이 프로토콜은 복잡한 숙주 소스에서 세균막, 특히 포도상 구균에 외인성 지방산의 통합을 연구하기위한 프레임 워크를 제공합니다. 이 프로토콜은 닭고기 달걀 노른자에서 분리된 편견없는 지방분석과 지단백 입자를 복합 지방산의 경제적 원천으로 활용하여 지방산이 세균지질에 편입된 정량화합니다. 여기에서 설명하는 질량 분광법 기술은 포도상 구균 지질의 지방산 프로필의 비교할 수 없는 관점을 제공하지만, 다른 세균성 막을 연구하기 위하여 적응될 수 있습니다.
이 프로토콜을 수행할 때 LDL 함유 분획을 식별하고 유지하기 위해 각 분별 단계를 수행해야 합니다. 플라즈마 분획에서 암모니아 황산염을 제거하는 것은 LdL의 하류 응용 프로그램에 매우 중요합니다.
먼저, 멸균 인산염 완충식식염 30밀리리터로 두 번 달걀 노른자 2개를 세척하여 잔류 알부민을 제거합니다. 멸균 파이펫 끝으로 바이텔린 멤브레인을 뚫고 멤브레인의 내용물을 멸균 50 밀리리터 원심분리관으로 배출합니다. pH 7에 약 24~30밀리리터 또는 17개의 어금니 나트륨 염화나트륨 용액을 달걀 노른자에 넣고 적극적으로 섞습니다.
그런 다음 튜브를 흔들 쉐이커에 놓고 섭씨 4도에서 60분 동안 섞습니다. 10°C에서 10도, 000배에서 45분간 달걀 노른자 희석을 원심분리합니다. 상체 플라즈마 분획을 멸균 50 밀리리터 원문 튜브로 옮기고 펠릿 과립 분획을 남깁니다.
그리고 원심 분리기 다시. 먼저, 플라즈마 분획을 흔들 셰이커 또는 이와 유사한 장치에 40° 질량 부피 퍼센트 황산암모늄을 60분 동안 혼합합니다. pH를 조정한 후, 혈장 분획을 섭씨 4도, 000시간 g에서 45분간 원심분리합니다.
상부 반고체 노란색 분획을 7킬로달톤 모공 크기 투석 튜브로 제거합니다. 튜브에 최소 25%의 여분의 공간을 제공하여 팽창할 수 있도록 합니다. 투석 튜브를 3리터의 초순수수에 두어 밤새 섭씨 3도에서 투석을 하여 황산암모늄을 제거합니다.
투석 후, 원심분리는 이전에 설명한 대로 섭씨 4도에서 용액을 원심분리합니다. 상고체 노란색 분획을 멸균 튜브로 조심스럽게 제거하고 섭씨 4도에 보관하십시오. 문화의 하룻밤 배양 후, 2 개의 멸균 250 밀리 리터 당황 플라스크에 500 마이크로 리터를 전송 1 %tryptone 국물의 49.5 밀리리터를 포함하는.
섭씨 37도에서 약 4시간 동안 배양하여 중간 단계에 도달합니다. 25 밀리리터 단위로 100밀리리터 배양을 4개의 멸균 50 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 4개의 튜브를 10, 000배 g에서 펜틀릿으로 전달합니다. 상체를 제거하고 1 %tryptone 국물의 750 마이크로 리터에서 각 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
4개의 750 마이크로리터 세포 현탁액을 단일 15 밀리리터 튜브에 결합합니다. 그리고 6개의 멸균 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 세포 현탁액의 350 마이크로리터를 알리쿼트. 파이펫을 사용하여 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 30 마이크로리터를 추가하여 원하는 최종 농도를 5%이고 4시간 동안 흔들리는 섭씨 37도에서 배양합니다.
원심 분리는 2 분 동안 16, 000 배 g에서 섭씨 4도에서 문화를 원심분리합니다. 그리고 세척멸균 인산염 완충식염식염의 330 마이크로리터에서 세포 펠릿을 다시 중단한다. 이 세척을 한 번 더 반복하십시오.
빈 튜브의 무게를 빼서 6개의 젖은 세포 펠릿의 무게를 기록합니다. 스냅 드라이 아이스에 셀 펠릿을 동결. 먼저 각 셀 펠릿 위에 5mm 지르코늄 산화물 구슬 한 스쿱을 넣습니다.
75%HPLC 급 메탄올740 마이크로리터를 각 튜브에 직접 영하 80도까지 냉각시 넣습니다. 그런 다음 50 마이크로 몰라 디미리스토틸 인스티딜 콜린의 두 마이크로 리터를 내부 표준으로 추가합니다. 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브를 함유한 샘플을 총알 블렌더 조직 균질화기의 사용 가능한 포트에 넣습니다.
저속으로 샘플을 균질화합니다. 3분 동안 2~3분 간 설정합니다. 균질성을 위해 샘플을 시각적으로 검사합니다.
세포의 덩어리가 보이는 경우, 2 분 단위로 총알 블렌더에서 균질화를 계속합니다. 다음으로 화학 연기 후드의 각 샘플에 270 마이크로리터의 클로로폼을 추가합니다. 30 분 동안 적극적으로 샘플을 소용돌이.
원심 분리기는 벤치 상단 원심분리기에서 최소 2, 000배의 최소 30분 동안 샘플을 원심분리합니다. 화학 연기 후드에서 단면 상체를 수집하고 추출 튜브의 바닥에있는 단백질 펠릿을 조심스럽게 피하면서 새로운 테스트 튜브로 옮김하십시오. 이전에 준비된 희석지질 추출물을 적절한 자동 샘플러 바이알로 옮김합니다.
유동 분사 기반 분석을 위해 자동 샘플러 바이알을 모세관 유동 응용 분야의 온도 제어 자동 샘플러에 배치합니다. 원고에 따라 HPLC 시스템을 설정합니다. 용액은 HPLC 이송 라인에서 질량 분광계로 방출되어 저유동 34 게이지 금속 바늘이 장착된 전기 분무 이온화 소스를 통해 소개된다.
Thermo Tune Plus 계측기 제어 소프트웨어에서 이온화 전압을 4, 000 볼트 및 칼집 가스를 5로 설정합니다. 마찬가지로 모세관 온도를 섭씨 150도로 설정하고 S 렌즈를 정의 스캔 버튼을 50%로 클릭하고 분석기 메뉴에서 FTMS를 선택합니다. 질량 범위 필드를 정상으로 설정하고 해상도 필드에서 100, 000을 선택합니다.
검사 유형이 가득 찼습니다. 스캔 범위 메뉴에서 첫 번째 질량 필드에 200을 입력하고 마지막 질량 필드에 2, 000을 입력합니다. 관찰된 질량 정확도를 추가로 정의한 후 총 이온 크로마토그램에서 넓은 피크를 가로질러 신호를 평균합니다.
질량 스펙트럼 보기 창에서 엄지 손가락 아이콘을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 스펙트럼 목록을 봅니다. 동일한 메뉴에서 디스플레이 옵션을 선택한 다음 디스플레이 메뉴의 모든 피크 토글 박스를 선택합니다. 보기 창을 닫기 위해 확인 버튼을 클릭합니다.
질량 스펙트럼 보기 창에서 엄지 손가락 아이콘을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 내보내기 클립보드 정확한 질량을 선택합니다. 첫 번째 워크시트의 내보낸 데이터 셀 A1을 새 Excel 스프레드시트에 붙여 넣고 원고에 따라 진행합니다. 정확한 질량 기반 지질 식별을 수행하려면 LIMSA 소프트웨어를 엽니다.
기본 메뉴에서 스펙트럼 유형 메뉴에서 피크 목록을 선택합니다. 질량 분석 데이터를 획득한 극성에 맞게 양수 모드 또는 음수 모드를 선택합니다. 최대 너비의 절반과 z 창 위에 피크 전체 너비에서 원하는 질량 검색 창을 입력하여 피크 찾기를 찾습니다.
이 프로토콜에서, 플라즈마 분획의 LDL 함량은 30~40킬로달톤 베타 레비틴의 강수량에 의해 더욱 농축되었다. 140, 80, 65, 60 및 15 킬로달톤의 단백질 밴드의 존재는 LDL의 배분 단백질과 상관 관계가 있습니다. 트리클로산치료로 는 지방산이 없는 배지에서 포도상 구균의 성장을 억제한다.
외인성 지방산 소스로 계란 노른자 플라즈마와 문화를 보충 하는 동안 트리클로산 유도 성장 억제를 극복. 마찬가지로, 농축 된 달걀 노른자 LDL트리클로산 처리 문화의 보충은 성장을 복원. 또한, 달걀 노른자 LDL의 첨가는 이전에 특징지어진 S.aureus 지방산, 보조의 성장을 지원합니다.
프리 지방산 함량은 유동 주입 고해상도 정확한 질량 분석법을 사용하여 1%트립톤 국물 또는 닭달걀 노른자 LDL로 측정하였다. 무료 지방산의 최소 한량이 발견되었다. 직교 부분 최소 제곱은 풍부한 포도상 구레나귀 막 인지질의 차별 적 분석을 입증, 치료되지 않은 닭고기 달걀 노른자 LDL 치료 조건의 지방산 조성과 함께, 명확한 클래스 분리를 입증.
닭 달걀 노른자에서 LdL의 농축세균병원균과 숙주 지단백질 사이의 상호 작용을 조사하기 위한 복잡한 지방산의 저렴 한 소스를 제공 합니다. 지질 추출물의 제조에 사용되는 클로로폼과 메탄올은 위험합니다. 화학 연기 후드에 이러한 시약을 사용하고 모든 폐기물 스트림을 포함해야합니다.
