니다.
수용성 내부 멤브레인을 포함하는 결과 상체가 폐기됩니다. 외부 멤브레인을 포함하는 펠릿이 TSG에서 이전과 같이 다시 중단됩니다. LDAO는 재중단된 외부 멤브레인에 1%의 최종 농도를 추가하고 4도에서 1시간 동안 용해된다.
마지막으로, 초원심분리는 이전과 마찬가지로 불용성 물질을 흡입하는 물질을 수행한다. 결과 상체는 우리의 대상, 그의 태그 FhuA를 포함하여 용해 된 외부 멤브레인을 포함, 이제 동시 IMAC 정화 및 펩티 디스크 재구성에 대한 준비. 니켈-NTA IMAC 중력 기둥은 IMAC 세척 버퍼의 두 컬럼 볼륨으로 미리 평가됩니다.
이미다졸은 용해화된 외부 멤브레인에 5밀리몰러의 최종 농도로 첨가되어 0.04%LDAO로 희석된다. 수용성 외막은 니켈-NTA 수지에 적재되고, 수집된 흐름을 통해서. 이러한 흐름을 통해 FhuA의 수지 결합을 증가시키기 위해 수지에 재로드됩니다.
하중 후 수지는 IMAC 세척 버퍼 250밀리리터와 수집된 처음 50밀리리터로 세척됩니다. 세척 후, 세척 버퍼는 수지 침대의 높이 바로 위에 배수하고 기둥 스톱콕이 닫힙다. 농축된 밀리리터 1밀리리터, 밀리리터당 10밀리그램, 펩티디스크 펩타이드가 컬럼에 첨가된다.
농축 펩타이드의 첨가에 따라, 희석50밀리리터, 밀리리터당 1밀리그램, TSG의 펩티디스크 펩타이드가 첨가된다. 수지는 LDAO의 CMC 아래, TSG로 구슬을 다시 중단하여 펩티디스크 입자를 형성합니다. 펩티디스크 트랩핑에 이어 수지는 정착이 허용되고 밀리리터 펩티드 용액당 1밀리그램이 수지를 통해 배출된다.
수지는 50 밀리리터 TSG로 세척되어 과도한 펩티디스크 펩티드를 제거합니다. 마지막으로, 펩티디스크 입자는 TSG에서 600 밀리머 이미다졸의 50 밀리리터로 희석됩니다. 1밀리리터 분획이 수집되고 0.5 개의 어금니 EDTA의 10 마이크로 리터가 첨가되고, 키 라이트 침출 니켈 이온.
시작, 흐름, 세척 및 피각된 분획은 12% SDS 젤에 적재되고 전기포재는 60밀리암페어에서 30분 동안 적재됩니다. 젤은 염색되어 젤 스캐너에 시각화됩니다. 결과 겔은 FhuA의 고갈을 통해 흐르는 것을 보여주고, 용출의 농축.
경미한 오염 물질 대역도 피각된 분획에서 관찰됩니다. FhuA Peptidisc 용해도 및 고갈 오염 물질을 확인하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 위해 3~7개의 분수가 선택됩니다. 원심 농축기를 잘라낸 30킬로돔은 3-7의 분수분들을 집중시하는 데 사용됩니다.
풀링된 IMAC 용출 분획의 1밀리리터는 TSG 버퍼에서 분당 0.25 밀리리터의 유량으로 S200 컬럼에 주입됩니다. 1밀리리터 분획이 수집되고 분수의 12% SDS 젤이 실행됩니다. 관련 분수는 풀로 되어 있으며 이제 다운스트림 응용 프로그램에서 사용할 수 있습니다.
BLI는 포르테비오 옥텟 RED96에서 진행되었습니다. 이 계측기는 BLI 핀을 96웰 플레이트를 가로질러 이동하여 직접 설치합니다. 모든 우물은 200 마이크로 리터의 최종 볼륨으로 채워집니다.
열 하나는 팁이 기준 신호를 상화하고 형성할 수 있도록 운동 버퍼로 로드됩니다. 컬럼 2는 리간드 및 운동 버퍼의 미리 결정된 농도로 로드됩니다. 이 경우, FhuA는 리간드이며 밀리리터당 2.5 마이크로그램의 농도에 추가됩니다.
행 E의 팁은 참조로 사용되며 버퍼만 로드됩니다. 컬럼 3은 팁에서 과도한 FhuA를 세척하기 위해 운동 버퍼로 로드됩니다. 이 경우 ColM은 Aalyte의 두 배 연속 희석이 열 4에서 위에서 아래로 로드됩니다.
이러한 농도 중 가장 높은 것은 참조 행에 사용되며, 끝에 대한 별언의 비특이적 결합을 측정합니다. 열 5는 버퍼로 로드됩니다. 여기서, ColM은 해리되고, 측정된 해리.
플레이트가 준비되면 센서 팁 트레이와 준비된 플레이트가 BLI 기기에 로드됩니다. BLI 데이터 수집 소프트웨어가 열리고 새로운 운동 실험이 시작됩니다. 플레이트 정의 탭은 소프트웨어에 96 웰 플레이트의 레이아웃을 입력하는 데 사용됩니다.
여기서 리간드 FhuA는 실자 콜M이 샘플로 입력되는 동안 부하로서 입력된다. 분석 정의 탭은 실험의 각 단계에 대한 시간 및 플레이트 회전 속도를 정의하는 데 사용됩니다. 여기에는 60초의 기준단계, 250초의 로딩 단계, 300초의 두 번째 기준 단계, 450초의 실화 연동 단계, 마지막으로 900초의 해리 단계가 포함됩니다.
이러한 단계는 원하는 단계를 선택하고 각 열의 분석 추가를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 96웰 플레이트의 각 열에 개별적으로 할당됩니다. 센서 할당 탭은 Octet 기기가 센서 트레이의 올바른 위치에서 BLI 핀을 복용하고 있는지 확인하는 데 사용됩니다. 검토 실험 탭은 실행하기 전에 실험에 대한 최종 개요를 제공합니다.
BLI는 이제 옥텟 레드에 의해 수행됩니다. 이렇게 하면 분석을 위한 원시 데이터 센소그램이 생성됩니다. 분석은 옥텟 바이오 데이터 분석 소프트웨어를 처음 열어 수행됩니다.
데이터 선택 탭은 실험을 찾고 실험 요약을 확인하는 데 사용됩니다. 알라바이트 ColM의 농도는 여기에 입력됩니다. 다음으로, 처리 탭은 실험 데이터에서 참조 신호를 빼는 데 사용됩니다.
기준선은 Y축을 합금 해제 속도가 적용된 것처럼 정렬하도록 정의됩니다. 마지막으로 프로세스 데이터가 선택됩니다. 이 실험에 대해 데이터가 격리되고 맞춤 곡선이 선택됩니다.
부분 연결 및 해리 곡선 피팅이 선택됩니다. Kd는 이 피팅에서 계산됩니다. 크기 제외 크로마토그램은 아부트의 재구성을 검증하는 데 사용됩니다.
크로마토그램은 단일 대칭 피크를 나타내며, 이는 단분산 단백질 제제를 제안합니다. 피크는 보이드 부피 후 여러 밀리리터를 엘테우, 비 응집 수용성 펩티디스크 입자를 나타냅니다. 단백질 응집체는 빈 부피에서 엘루트되며, 과도한 세제와 펩타이드는 주 피크다음에 엘루트됩니다.
니켈 NTA 구슬에 부착된 상태에서 형성된 펩티디스크의 세척이 증가하면 후자의 피크가 고갈되어야 합니다. 단백질 응집체는 종종 기억 단백질을 세제 프리 용액에 노출시키는 결과입니다. 이 마지막 제외 크로마토그램은 자신의 재구성을 해결하는 데 유용한 진단입니다.
실험 데이터의 처리에 따라 곡선은 센소그램에 적합합니다. 이 피팅의 정확도는 해리 상수를 계산하는 데 필수적입니다. 잔여 뷰 플롯은 실험 데이터와 계산 피팅의 차이점을 설명합니다.
이는 4개의 서로 다른 열 농도의 경우 커브 의 3개가 잘 맞는다는 것을 보여줍니다. 그러나, 가장 높은 농도의 경우 곡선은 좋은 핏을 생성하지 않습니다. 이것은 이 높은 농도에서 핀에 열의 이질적인 결합이 있음을 시사합니다.
따라서 이 최고 농도 신호는 ForteBio 애플리케이션 노트에 따라 운동 분석에서 포함되지 않습니다. 나머지 세 개의 곡선은 운동 해석에 사용됩니다. BLI 및 펩티디스크 방법을 사용하여 결정된 FhuA와 ColM 간의 해리 상수는 다른 방법에 의해 결정된 상수와 일치한다.
이소레말 열량및 나노디스크, 마이크로스케일 열전증 및 펩티디스크는 우리의 결정된 가치와 크게 다르지 않은 해리 상수를 산출했습니다. 이러한 일관성은 상호 작용 역학을 측정하기 위한 펩티디스크 BLI 방법을 검증합니다. 좋아, 그래서,이 비디오를 시청 한 후, 우리는 당신이 PeptiQuick 방법의 힘과 주의의 실질적인 이해를 얻었으면 좋겠다.
우리는 세제의 완전한 부재에 FhuA ColM 상호 작용을 정량화하기 위해 특히 유용한이 방법을 발견했다. 그리고 우리는 다른 수용체 리간드 상호 작용을 특성화하기 위해 동일한 워크플로우를 적용 할 수 있다고 의심한다. 당신의 실험과 행운을 빕니다.
