대사 산물은 게놈 환경 및 관리 관행과 같은 요인에 의해 영향을 받습니다. 이러한 요소 간의 상호 작용을 이해하면 제품의 수율과 품질을 보다 정확하게 예측하고 관리할 수 있습니다. 전통적인 2개가 아닌 세 번째 이동 단계를 통합함으로써 이 기술은 더 넓은 범위의 대사 산물을 분리하고 검출할 수 있게 합니다.
메타볼로믹스는 생물학의 모든 영역에 적용될 수 있었습니다. 첫째, 유기체의 생화학에 대한 깊은 이해를 달성하고 생리학과 관련하여 생체 내 또는 생물학적 스트레스에 대한 반응을 설명하는 데 도움이됩니다. 둘째, 바이오마커를 연구 하에 의기양양하게 연관짓는다.
이소프로필 알코올은 점성 용매이기 때문에, 낮은 플레어 속도로 도입되어야 하며, 구성을 98%로 높이기 전에 충분한 평형 시간을 도입하여 이러한 단계는 색채 그래픽 시스템이 과압, 오류 반환 또는 잠재적으로 분석 열을 손상시키는 것을 방지할 것이다. 곡물의 준비를 시작하려면 실험실 블렌더를 사용하여 곡물을 갈아. 블렌더를 20초 동안 고속으로 실행한 다음 반복합니다.
베이스에서 블렌더 항아리를 제거합니다. 믹서기 항아리의 측면을 탭하여 거친 접지 곡물을 샘플 표면에 가져옵니다. 거칠게 분쇄된 곡물은 폐기하거나 저장할 수 있습니다.
블렌더에서 2밀리리터 플라스틱 마이크로 원심분리기 튜브로 미세하게 분쇄된 곡물을 전달합니다. 추출과 같은 날에, 원고에 설명된 대로 추출 용매를 준비한다. 다음으로, 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 200 밀리그램의 미세 접그레인을 계량합니다.
튜브의 곡물에 추출 용매 500 마이크로리터를 추가합니다. 또한 빈 튜브에 500 마이크로리터의 추출 용매를 추가하여 빈 공간을 준비합니다. 6, 500 RPM으로 설정된 균질화제를 사용하여 용매와 곡물을 20초 동안 혼합합니다.
그런 다음 20초 동안 반복합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 4도, 100배, 5분간 원심분리합니다. 상체를 2밀리리터 플라스틱 튜브로 옮기고 펠릿을 유지합니다.
펠릿에서 추출 과정을 두 번 반복합니다. 세 개의 수퍼나티를 결합하여 약 1.5 밀리리터의 총 추출물 볼륨을 산출하고 소용돌이에 섞습니다. 품질 관리에 사용되는 모든 곡물 추출물의 풀링된 샘플을 만들기 위해 각 곡물 추출물의 55마이크로리터를 2밀리리터 튜브와 소용돌이로 옮기십시오.
그런 다음 이 풀이 된 샘플의 50 개의 마이크로 리터 알리쿼트를 유리 바이알로 옮기습니다. 각 곡물 샘플 추출물의 50 마이크로리터 알리쿼트를 유리 바이알로 옮기. 서면 원고에 설명된 바와 같이 액체 크로마토그래피 질량 분석법에 필요한 솔루션을 준비한다.
LCMS 분석 당일, 밀리리터 류신 엔케팔린당 200 나노그램을 함유한 5%아세토닐릴100밀리리터를 준비합니다. 이 용액의 마이크로리터 950마이크로리터를 곡물 추출물의 50 마이크로리터 알리쿼트가 들어 있는 유리 바이알에 추가합니다. 소용돌이에 의해 유리병에 내용기를 혼합.
먼저 원고와 제조업체의 사용자 가이드에 설명된 대로 계측기 교정을 설정합니다. 다음으로, LCMS 급성 용매를 사용하여 LC 유체 시스템을 제거하고 플러시합니다. LC 방법 시작 조건을 사용하여 LC 시스템을 평형화하여 열 압력이 안정화되도록 합니다.
계측기 시퀀스 테이블을 설정합니다. 시료 시퀀스의 시작 부분에 나트륨 포메이트를 주입하여 계측기 교정을 확인합니다. 먼저 용매 및 전두엽 블랭크를 분석하고 시스템 컨디셔닝을 위한 풀링된 품질 관리 샘플과 무작위 샘플 목록을 분석합니다.
기술 복제로 품질 관리 샘플을 정기적으로 실행합니다. 시퀀스의 끝에서 두 개의 품질 관리 샘플을 실행합니다. 시퀀스가 실행되는 동안 내부 표준 질량 정확도와 신호 재현성을 모두 포함하여 데이터 품질을 확인합니다.
신호 재현성을 확인하려면 오버레이 스펙트럼의 육안 검사로 충분합니다. 곡물 추출물을 준비하는 데 사용되는 용액에 4개의 내부 표준이 포함되었다. LCMS 동안 양수 및 음의 이온화 모드 모두에서 양질량 정확도와 내부 표준의 단일 재현성이 관찰되었습니다.
공백 의 분석에 따라, 음수 모드에서 421 신호와 양성 모드에서 835 신호는 유물로 판단되었다. 이러한 신호는 곡물 샘플의 평균 단일 강도의 5%와 같거나 큰 강도의 공백에 존재하였다. 아티팩트를 제거하고 데이터의 추가 필터링 후 음수 모드는 483개의 기능을 반환했으며 양수 모드는 523개의 기능을 반환했습니다.
약 250개의 특징은 생물학적으로 관련이 있고 밀 품종에 걸쳐 강도가 크게 달랐습니다. 사전 공백, 내부 표준 및 풀링된 샘플의 포함과 같은 품질 관리 조치는 이 프로토콜에서 기억하는 것이 중요합니다.
