저자들은이 연구에 활용 된 Rhipicephalus microplus ticks와 Lucas Karbanowicz가 비디오 촬영에 도움을 주도록 Biosecurity Tick Colony (Queensland Agriculture &amp; Fisheries, Australia)에 감사 드리고자합니다.

1. R. microplus 의 Gut Epithelium 해부 <ol><li> 실험 당일에 가축에서 반 엔 다당류 진드기를 수집합니다. 호스트에서 제거한 후 24 시간 이내에 진드기를 해부합니다. </li><li> 92mm x 16mm 페트리 접시 바닥에 덕트 테이프를 붙입니다. 슈퍼 접착제 한 방울을 테이프에 추가하십시오. 진드기, 복부면을 슈퍼 접착제 위에 놓고 2 분 동안 건조시킵니다. </li><li> 페트리 접시에 인산염 완충 식염수 (PBS) 100 ML을 부어, 또는 진드기가 완전히 잠길 때까지. </li><li> 크기 11의 메스를 사용하여 눈의 꼭대기에서 진드기의 양쪽에있는 하단 꽃줄로 잘라냅니다. </li><li> 살균 포셉을 사용하여 scutum 및 alloscutum을 완전히 제거하여 내부 장기를 노출시킵니다. </li><li> 오염을 방지하기 위해 미세한 흰색 실 모양의 기관 (기관) 및 기타 막을 제거하십시오. </li><li> 포셉을 사용하여 위 부분을 집어 넣고시체. 다른 조직이 해부되지 않도록 나머지 조직을 제거하십시오. </li><li> 염화칼슘과 단백 분해 효소 칵테일 (PIC)이 포함 된 마그네슘 설페이트가없는 얼음처럼 차가운 Hank &#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)에 보관하십시오. 드라이 아이스로 용기를 고정시키고 -20 ° C에서 보관하십시오. 참고 : 장 절제술 및 진드기 내부 장기의 세부 사항을 지원하기는 D 소넨샤인, 19 &quot;진드기의 생물학 &#39;의 3.1 장을 참조하십시오. </li></ol> 2. 상피 세포 해리 <ol><li> 50 ML 튜브 내부 70 μm의 셀 스트레이너에 해부 직감을 부어. </li><li> 용액이 깨끗해질 때까지 PIC가있는 50 mL의 차가운 HBSS로 창자 조직을 씻어 낸다. 그러면 내장은 흰색 / 깨끗한 모양을 취한다. </li><li> PIC와 30 ML 얼음 추위 HBSS의 용기를 다시 일시 중지하고 부드럽게 혼합하고 4 X에서 500 XG 10 분 원심 분리 용기를 펠렛. 뜨는 물을 제거하고 세 번 반복 세척 과정. </li><l(DMEM), 2 % 태아 송아지 혈청 (FCS), 0.5 MM ethylenediaminetetraacetic 산성 (EDTA), 1 MM 트리스 (2) 세포 배양 배지 10 mL에서 상피 직감 세포를 제거하기 위해 장을 재현 탁한다. (TCEP), PIC 및 37 ℃에서 60 분 동안 배양하고, 6rpm의 롤러를 사용하여 서서히 회전시킨다. </li><li> 250 μm 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 여과하고, 흐름을 통과시키고 70 μm 셀 스트레이너를 통해 여과하여 남아있는 흐름을 수집합니다. </li><li> 단일 세포를 펠렛으로 20 분 동안 4 ° C에서 500 XG에서 현탁액을 원심 분리하십시오. </li></ol> 밀도 원심 분리 구배를 이용한 단일 상피 세포의 분리 <ol><li> AP15 사전 여과지를 통해 여과하여 밀도 원심 분리 구배 ( 예 : Percoll)를 준비하십시오. mqH 2 0 (v / v)에 40 % 및 20 % Percoll을 준비하고 그라디언트를 쌓기 전에 4 ° C에서 1 시간 동안 냉각하십시오. </li><li> 연동 운동 사용펌프를 최저 속도로 놓고, 16 mL 초 원심 분리 관에 40 % 밀도 원심 분리 그라디언트 3 mL를 놓고 얼음에 15 분 동안 침전되도록합니다. 펌프의 속도는 분당 1mL 미만의 유속으로 이어집니다. </li><li> 45 ° 각도로 튜브를 기울이면 연동 펌프를 사용하여 40 % 층 상단에 20 % 밀도 원심 분리 그라데이션을 겹쳐 놓습니다. 펌프의 속도는 분당 1 mL 이하로 유지되어야합니다. 레이어가 얼음에 15 분 동안 정착 수 있습니다. </li><li> 연동 펌프를 분당 1mL 미만의 유속으로 사용하여 20-40 % 밀도 원심 분리 그라데이션에 진드기 직감 세포가 들어있는 DMEM 배지 3 mL를 섞으십시오. </li><li> 최대 가속과 최소 감속을 위해 원심 분리기를 프로그래밍하십시오. 10 분 동안 600 XG에서 원심 분리하십시오. DMEM : 20 % 밀도 원심 분리 그라데이션과 20 % : 40 % 밀도 원심 분리 그라데이션 사이의 중간 단계를 수집하여 상피 단일 세포를 분리합니다. 이후의 분석을 위해 수집 된 interphases를 4 ° C에 보관하십시오. </li></ol><html> 4. 세포 분리의 평가 <ol><li> 혈색소 <ol><li> 알코올로 혈구 미터 슬라이드를 청소하십시오. </li><li> 세포를 위아래로 부드럽게 pipetting하여 세포를 다시 정지시킵니다. 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 세포 현탁액과 장소의 피펫 100 μL. </li><li> 0.4 % Trypan Blue 400 μL를 첨가하십시오. 부드럽게 튜브를 flicking하여 섞는다. </li><li> 천천히 hemocytometer의 두 챔버를 채우기 위해 Trypan 블루 - 처리 세포 현탁액 100 μL를 피펫. </li><li> hemocytometer를 10X 객관적으로 hemocytometer의 그리드 라인에 초점을 맞추고 가벼운 현미경 아래에 놓습니다. </li><li> 휴대용 집계 카운터를 사용하여 16 개의 사각형 집합 내의 살아 있지 않은 셀을 계산합니다. 같은 광장 안에서 파란색 죽은 세포를 세어보세요. 16 세트의 4 세트가 계산 될 때까지 계속 계산하십시오. </li><li> 다음 공식을 사용하여 mL 당 총 세포를 계산하십시오 : 47eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> 다음 공식을 사용하여 세포 생존률 백분율을 계산하십시오. <img alt="등식 2" src="/files/ftp_upload/55747/55747eq2.jpg" /></li></ol></li><li> 세포 격리 시각화 <ol><li> 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 HBSS 9 μL에 고립 된 세포의 1 μL를 희석. 미세 원심 분리 관을 천천히 섞어서 섞으십시오. </li><li> 유리 슬라이드의 중간에 HBSS에 고립 된 세포 5 μL 피펫. 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 함께 3 방울의 마운팅 매질을 적용하십시오. </li><li> 5 분 동안 실온에서 슬라이드를 품어. 조심스럽게 공기 방울을 피하면서 준비 위에 커버 슬립을 놓습니다. </li><li> DAPI로 염색 된 세포를 형광 현미경 하에서 360 nm 여기시키고 460 nm에서 방출하는 것으로 시각화하십시오. </li></ol></li></ol> 5. 세포 표면 단백질 Biotinylation <ol><li> Biotin (유형 A) 접합을 사용하여 단일 세포 상피 세포 100 μL를 Biotinylate키트를 제조사의 지시에 따라 1 : 1 표면 단백질 대 접합체의 몰비 </li><li> 세포 용해를 위해 PBS, 1 % 트리톤 X - 100, 10 % 글리세롤, 100 μm의 산화 glutathione 및 PIC의 100 μL를 biotinylated 세포에 추가합니다. 10 분마다 부드럽게 혼합하면서 얼음에 1 시간 동안 품어 낸다. </li><li> 불용성 물질을 펠렛에 20 분 동안 4 ° C에서 20,000 XG에서 biotinylated 세포를 원심 분리기. 세포질 및 biotinylated 막 단백질을 포함하는 뜨는을 수집합니다. </li><li> Bradford 분석법을 사용하여 단백질 농도를 결정하십시오. </li></ol> 6. Biotinylated 표면 단백질의 분리 <ol><li> 1.5 ML microcentrifuge 튜브에 Streptavidin 자기 구슬 50 μL를 추가합니다. </li><li> 튜브를 마그네틱 스탠드에 넣고 튜브 측면에 비드를 수집합니다. 뜨는 부분을 버리고 버린다. </li><li> 1000 μL의 TBS, 0.1 % Tween-20을 튜브에 첨가하십시오. 부드럽게 혼합하고 자석 스탠드로 비즈를 수집하십시오.디. 뜨는 부분을 버리고 버린다. </li><li> 씻은 자기 구슬과 1x PBS에서 300 μL로 희석 biotinylated 세포 표면 단백질 40 μg을 결합하십시오. 교반과 함께 상온에서 2 시간 동안 품어 낸다. </li><li> 자성 스탠드로 구슬을 수집하고, 뜨는을 제거하고 버립니다. </li><li> 튜브에 TBS, 0.1 % Tween-20 300 μL를 가하고 가볍게 혼합하여 구슬을 다시 정지시킵니다. 구슬을 모으고 상징액을 버리고 버린다. 이 세척 단계를 두 번 반복하십시오. </li><li> 자성 구슬에 0.1 M 글리신 산도 2.0의 100 μL를 추가하고 실온에서 5 분 품어. 구슬을 수집하고 elotated biotinylated 표면 단백질을 포함하는 뜨는을 제거하십시오. </li><li> 4 ~ 20 % Tris-MOPS SDS-PAGE 젤에서 분리 된 표면 단백질을 시각화합니다. </li></ol> 7. Biotinylated 표면 단백질의 평가 <ol><li> 점 얼룩 <ol><li> 니트로 셀룰로스 멤브레인의 7cm x 3cm 스트립을 자릅니다. </li><li> 10 μg 총 진드기 적용t 내용물 (위의 1.8에서)과 10 μg의 biotinylated 표면 단백질을 막으로 옮긴다. 실온에서 15 분간 건조시킨다. </li><li> 용기에 옮기고 100 mL의 블로킹 완충액에 담근다. 1 시간 동안 교반하면서 실온에서 배양하십시오. 블로킹 버퍼를 버립니다. </li><li> 교반과 함께 5 분 동안 100 μL PBS, 0.05 % 트윈 -20에 nitrocellulose 막을 씻으십시오. 세척 완충액을 버리고 세 번 세척을 반복하십시오. </li><li> 실온에서 교반하면서 2 시간 동안 100μL PBS, 0.05 % Tween-20에서 1/5000 Streptavidin-horseradish 과산화 효소 (HRP)를 배양하고 남아있는 용액을 버린다. </li><li> 교반하에 5 분 동안 PBS, 0.05 % Tween-20 100 μL에서 니트로 셀룰로스 멤브레인을 씻으십시오. 세척 완충액을 버리고 세 번 반복합니다. </li><li> 검출을 위해 4- 클로로 -1- 나프톨 1 정을 얼음 냉 메탄올 10 mL에 녹인다. TBS 20 mL에 메탄올 스톡 4 mL를 넣는다. 신선한 30 % 과산화수소 및 immedia 10 μL를 추가하십시오니트로 셀룰로스 멤브레인에 적 용하십시오. </li><li> 기질이 불용성 청색 최종 생성물을 생성 할 때까지 실온에서 교반하면서 인큐베이션한다. 이것은 2-15 분 사이에 걸릴 수 있습니다. </li><li> 검출 용액을 버리고 100 μL mqH 2 O에서 멤브레인을 3 번 씻으십시오. </li></ol></li><li> ELISA 분석법 <ol><li> 100 mM 탄산염 코팅 완충액 400 μL로 각 시료 200 ng을 희석하고 ELISA 플레이트 (평평한 바닥 판)의 첫 번째 행 (A #)의 2 차선을 코팅하십시오. </li><li> 행 (BH)에있는 모든 다른 해당 우물에 100 MM 탄산염 코팅 버퍼의 100 μL를 추가합니다. </li><li> 행 A의 각 우물에서 100 μL를 pipetting하여 행 B로 전송하여 각 샘플의 연속 dilutions을 준비 pipetting하여 부드럽게 혼합하고 거품을 피하십시오. 행 H에있는 각 우물에서 최종 100 μL를 버리고, 각 행 아래로 희석액을 반복합니다. </li><li> parafilm와 접시를 덮고 4 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 외판을 닦으십시오.PBS 200 μL, 0.05 % Tween-20 / 웰 당 3 회. </li><li> 코팅 된 우물에 차단 버퍼 200 μL를 추가하고, Parafilm으로 덮고 4 ° C에서 밤새 품을 수 있습니다. </li><li> 1 / 15,000 Streptavidin-HRP를 블로킹 완충액으로 희석하고 플레이트의 각 웰에 100 μL를 첨가한다. parafilm으로 덮고 4 ° C 밤새 인큐베이션하십시오. </li><li> 플레이트를 200 μL PBS, 0.05 % Tween-20에서 5 번 씻으십시오. </li><li> 감지하려면 우물 당 TMB 시약 100 μL를 추가하십시오. 충분한 색 발색 후, 보통 10-15 분 사이에 반응을 멈추기 위해 1 M 인산 100 μL를 첨가한다. </li><li> λ = 450nm에서 각 웰의 흡광도를 읽으십시오. </li></ol></li></ol>

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가축 진드기 침입은 살 처분제 1 , 4 의 사용에 의존하는 가장 보편적 인 관리 방법과 함께 전 세계의 열대 및 아열대 지역의 소 산업에서 주요한 문제를 구성합니다. Bm86은 이전에 Bm86 지리적 인 순서 변화와 규칙적인 부스팅 4에 대한 요구 사항으로 인해 백신 전략으로서의 제한된 성공으로 R. microplus의 감염 10 ...

Rhipicephalus microplus 는 가축 진드기 (babineiosis), 아나 플라스마 증 및 말 피토 플라스마 증 1 , 2 , 3 , 4를 매개로하여 열대 및 아열대 지역의 소 산업에 대한 경제적 영향 측면에서 가장 중요한 외부 기생충이다. 화학 살비제의 사용과 같은 기존의 방법은 우유 및 육류의 화학적 잔류 물의 존재와 화학적 내성 진드기의 유행 증가와 같은 암시 적 단점을 가지고 있지만 해로운 진드기를 통제하기위한 노력이 해로운 영향을 줄이기 위해 노력해왔다 5 , 6 , 7 . 결과적으로, 자연 저항성 소, 생물학적 방제 (biopesticides) 및 백신의 사용과 같은 진드기 제어의 대안적인 방법의 개발이 연구되어왔다ines 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . 백신 후보 물질로 활용 될 수있는 단백질을 추구함에있어 현재의 연구는 진드기 장에 초점을 맞추고있다. 중추의 벽은 얇은 기저 층 (basal lamina) 위에 놓여있는 단일 층의 상피 세포로부터 만들어지며, 기저 층의 바깥 쪽은 근육 네트워크를 형성합니다. 빛과 전자 현미경 관측에 따르면 중뇌는 예비 세포 (미분화), 분비 세포, 소화 세포의 3 가지 유형으로 구성되어 있습니다. 세포 유형의 수는 생리 학적 단계에 따라 상당히 다양합니다. 분비 세포와 소화 세포는 모두 예비 세포 18 , 19 , 20 에서 유래합니다. cDNA 라이브러리의 구축진드기의 구성을 조사하여 장내 백신 후보 물질 2 , 3 , 4 로 Bm86과 같은 항원 단백질을 밝혀 냈습니다. 당 단백질 Bm86은 진드기 배아 세포 표면에 국한되어 백신 접종 된 소의 가축 진드기 ( R. microplus )에 대한 방어 면역 반응을 유도한다. 면역화 된 숙주에 의해 생성 된 항 -Bm86 IgG는 진드기에 의해 섭취되고, 진드기 장 세포의 표면에서이 항원을 인식하고,이어서 진드기 장 조직의 기능 및 완전성을 방해한다. Bm86 항원 기초 백신 횟수, 체중 및 후속 틱 4 세대 감소 유충 감염의 결과를 engorging 여성의 생식 능력을 감소시킴으로써, R.의 microplus 및 Rhipicephalus annulatus의 효과적인 제어를 보여준다. 그러나 Bm86 계 백신은 모든 진드기 단계에 효과적이지 않으며R.의 microplus의 일부 지리적 균주에 대한 불만족스러운 효과를 보여, 결과적으로 쇠고기와 낙농 산업은 가난, (4)이 백신 2를 채택했다. 진드기로부터 상피 세포를 분리하는 능력은 상이한 환경 조건 하에서 형태 및 생리를 포함한 단백질 막 조성을 결정하기위한 연구의 진행을 가능하게하는 중요한 혁신이다. 여기에 설명 된 방법은 킬레이트 화제 인 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)와 환원제 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP)을 사용하여 상피를 상피지지 조직 10 에서 방출합니다. 상피는 동요에 의한 조직의 기계적 파괴 후 Percoll에서의 불연속 그라디언트 원심 분리에 의해 회복된다. 이 논문은 진드기 창자의 분리를위한 실현 가능하고 참신한 기술을 설명한다.세포. 이러한 상피 세포의 표면에서 분리 된 Biotinylated 세포 표면 단백질은 FACS 및 / 또는 LC-MS / MS 분석과 같은 다운 스트림 응용 프로그램에서이어서 분석 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.4% Trypan Blue</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td>3322</td><td></td></tr><tr><td>100mM Carbonate Buffer</td><td></td><td></td><td>3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6</td></tr><tr><td>16 mL centrifuge tubes with sealing cap</td><td>Thermo Scientific</td><td>3138-0016</td><td>Cool in ice prior to gradient</td></tr><tr><td>250 &amp;micro;M cell strainer</td><td>Thermo Fisher</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;prime;,5,5&amp;prime;-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td>Stored at 4C</td></tr><tr><td>30% Hydrogen Peroxide</td><td>Labscene</td><td>BSPA5.500</td><td></td></tr><tr><td>4-20% Tris-MOPS Gel</td><td>Gen Script</td><td>M42015</td><td></td></tr><tr><td>4-Chloro-1-naphthol tablet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6788</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Tube</td><td>Corning Blue</td><td></td><td>30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube.</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;M cell strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>AP15 filter paper</td><td>Millipore</td><td>AO1504200</td><td></td></tr><tr><td>Biotin (Type A) Conjugation Kit</td><td>Abcam</td><td>Ab102865</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>DP Manager&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>2.2.1.195</td><td>Cell imagery software</td></tr><tr><td>Duct Tape</td><td>Home Handyman</td><td></td><td>48mm x 25mm Duct Tape</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>DMEM - ice cold for protocol</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>0105-500G</td><td></td></tr><tr><td>F96 Maxisorp Immuno Plate</td><td>Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td>FCS</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Olympus&amp;nbsp;</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield with DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6057-20ML</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td></td><td>#9 Dumont - Switerzland</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Glycerol for molecular biology &gt;99%</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>Hand-Held Counter</td><td>Officeworks</td><td>JA0376230</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>H9394</td><td>HBSS &amp;ndash; ice cold for protocol</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Optik Lakor</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>L-Glutathione oxidized</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4376</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic Separation Stand</td><td>Novagen</td><td>-</td><td>4-Tube Magnetic Separation Rack</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Water</td><td>Millipore</td><td>ZRXQ003WW</td><td>Integral Water Purification System for Ultrapure Water</td></tr><tr><td>Nitrocellulose Membrane</td><td>Life Sciences</td><td>66485</td><td>30cm x 3M pure nitrocellulose membrane</td></tr><tr><td>PageRuler Prestained protein Ladder</td><td>Thermo-Fisher</td><td>SM0671</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Pump</td><td>Masterflex</td><td>7518-10</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6560</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer</td><td>Thermo-Scientific</td><td>37573</td><td>Stored at 4C. Blocking Buffer</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8215-5ML</td><td>PIC &amp;ndash; stored at -20 &lt;b&gt;&amp;deg;&lt;/b&gt;C</td></tr><tr><td>Quick Start Bradford Dye Reagent 1x</td><td>Biorad</td><td>500-0205</td><td>For Bradford Assay</td></tr><tr><td>Quick Start BSA Standards</td><td>Biorad</td><td>500-0207</td><td>BSA standards for Bradford Assay</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Lab. Co</td><td></td><td>Size 11 Scalpel</td></tr><tr><td>SilverQuest TM Staining Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr><tr><td>Simply Blue TM Safe Stain&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall C6+ Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin (HRP)</td><td>Abcam</td><td>AB7403</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Magnetic Beads</td><td>New England Biolabs</td><td>S1420S</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue - Ultra Fast Mini</td><td>UHU</td><td></td><td>UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini</td></tr><tr><td>Table-top Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Fisher</td><td>20490</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Biorad</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Ratek</td><td>VM1</td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Grant</td><td>GD100</td><td></td></tr></tbody></table>

purification of biotinylated cell surface proteins from rhipicephalus microplus epithelial gut cells

Rhipicephalus microplus - 가축 진드기는 여러 병원균의 벡터 인 가축에 대한 경제적 영향 측면에서 가장 중요한 외부 기생충입니다. 진드기 장 상피 세포의 표면에 위치한 BM86과 같은 백신 후보 물질의 발견에 초점을 맞추어 유해한 영향을 줄이기위한 가축 진드기 관리에 전념했다. 현재 연구는 cDNA 및 게놈 라이브러리의 활용에 초점을 맞추고 다른 백신 후보 물질을 스크리닝합니다. 진드기 배아 세포의 분리는 진드기 배트 세포막에서 표면 단백질의 조성을 조사하는데 중요한 이점을 구성한다. 이 논문은 semi-engorged R. microplus 의 진드기 장 내용물로부터 상피 세포를 분리하기위한 새롭고 실현 가능한 방법을 구성한다 . 이 프로토콜은 TCEP와 EDTA를 사용하여 상피 세포를 상피 세포지지 조직과 불연속 밀도 원심 분리 그라데이션에서 분리합니다다른 세포 유형에서 상피 세포를 분리하는 것. FACS 또는 LC-MS / MS 분석에서 다운 스트림 응용 프로그램을 허용 streptavidin - 링크 마그네틱 비즈를 사용하여 세포 표면 단백질은 biotinylated 및 진드기 상피 세포에서 분리되었습니다.

상피 세포는 R. microplus 의 장 조직으로부터 그림 1에 제시된 도식에 따라 분리되었다. 이 프로토콜을 사용하여 준비된 진드기 배 상피 세포의 대표적인 형광 현미경 이미지를 도 2A에 나타내었다 및 2B. 세포 격리가 semi-engorged R. microplus에서 수행됨에 따라 세포...

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Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Rhipicephalus microplus gut tissue로부터 상피 세포를 분리하기 위해 modified density centrifugation gradient-based 방법을 사용 하였다. 표면 결합 단백질은 스트리타비딘 자성 비드를 통해 바이오 티 닐화되고 정제되어 하류 적용에서 이용되었다.

Biotinylated 세포 표면 단백질의 정제<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; 상피 직감 세포

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

9.4K 조회수.  The University of Queensland.  Rhipicephalus microplus gut tissue로부터 상피 세포를 분리하기 위해 modified density centrifugation gradient-based 방법을 사용 하였다. 표면 결합 단백질은 스트리타비딘 자성 비드를 통해 바이오 티 닐화되고 정제되어 하류 적용에서 이용되었다. 

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A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual nuances in expression from patient to patient. Current methodologies that try to separate cells to fill this niche result in disruption of physiological expression, making the separation technique useless as a diagnostic tool. In this protocol, we describe the functionalization and optimization of a surface for the cellular capture and release. This functionalized surface integrates biotinylated antibodies with a glass surface functionalized with an aminosilane (APTES), desthiobiotin and streptavidin. Cell release is facilitated through the introduction of biotin, allowing the recollection and purification of cells captured by the surface. This release is done through the targeting of the secondary moiety desthiobiotin, which results in a much more gentle release paradigm. This reduction in harsh reagents and shear forces reduces changes in cellular expression. The functionalized surface captures up to 80% of cells in a single cell mixture and has demonstrated 50% capture in a dual-cell mixture. Applications of this technology to xenografts and cancer separation studies are investigated. Quantification techniques for surface verification such as plate reader and ImageJ analyses are described as well.

This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process.

유리 표면 기능화를 통해 표적 세포 격리 방법

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

연구

암 연구학

Split-BioID &#8212; Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced that allow the proximity-dependent labeling of proteins in living cells. One such enzyme, BirA* (used in the BioID approach), mediates the biotinylation of proteins within a range of approximately 10 nm. Hence, when fused to a protein of interest and expressed in cells, it allows the labeling of proximal proteins in their native environment. As opposed to AP that relies on the purification of assembled protein complexes, BioID detects proteins that have been marked within cells no matter whether they are still interacting with the protein of interest when they are isolated. Since it biotinylates proximal proteins, one can moreover capitalize on the exceptional affinity of streptavidin for biotin to very efficiently isolate them. While BioID performs better than AP for identifying transient or weak interactions, both AP- and BioID-mass spectrometry approaches provide an overview of all possible interactions a given protein may have. However, they do not provide information on the context of each identified PPI. Indeed, most proteins are typically part of several complexes, corresponding to distinct maturation steps or different functional units. To address this common limitation of both methods, we have engineered a protein-fragments complementation assay based on the BirA* enzyme. In this assay, two inactive fragments of BirA* can reassemble into an active enzyme when brought in close proximity by two interacting proteins to which they are fused. The resulting split-BioID assay thus allows the labeling of proteins that assemble around a pair of interacting proteins. Provided these two only interact in a given context, split-BioID then allows the analysis of specific context-dependent functional units in their native cellular environment. Here, we provide a step-by-step protocol to test and apply split-BioID to a pair of interacting proteins.

We provide a step-by-step protocol for split-BioID, a protein fragments-complementation assay based on the proximity-labeling technique BioID. Activated on the interaction of two given proteins, it allows the proteomics analysis of context-dependent protein complexes in their native cellular environment. The method is simple, cost-effective and only requires standard laboratory equipment.

그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석

To complement existing affinity purification (AP) approaches for the identification of protein-protein interactions (PPI), enzymes have been introduced ...

생화학

Expression, Isolation, and Purification of Soluble and Insoluble Biotinylated Proteins for Nerve Tissue Regeneration

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most widely used host organism. The flexibility of the system allows for the addition of moieties such as a biotin tag (for streptavidin interactions) and larger functional proteins like green fluorescent protein or cherry red protein. Also, the integration of unnatural amino acids like metal ion chelators, uniquely reactive functional groups, spectroscopic probes, and molecules imparting post-translational modifications has enabled better manipulation of protein properties and functionalities. As a result this technique creates customizable fusion proteins that offer significant utility for various fields of research. More specifically, the biotinylatable protein sequence has been incorporated into many target proteins because of the high affinity interaction between biotin with avidin and streptavidin. This addition has aided in enhancing detection and purification of tagged proteins as well as opening the way for secondary applications such as cell sorting. Thus, biotin-labeled molecules show an increasing and widespread influence in bioindustrial and biomedical fields. For the purpose of our research we have engineered recombinant biotinylated fusion proteins containing nerve growth factor (NGF) and semaphorin3A (Sema3A) functional regions. We have reported previously how these biotinylated fusion proteins, along with other active protein sequences, can be tethered to biomaterials for tissue engineering and regenerative purposes. This protocol outlines the basics of engineering biotinylatable proteins at the milligram scale, utilizing&#160; a T7 lac inducible vector and E. coli expression hosts, starting from transformation to scale-up and purification.

Developing biotinylatable fusion proteins has many potential applications in various fields of research. Recombinant protein engineering is a straight forward procedure that is cost-effective, providing high yields of custom-designed proteins.

신경 조직의 재생을위한 가용성 및 불용성 바이오틴 단백질의 발현, 분리 및 정제

Recombinant protein engineering has utilized Escherichia coli (E. coli) expression systems for nearly 4 decades, and today E. coli is still the most ...

생체공학

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and functioning of multicellular organisms. Detecting these interactions remains technically challenging, however. This manuscript describes a systematic genome-scale CRISPR/Cas9 knockout genetic screening approach that reveals cellular pathways required for specific cell surface recognition events. This assay utilizes recombinant proteins produced in a mammalian protein expression system as avid binding probes to identify interaction partners in a cell-based genetic screen. This method can be used to identify the genes necessary for cell surface interactions detected by recombinant binding probes corresponding to the ectodomains of membrane-embedded receptors. Importantly, given the genome-scale nature of this approach, it also has the advantage of not only identifying the direct receptor but also the cellular components that are required for the presentation of the receptor at the cell surface, thereby providing valuable insights into the biology of the receptor.

This manuscript describes a genome-scale cell-based screening approach to identify extracellular receptor-ligand interactions.

게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

유전학

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins is responsible for a variety of key cellular events, including nutrient delivery, cellular excitability, and chemical signaling.  Many plasma membrane proteins are dynamically regulated by endocytic trafficking, which modulates protein function by altering protein surface expression.  The mechanisms that facilitate protein endocytosis are complex and are not fully understood for many membrane proteins.  In order to fully understand the mechanisms that control the endocytic trafficking of a given protein, it is critical that the protein s endocytic rate be precisely measured.  For many receptors, direct endocytic rate measurements are frequently achieved utilizing labeled receptor ligands.  However, for many classes of membrane proteins, such as transporters, pumps and ion channels, there is no convenient ligand that can be used to measure the endocytic rate.  In the present report, we describe a reversible biotinylation method that we employ to measure the dopamine transporter (DAT) endocytic rate.  This method provides a straightforward approach to measuring internalization rates, and can be easily employed for trafficking studies of most membrane proteins.

Regulated endocytosis governs the cell surface expression levels of the majority of membrane proteins. Here we utilize reducible, membrane impermeant biotinylation reagents to measure the endocytic rate of the dopamine transporter (DAT), a polytopic membrane protein. The method facilitates a straightforward approach to measuring the endocytic rate of most plasma membrane proteins.

가역 Biotinylation에 의해 플라즈마 막 단백질 Endocytic 요금 측정

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

생물학

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

면역학 및 감염병학

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at the plasma membrane. Here, we present detailed protocols for 2 methods that facilitate the study of such processes, both of which are based on the principle of the biotinylation of cell-surface proteins. The first is designed to allow for the semi-quantitative determination of the relative levels of a particular protein at the cell-surface. In it, the lysine residues of the plasma membrane proteins of cells are first labeled with a biotin moiety. Once the cells are lysed, these proteins may then be specifically precipitated via the use of agarose-immobilized streptavidin by exploiting the natural affinity of the latter for biotin. The proteins isolated in such a manner may then be analyzed via a standard western blotting approach. The second method provides a means of determining the endocytic rate of a particular cell-surface target over a period of time. Cell-surface proteins are first modified with a biotin derivative containing a cleavable disulfide bond. The cells are then shifted back to normal culture conditions, which causes the endocytic uptake of a proportion of biotinylated proteins. Next, the disulfide bonds of non-internalized biotin groups are reduced using the membrane-impermeable reducing agent glutathione. Via this approach, endocytosed proteins may thus be isolated and quantified with a high degree of specificity.

Two biotinylation-based methods, designed for determining the cell-surface expression and endocytic rate of proteins expressed at the plasma membrane, are presented in this report.

Biotinylation을 사용하여 기본 Astrocyte 문화에서 단백질의 세포 표면 표현 및 Endocytic 속도를 결정

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

신경과학

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Cell-surface Biotinylation Assay

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively sequestered in the cytoplasm. Once within a cell, these surface proteins can be either destroyed or &#8220;recycled&#8221; back to the membrane. The cell surface biotinylation assay provides researchers with a way to study these phenomena. The technique makes use of a derivative of the small molecule biotin, which can label surface proteins and then be chemically cleaved. However, if the surface protein is endocytosed, the biotin derivative will be protected from cleavage. Thus, by analyzing the uncleaved, endocytosed biotin label, scientists can assess the amounts of internalized surface proteins.In this video, we review the concepts behind the biotinylation assay, delving into the chemical structure of the biotin derivative and the mechanism of its cleavage. This is followed by a generalized protocol of the technique, and finally, a description of how researchers are currently using it to study the dynamics of different cell surface proteins.

세포 표면 비오틴일화 분석

A cell can regulate the amount of particular proteins on its cell membrane through endocytosis, following which cell surface proteins are effectively ...

교육

JoVE Science Education

심화생물학

세포생물학

Assessing the Internalization of  Target Surface Proteins Using a Biotin Derivative

Source: Tham, D. K. L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/55974">Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a method to assess target protein internalization in the mouse cortical astrocytes using biotinylation, followed by cell lysis, streptavidin-based protein extraction, denaturation, and Western blot analysis to confirm successful internalization.

비오틴 유도체를 사용한 표적 표면 단백질의 내재화 평가

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Determining Internalization ...

Biotinylated 세포 표면 단백질의 정제

요약

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