간은 인간 췌도 임상 환경에서 이식을위한 주요 부위입니다. 마우스 간내 섬 이식은 기술적으로 어려운 일이며, 높은 비율의 마우스가 수술 합병증, 특히 출혈로 사망 할 수 있습니다. 이 연구에서, 우리가 보여준 두 가지 방법 모두 출혈로 인한 마우스 사망을 효과적으로 예방할 수 있습니다.
우리의 방법은 암세포, 중간엽 줄기 세포 및 간세포를 간장에 직접 주입 할 수있게함으로써 간암 및 기타 간 질환 연구에 적용 할 수 있습니다. 시작하려면 부드러운 긁힘으로 인간의 섬 문화를 분리하십시오. 1 입방 센티미터 주사기를 사용하여 얼음 위에 멸균 된 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리 튜브에 300 ~ 350 개의 섬을 선택하십시오.
모든 섬이 채취되었을 때, 튜브를 10초 동안 원심분리하여 세포를 침전시킨다. 펠릿 손실을 방지하기 위해 소량의 상청액을 제외한 모든 것을 버리고 5 % BSA를 함유 한 200 마이크로 리터의 HBSS에 섬을 재현탁하십시오. 재현탁 된 섬을 5 밀리리터 인슐린 주사기에 넣고 주사기 바늘을 1 분 동안 돌려 섬이 플런저에 정착하도록하십시오.
플런저를 눌러 기포를 제거하고 주사기에 약 100 ~ 150 마이크로 리터의 용액을 유지하고 섬을 고르게 분배하기 위해 부드럽게 두드리면서 주사기를 뒤집습니다. 페달 반사에 대한 반응 부족을 확인한 후 건조를 방지하기 위해 눈에 연고를 바르십시오. 마취 된 마우스의 복부를 면도하여 모피를 제거하고 2 % 요오드와 75 % 알코올의 세 가지 번갈아 가며 닦아서 수술 부위를 소독하십시오.
다음으로 복부를 1 ~ 1.5 센티미터 절개하고 복강을 엽니 다. 절개 주위에 멸균 거즈 조각을 놓고 포셉이나 면화 팁을 사용하여 장을 거즈로 부드럽게 옮깁니다. 그런 다음 식염수에 담근 거즈 조각으로 장을 덮고 포털 정맥을 노출시킵니다.
젤 폼을 사용하여 췌도 전달로 인한 출혈을 막으려면 베벨이 아래를 향하도록 바늘을 잡고 바늘을 포털 정맥에 삽입하기 전에 포털 정맥 벽에 평행한 개구부가있는 바늘 팁을 배치하십시오. 플런저를 후퇴시켜 20 ~ 50 마이크로 리터의 혈액을 주사기에 끌어 들여 섬과 혼합하기 전에 섬을 포털 정맥에 주입하면서 플런저를 반복적으로 우울하게하고 수축시킵니다. 모든 섬이 배달되면 주사 부위 위에 약 5 x 5 센티미터의 젤 폼 조각을 놓습니다.
면 팁을 사용하여 포털 정맥에서 바늘을 제거하는 동안 젤 폼을 아래로 누릅니다. 젤을 약 2 분 동안 제자리에 고정시키고 젤 폼을 굴려 포털 정맥을 덮고 있는지 확인하십시오. 출혈이 멈추면 장을 원래 위치의 복강으로 부드럽게 되돌리고 500 마이크로 리터의 따뜻한 식염수를 복강에 주입하십시오.
봉합사를 사용하여 근육과 피부층을 닫으십시오. 그런 다음 마우스를 마취에서 완전히 회복 될 때까지 모니터링하여 가열 패드의 깨끗한 케이지에 놓고 12 시간마다 진통제를 투여하고 48 시간 동안 가열하십시오. 지방 패드를 사용하여 췌도 전달로 인한 출혈을 멈추려면 입증 된대로 포털 정맥을 노출 한 후 두 개의 면화 팁을 사용하여 노출 된 정맥을 왼쪽과 오른쪽에 유지하고 십이지장과 포털 정맥 사이의 지방 조직 패드를 찾습니다.
포털 정맥에 삽입하기 전에 바늘 팁으로 뚱뚱한 패드를 관통하십시오. 설명 된대로 섬을 포털 정맥에 주입하십시오. 모든 섬이 전달되면 정맥에서 바늘을 제거하면서 면봉으로 지방 조직을 약 1 분 동안 누르십시오.
그런 다음 장을 복강으로 되돌리고 입증 된대로 나머지 수술 후 치료 절차를 수행하십시오. 췌도 이식의 효과는 500 개의 섬이 옮겨 질 때 합성 췌도 이식 후 30 일 후에 정상적인 혈당이 관찰되지만 250 개의 섬이 전달 될 때 일시적인 정상 혈당 만 관찰되고 이식 후 10 일까지 마우스가 고혈당증으로 되돌아 가기 때문에 용량 의존적입니다. 증가된 체중은 두 그룹 모두에서 관찰되며, 인간 섬이 당뇨병성 NOD-SCID 마우스에 이식될 때 관찰되는 동일한 반응이 관찰되며, 더 많은 수의 췌도 등가물이 이식될 때 노르모글리혈증이 관찰되지만 더 적은 숫자는 관찰되지 않는다.
이송 후 출혈이있는 대부분의 마우스는 수술 후 사망하지만 출혈이없는 마우스는 생존합니다. 이식 후 28 일에, 인슐린 염색은 대부분 혈관에 가까운 간 전체에 걸쳐 인간 섬의 균일 한 분포를 보여줍니다. 인슐린 이외에, 피브린 및 다형핵 세포 여과는 또한 이식된 인간 섬들 내에서 관찰된다.
간내 섬 이식은 출혈을 일으킬 수있는 포털 정맥에 큰 구멍을 생성합니다. 우리의 두 가지 개선 된 절차를 사용하면 출혈을 예방하고 췌도 이식 후 사망률을 줄일 수 있습니다. 포털 내 췌도 이식 모델은 임상 인간 췌도 이식을 모방할 수 있다.
우리의 세련된 절차는 수용자의 생존율을 높일 수 있으며, 이는 이식 후 더 많은 췌도 기능 연구를 가능하게합니다.
