뮤린 아일렛의 인과 피하 백색 지방 조직 (ISWAT) 이식 모형

아슬렛 이식은 타입-I 당뇨병 을 치료하기위한 가장 유망한 접근 중 하나입니다. 그리고 아일렛 이식에 적합한 부위에 대한 검색이 진행 중입니다. 유상증자 백색 지방 조직에 대한 아슬렛 이식은 임상적 영향을 미칠 수 있는 간단하면서도 효과적인 방법입니다.

클리닉에이 절차의 외삽은 타입 I 당뇨병 환자에 대한 치료의 개발로 이어질 수 있습니다. 이 방법은 언어가 islet 이식에 이상적인 사이트가 아니라고 결정되었기 때문에 임상 적 이식에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 절차의 모든 단계, 특히 췌장 소화와 같은 주요 단계를 신중하게 따르는 것이 중요합니다.

시각적 데모는 이 기술을 새로 접한 연구원들이 이 슬레치 격리 및 변환을 수행하는 방법을 더 잘 결정하는 데 도움이 됩니다. 아슬렛 수확을 위해 먼저 10주 된 C57 블랙 6 마우스의 털을 75%에탄올로 분사하고, 갓 준비된 콜라게나제 용액으로 5밀리리터 주사기를 채웁니다. 주사기를 32게이지 굽힘 무딘 뾰족한 관류 바늘로 장착하고, 얼음 가방에 마우스를 척추 위치에 놓습니다.

직선 뾰족한 안과 가위를 사용하여 음모 부위의 피부에 횡단 개방을 하고 동물의 머리를 향해 절개를 확장하십시오. 음모 부위에서 xiphoid 과정에 V 절개를 통해 복부를 완전히 열고 간을 움직여 담낭과 일반적인 담관의 전체 길이를 노출시합니다. 그런 다음 혈관 클램프를 사용하여 일반적인 담관의 십이지장 개구부를 닫고 담낭의 작은 개구부를 자른다.

이전에 준비된 관류 바늘로 개구부를 통해 일반적인 담관을 캔누레이하고, 췌장에 콜라게나아제 용액의 약 2밀리리터를 주입한다. 모든 콜라게나아제가 전달되면 두 쌍의 비침습적 마이크로 핀셋을 사용하여 내장, 위 및 비장에서 퍼프드 췌장을 분리하고 췌장을 얼음 위에 50 밀리리터 원원 튜브에 넣습니다. 모든 샘플을 채취하면 췌장당 100마이크로리터를 췌장당 100마이크로리터를 50밀리리터 튜브에 넣고 10초 동안 각 튜브를 약 40회 흔들어 적당한 흔들림으로 3~5분 동안 3~5분간 수수 욕조에 넣습니다.

인큐베이션이 끝나면 소화를 막기 위해 50밀리리터의 최종 볼륨을 추가합니다. 그리고 펄스 원심 분리는 신속하게 원심 분리기를 중지하기 전에 4 섭씨에서 750 배 G의 속도로 튜브를 원심 분리합니다. 수퍼나티를 폐기한 후, 펠릿을 15~25밀리리터의 스톱 액액을 세척당 2회 세척한 후 동일한 원심분리 조건에서 세척합니다.

두 번째 세척 후 튜브 당 3 개의 펠릿을 새로운 50 밀리리터 원내 튜브로 당기십시오. 그리고 히토파크 1119의 총 10 밀리리터의 부피에서 췌장 세포를 다시 중단한다. 다음으로 각 튜브의 측면에 히토파크 1077의 5 밀리리터를 조심스럽게 추가하고 HBSS의 5 밀리리터가 뒤따릅니다.

세포를 원심분리로 분리하고 5밀리리터 파스퇴르 파이펫을 사용하여 HBSS Histopaque 1077 인터페이스에서 섬을 수집합니다. 펄스 원심분리를 위한 스톱 솔루션 50밀리리터의 최종 부피로 새로운 50밀리리터 원모형 원적 튜브에 섬을 풀로 붙이고, 상체를 폐기한다. 1분 원심분리를 위해 30밀리리터의 신선한 스톱 솔루션으로 펠릿을 재중단하고, 30밀리리터의 배양 배지에서 섬을 재보설한다.

섬을 튜브 당 10센티미터 의 가벼운 문화 접시에 넣습니다. 그리고 스테레오 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 200 마이크로리터 젤 로딩 파이펫 팁을 사용하여 용액에서 흰색 스페로이드 섬을 손으로 선택합니다.

섬들을 수확할 때 배양 배지 10밀리리터를 함유한 처리되지 않은 세포 배양 접시에 넣습니다. 가벼운 현미경으로 염색하는 디티존에 의해 손으로 수확한 섬의 순도를 확인하십시오. 그리고 형광제 제비에 의해 섬의 생존가능성을 검출하여 유안증이 플로리스트 현미경으로 염색한다.

그런 다음 분리된 섬을 신선한 배양 배지에서 섭씨 37도에서 95%의 공기와 이식전까지 이산화탄소 5%로 배양합니다. 당뇨병 유도 후 3일과 4일을 시작으로, 각 연쇄상 조토신 주입 8주 된 남성 C57 블랙 6 마우스의 소달 정맥을 10:00 a.m 주위로 천자합니다.

기본 혈당 모니터링 기구를 사용하여 각 마우스의 비 금식 혈액 포도당 수준을 결정한 다음 개별 검사 스트립에 혈액을 추가하십시오. 동물이 이틀 연속 리터당 적어도 20 밀리몰의 혈당 수준을 입증했을 때, 계량 및 수신자 마우스를 표시하고 마취 된 동물의 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인합니다. 해빙을 위해 얼음위에 영하 20도의 하이드로겔을 보관합니다.

그리고 수용자당 450~500개의 섬 등가물을 얼음에 튜브당 200마이크로리터를 함유한 멸균 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 이송한다. 75%에탄올로 받는 사람의 왼쪽 잉구영역을 스와브하고 마우스를 스핀 위치에 놓습니다. 수술 용 테이프로 팔다리를 고정하고 클리퍼를 사용하여 수술 부위 주변의 머리카락을 제거하십시오.

요오도프터로 수술 부위를 면봉하고 소독된 피부에 수직 절개를 합니다. ISWAT 내의 열등한 상복부 동맥과 정맥을 식별하고 혈관 위에 작은 주머니를 만듭니다. 원심분리에 의해 섬의 퇴적물을 제거하고 가능한 한 많은 상퍼를 제거하십시오.

각 튜브에 해동 된 하이드로겔 20 마이크로 리터를 추가하고 거품을 피하기 위해 섬을 부드럽게 다시 중단합니다. 균질현탁액이 얻어지면 200마이크로리터 파이펫 팁을 사용하여 한 튜브에서 전체 슬레톤 하이드로겔 혼합물을 주머니에 조심스럽게 전달한다. 하이드로겔이 완전히 고화되면 이식 부위에 세팔로스포린 20 마이크로리터를 추가하고 5-0 연속 수술 봉합사로 근육과 피부를 닫습니다.

그런 다음 수신자를 완전한 재조정이 있을 때까지 모니터링할 수 있는 열 패드의 깨끗한 케이지에 넣습니다. 뮤린 섬 처리 후 입증 된 바와 같이, 고립 된 뮤린 섬은 이식을 위해 충분히 순수할 것이다. 생존가능성이 높은 고립된 섬만 이식에 사용해야 합니다.

하이드로겔과 함께 이목 이식편을 철저히 혼합한 후, 이식편은 ISWAT 부위에 이식될 수 있다. ISWAT로 이식한 지 약 1개월 후, 아슬렛 이식편은 고혈당증을 역으로 바꾸고 받는 마우스의 체중이 점차 증가한다. 이식 후 100일 후에 이식편을 제거하면 10:00 a.m 즉시 증가합니다.

비 금식 혈액 포도 당 수준. 이 시점에서 조직학적 분석은, 이 슬레그래프가 그대로 남아 있음을 보여준다. 그리고 인슐린과 글루카곤 면역형광염색은 이식된 섬도 이식 후 100일 후에 기능한다는 것을 나타낸다.

숙련 된 췌장 세포를 너무 강하게 흔들지 않도록주의하거나 얻어진 섬의 능력이 손상됩니다. 격리된 섬은 현장에서 분리된 이식의 효과를 현장에서 잉게인 피하 백색 지방 조직으로 비교하기 위해 신장 캡슐 하에서 이식될 수 있다. 절차는 간 외에 다른 사이트에 islet 이식의 임상 시험의 개시를 추가할 것입니다.