우리는 올리고렌드로글리알 계보 세포 정화 및 문화의 효율적인 방법을 설명합니다. 이것은 골수화 과정 도중 oligodendrocytes 분화 및 신경과의 상호 작용을 통제하는 분자 기계장치를 해결할 수 있습니다. 이 흔들리는 기술은 비싸지 않으며 올리고드엔드로키테의 높은 양을 얻는 것이 최적입니다.
이러한 문화는 신경과 oligodendrocytes의 oligodendrocyte 조건 된 매체및 공동 배양을 생산 할 수 있습니다. 다발성 경화증은 중추 신경계의 초점 제거 근생에 의한 질병이며, 올리고드엔드로시스 손실에 이차적으로 발생합니다. Oligodendrocytes 문화는 재신비화를 촉진하는 방법을 더 잘 이해할 수 있는 도구를 제공합니다.
오직 oligodendroglial 세포 배양만 oligodendrocytes의 발달 그리고 생물학을 통제하는 본질적인 기계장치에 통찰력을 제공할 수 있었습니다. 뉴런과의 공동 배양은 뉴런 생리학에 미치는 영향에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 시작하려면 곡선된 집게를 사용하여 동물의 머리를 눈 높이에서 유지합니다.
작은 수술 가위를 사용하여 두개골 의 바닥에 작은 절개를하고 뇌 중간선 다음 두개골을 잘라. 집게를 사용하여 중간선에서 두개골의 두 부분을 부드럽게 벗겨냅니다. 작은 수술 숟가락을 사용하여 머리 구멍에서 뇌를 제거하십시오.
얼음에 얼음 차가운 PBS 포도당을 포함하는 60 밀리미터 페트리 접시에 뇌를 넣어. 스테레오 현미경으로 보고, 뇌반구에서 소뇌, 뇌 줄기 및 후각 전구를 제거하기 위해 미세 한 집게를 사용합니다. 두 대뇌 반구를 분리하기 위해 미세 한 집게를 사용합니다.
미세 한 집게를 사용 하 여 수막을 벗겨. 대뇌 코르티치를 60mm 페트리 접시에 얼음 위에 놓습니다. 라미나르 플로우 후드에서 날카로운 메스를 사용하여 대뇌 코르티치를 잘게 자릅니다.
다진 조직을 효소 소화 배지를 함유한 50밀리리터 튜브로 옮기습니다. 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 가습된 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 피질 조직이 튜브의 바닥에 남아 있는지 확인하면서 부드럽게 효소 소화 매체를 제거하기 위해 파이펫을 사용합니다.
P1000 마이크로파이프를 사용하여 DMEM 10% 태아 종아리 세럼 1밀리리터를 추가하고 조직을 부드럽게 세리로 세리세울 수 있습니다. 70미크론 필터와 1밀리리터 주사기의 피스톤을 사용하여 피질 조직을 50밀리리터 튜브로 필터링합니다. DMEM 10% 태아 종아리 혈청으로 50 밀리리터 튜브의 내부 튜브 벽에 잔류 조직을 여러 번 헹구십시오.
DMEM 10% 태아 종아리 세럼으로 50 밀리리터 튜브를 채웁니다. 원심분리기는 실온에서 5분 동안 423배 g로 합니다. 조심스럽게 상체를 제거하고 DMEM 10 % 태아 송아지 혈청의 두 밀리리터로 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
P1000 마이크로파이프로 셀 펠릿을 부드럽게 세살한 다음 P200 마이크로파이프를 사용합니다. DMEM 10%의 태아 종아리 혈청의 적절한 부피로 세포 현탁액을 희석시 희석시. T-150 플라스크에 셀 서스펜션의 5 밀리리터를 1회 10분의 1의 밀도에서 제곱센티미터당 제5세포로 플레이트한다.
각 T-150 플라스크에 따뜻한 DMEM 10% 태아 송아지 세럼 20밀리리터를 추가합니다. 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 가습된 인큐베이터에서 배양하십시오. 250 rpm 및 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 샘플을 흔들어 본 후, 주로 올리고원드로시테 계보 세포를 포함하는 플라스크의 상체를 수확하고 일부 미세 글리아 세포뿐만 아니라 코팅되지 않은 100 mm 페트리 접시에 접시를 놓습니다.
페트리 요리를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 가습된 인큐베이터에서 15분간 배양합니다. 이를 통해 접시 표면의 차동 적 빠른 접착을 통해 마이크로 글리아젤 세포를 제거 할 수 있습니다. 한편, 각 T-150 플라스크는 따뜻하고 갓 준비된 배양 배지 25밀리리터를 채우고 2차 흔들림까지 이산화탄소 5% 미만의 37도에서 가습된 인큐베이터에 인큐베이션을 증식합니다.
다음으로, 페트리 접시에서 상체를 새로운 코팅되지 않은 100mm 페트리 요리로 옮겨 잔류 미생물 세포의 접착을 허용합니다. 페트리 요리를 5%의 이산화탄소 아래 37°C의 가습된 인큐베이터에서 15분간 배양합니다. 부착되지 않은 올리고덴드로시테 계보 세포를 포함하는 두 개의 페트리 접시마다 상체를 제거하고 50 밀리리터 튜브로 옮킨다.
마이크로글리아로 도금된 페트리 접시를 버리십시오. 423배 g에서 5분간 튜브를 원심분리합니다. 조심스럽게 상체를 제거하고 보텐슈타인 - 사토 매체의 1 밀리리터로 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
일반적인 50 밀리리터 튜브에 모든 펠릿을 풀고 보텐슈타인-사토 배지를 사용하여 세포 밀도에 따라 20 또는 30 밀리리터로 볼륨을 조절합니다. 셀 서스펜션의 10 밀리리터와 함께 2~3개의 프리코팅 된 100mm 페트리 접시를 접시. 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 가습된 인큐베이터에서 배양하십시오.
2시간 후, 보텐슈타인-사토 매체를 모두 새로 고치어 페트리 요리의 잔해를 치웁울 수 있습니다. 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 가습된 인큐베이터에서 배지에서 이틀 동안 배양하십시오. 이틀 후, 현미경으로 문화를 검사하십시오.
라미나르 플로우 후드에서 멸균 조건하에서 따뜻한 MPB-27 저배지 10밀리리터로 배양 배지를 갱신합니다. 이산화탄소 5% 미만의 섭씨 37도에서 가습 된 인큐베이터에서 이틀 동안 배양하십시오. OCM을 수확하려면 올리고드렌드로키테분비드 인자를 포함하는 상체를 수집합니다.
필터는 0.22 미크론 필터를 사용하여 OCM을 살균합니다. 이 프로토콜에서, oligodendrocyte 혈통 세포는 성상 세포와 microglia를 흔들어 서 신경교 배양에서 정제되었다. 상이한 마커의 발현을 분석한 결과, 올리고드렌드로시테 배양은 O4 양성 세포의 90 플러스 또는 마이너스 4%, 85플러스 또는 마이너스 7%NG2 양성세포, 4.7플러스 또는 마이너스 2.1%의 PLP 양성세포를 함유한 전 올리고드엔드로시테였으며, 반면, 7.2플러스 또는 마이너스 2.5%의 세포가 GFAPP양성세포였다.
이러한 배양으로부터 생산된 OCM은 체외에서 3일 간 첨가되어 정제된 해마 뉴런 배양에 추가되었다. 이 치료는 노장 단백질의 클러스터링을 촉진합니다. 해마 뉴런의 골수화는 체외에서 14 일 동안 올리고드 렌드로치의 첨가를 통해 연구되었다.
20일에서 24일 간 체외에서 미엘린 기본 단백질과 같은 미엘린 마커의 면역 염색은 Ranvier의 미엘린 세그먼트 및 노드의 시각화를 허용했습니다. 코어 PBS는 수막 제거에 중요합니다. 활발한 클리어링은 올리고드렌드로치의 생존능력과 피펫에 적용된 흐름의 강점을 실현하는 데 매우 중요합니다.
Oligodendrocyte 조건 된 배지 는 신경 생리학에 oligodendroctyes 분 비 요인의 영향에 대 한 통찰력을 얻기 위해 신경 문화에 추가할 수 있습니다. 신경과 oligodendroctyes의 공동 배양은 또한 근생 과정을 공부하기 위하여 수행될 수 있습니다.
