The work was funded by the University of Zurich. The authors would like to thank Estrela Neto and Dr. Meriem Lamghari for helping in establishing the co-culture conditions.

모든 마우스는 스위스의 동물 복지법에와 칸톤 수의학 사무실, 취리히의 규정에 따라 유지 관리 및 처리되었다. 해부 소재, 문화 미디어, 미세 유체 장치 1. 준비 <ol><li> 오토 클레이브 마이크로 해부 집게와 가위 (121 ° C, 살균 시간 : 20 분) 및 멸균 용기에 보관. </li><li> 37 ° C에서 진탕 기에서 24 시간 동안 1 M 염산으로 이들을 배양하여 커버 글라스 (24mm X 24mm)을 소독. 에탄올 99 %와 멸균 증류수로 2 O 3 배를 세 번 씻으십시오. 건조 후 37 ℃에서 또는 멸균 흐름 후드 된 커버. 마지막으로, 오토 클레이브 또는 살균을 완료하기 위해 자외선 (30 분)로 된 커버를 노출. 커버 슬립 후 70 % 에탄올에 저장 될 수있다. </li><li> 멸균 집게를 사용하여 조심스럽게 패키지에서 축 축삭 격리 장치를 제거하고 멸균 페트리 접시에 배치합니다. </리&gt; <li> 멸균 생검 펀치 사용 (O : 1mm은) 문화 챔버의 대응 샘플 당 하나의 구멍을 배양 할 (그림 1)를 작성합니다. 참고 : 그들은 가해지는 압력에 의해 손상 될 수 있습니다로, 마이크로 그루브에 너무 가까이 펀치하지 마십시오. </li><li> 에탄올 70 %에이를 immerging에 의해 축 축삭 격리 장치를 소독. 완전히 멸균 흐름 후드 아래에 드라이 후 축 축삭 격리 장치 및 커버 슬립. 진행하기 전에 3 시간의 최소를 기다립니다. 참고 : 완전 건조는 미세 유체 장치의 결함 조립 발생합니다. </li><li> 6 웰 플레이트에서 35mm 페트리 접시로 또는 우물에 각 coverslip에 배치합니다. </li><li> 분리 장치와 유리 커버 슬립 사이의 완전한 접착력을 허용하기 위해 구부러진 끝 핀셋으로 조심스럽게 단단히 coverslip에 키를 누릅니다에 축 축삭 격리 장치를 놓습니다. </li><li> 각 배양 챔버 내에, 피펫 폴리 D 라이신 150 μL (멸균 된 0.1 ㎎ / ㎖는, H 2 증류수O). 배양 챔버로부터 모든 공기를 제거하기 위하여 5 분 동안 진공 하에서 미세 유동 장치를 놓는다. </li><li> 공기는 여전히 챔버 재 피펫 내의 챔버로 폴리 D 라이신 용액을 알 수있는 경우. </li><li> 37 ° C에서 폴리 D 리신 O / N을 갖는 장치를 부화. </li><li> 멸균 증류수 H 2 O와 챔버를 세 시간을 씻으십시오 </li><li> 150 (PBS에서 시그마 - 알드리치, 5 μg의 / ㎖, 또는 무 혈청 배지) μL 라미닌 작업 솔루션으로 챔버를 입력하고 37 ℃에서 O / N을 품어. </li><li> 다음으로 이루어지는, 삼차 신경절 배양 37 배지 50 ㎖를 준비한다 : 48 ml의 배지로 Neurobasal 배지 1 mL의 B-27 / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 mM L- 글루타민, 5 NG / ㎖ 신경 성장 인자 (100) U (NGF) 0.25 오후 시토신 아라 비노 시드. </li><li> 40 ㎖의 DMEM-F12, 10 mL의 소 태아 혈청 (FBS, 최종 농도 : 20 %)은 다음과 같이 이루어지는 치아 세균 배양 37 배지 50 ㎖를 준비, 100 U / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 mM L- 글루타민, 150 μg의 / ㎖ 아스코르브 산. </li></ol> 2. 마우스 배아 생성 및 해부 <ol><li> (질 플러그 : 개발 0.5, E0.5의 배아 일) 질 플러그에 따라 배아 나이를 결정하고 형태 학적 기준을 통해 그것을 확인합니다. 이 프로토콜을 위해, 우리는 일반적으로 E14.5-E17.5 마우스 배아를 사용합니다. </li><li> 해부 영역과 에탄올 70 %와 입체경을 청소합니다. </li><li> 자궁 경부 전위를 통해 임신 어머니를 희생. 그리드에 제 1 및 제 2 손가락으로 마우스의 목을 차단하고, 결정 꼬리를 잡아 당깁니다. </li><li> 낮은 복부 주위 피부를 해부하고, 가위를 사용하여 복부를 엽니 다. 자궁을 찾습니다 임신의 늦은 단계에서, 자궁이 풍부 복강을 입력합니다. </li><li> 얼음에 PBS로 채워진 튜브에 자궁과 장소를 해부하다. 때 얼음에, 조직은 여러 시간 동안 남아있을 수 있습니다. 제도적 지침에 따라 어머니의 시체를 버리고 </li> &lt;리&gt; 자궁에서 배아를 해부하고 자신의 배외 (extraembryonic) 조직에서 그들을 무료로 제공됩니다. 얼음에 PBS에서 배아를 놓습니다. </li><li> 가위를 이용하여 배아 목을 벨, 마이크로 해부 가위 (도 2A)를 사용하여 헤드의 나머지 아래턱을 분리한다. 삼차 신경에 손상을주지 않고, 정확하게 아래턱을 제거; 후자는 아래턱에 근접 지역화 같이 그들의 사고 손상이 가능하다. 얼음에 아래턱과 차가운 PBS의 머리의 나머지 부분을 보존합니다. </li><li> TG를 해부하기 위해 머리를 가지고 이전에 차가운 PBS로 가득 해부 유리 페트리 접시, 위에 놓습니다. 집게를 사용하여 피부와 두개골을 제거합니다. 다음 telencephalon 및 telencephalon 및 리프트 아래 집게를 배치하여 소뇌를 제거; telencephalon 및 소뇌 노출 두개골의 바닥을두고 함께 플립 것이다. </li><li> (도 2b에 도시) 삼차 신경절 지역화. 집게를 사용하여삼차 신경에서 TG를 분리합니다. 칼으로 해부 바늘을 사용하여 삼차 돌기의 잔해를 제거합니다. 차가운 PBS로 가득 페트리 접시에 해부 TG를 놓고 얼음에 보관하십시오. </li><li> 차가운 PBS로 가득 이전 해부 유리 페트리 접시에, 두개골에서 분리 아래턱을, 배치, 배아 치아를 해부합니다. 칼 같이 해부 바늘을 사용하여, 혀와 턱 주변의 피부를 제거한다. 턱의 중심선을 따라 절단하여 좌우 헤미 턱 별개. 도 1c에 도시 한 바와 같이 치아 세균은 쉽게 볼 수있다. 해부 바늘을 사용하여 치아의 세균을 분리하고 비 치아 조직의 초과를 제거합니다. 차가운 PBS로 가득 페트리 접시에 해부 치아 세균을 놓고 얼음에 보관하십시오. </li></ol> 3. 미세 유체 공동 문화 <ol><li> 절개 후 미세 유체 장치에서 라미닌를 제거합니다. respecti 200 μL와 챔버를 채우미디어를했습니다. </li><li> 집게로 (그림 1D)를 펀칭에 의해 생성 된 구멍에 ​​조심스럽게 해부 TG 치아 세균을 전송합니다. 치아의 세균이 떠 있지 않은지 확인하고이 된 커버에 닿을 때까지 그들은 침몰있다. </li><li> 배양 37 ° C의 배양기에서 샘플, 5 % CO 2. </li><li> 문화 매체마다 48 시간을 변경합니다. 완전히 챔버를 버리지 말 것, 그리고 문화 실에 직접 피펫하지 않습니다. 챔버 내의 기포의 형성을 초래 챔버 전체 비우는; 챔버에 직접 피펫은 축삭 손상을 초래할 것입니다. 우물의 외부 쪽을 향해 피펫을 가리키는 매체를 제거, 이러한 문제를 방지하려면; 마찬가지로, 챔버에 대향 위치한 웰의 측면에 새로운 배지를 피펫. </li><li> 배양 기간 동안 공동 배양을 용이하게 시간 경과 현미경으로 묘화 될 수있다. 공동 배양은 10 일 이상 동안 유지 될 수있다. </li><li> 문화 perio 후D는 실 당 하나의 우물에 PBS 150 μl를 피펫 팅하고, PBS를 실을 통해 세 번 흐를 수 있도록함으로써 실을 씻는다. </li><li> PBS를 제거하고 챔버 당 하나의 잘 파라 포름 알데히드의 150 μL (PBS)에 4 %를 피펫 팅하여 샘플을 수정; 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 3.6에 기술 된 바와 같이 PBS로 두 번 챔버를 씻으십시오. </li><li> 추가 분석을 진행합니다. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation.">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).</li><li>Connor, R., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+maxillary+factor,+a+maxillary+process-derived+chemoattractant+for+developing+trigeminal+sensory+axons.">Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons.</a> Neuron. 24, 165-178 (1999).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

치아의 신경 분포의 시험 관내 연구에서 이전은 삼차 신경절 및 치아 조직 또는 세포 26,28,29의 기존의 공동 문화를 기반으로했다. 이러한 연구는 주로 감각 축색 돌기 (38)에이 세포 또는 조직의 매력적인 효과를 조사하기 위해 실시 하였다. 분야에서 상당한 발전을 가져 있지만, 몇 가지 기술적 인 문제가 발생했다. 치아 세균은 문화 (37)의 몇 일 후에 퇴화하기 시작?...

신경 분포는 기관 및 조직의 1,2- 개발, 항상성 및 재생에 중요한 역할을한다. 5 - 또한, 신경 분포는 줄기 세포의 증식, 분화 및 동원 (3)의 조절에 관여한다. 실제로, 구강 안면 복합체의 조직에서 실현하는 최근 연구는 부교감 신경이 타액의 발달 및 재생 -6,7- 땀샘 중에 상피 전구 세포의 기능을 위해 필요한 것으로 나타났다. 11 - 마찬가지로,이 신경 분포는 입맛 (8)의 개발 및 유지 보수에 대한 필요가 있다고 입증되었다. 따라서, 예컨대 이빨 다른 중요한 구강 안면 기관 및 조직의 신경 분포의 개발에 아직 무시 역할을 분석하는 것이 중요하다. 성인 치아 풍부한 신경 분포에도 불구하고, 반면에 본체 develo의 다른 모든 기관 및 조직에핑 치아는 생후 초기 단계에서 신경 지배되기 시작. 치아는 구강 외배엽과 두개골 신경 능선 유래 중간 엽 사이의 순차 및 상호 작용의 결과로 개발한다. 이러한 상호 작용은 상피 유래 ameloblasts 에나멜과 상아질, 각각 (12)의 형성에 대한 책임이 있습니다 중간 엽 유래 상아 아세포에 상승을 제공합니다. (15) - 우수한 경추 신경에서 삼차 신경과 교감 신경의 감각 신경은 성인 치아 (13)을 신경을 분포시키다. 배아 동안, 신경 섬유가 개발 치아 세균으로 삼차 신경절 프로젝트에서 나오는 점진적으로 그들을 둘러싸고 있지만 치과 유두 중간 엽 (13)에 침투하지 않습니다. 신경 섬유는 상아질 모세포의 분화와 상아질 매트릭스 증착 (16)와 상관 관계가 더 진보 된 발달 단계에있는 치과 펄프 중간 엽를 입력합니다. 치과 펄프 신경 분포는 COMPL입니다eted 곧 구강 (13) 치아 폭발 후. 19 - 다양한 semaphorins 및 뉴로이 odontogenesis 16시 신경 분포의 조절에 관여하는 것으로 이전의 연구 밝혀졌다. 이전 연구는 명확하게 신경 분포가 물고기 (20)의 치아 형성을위한 전제 조건임을 증명하고있다. 최근의 연구는 소닉 고슴도치 (쉬) (21)의 분비를 통해 감각 신경에 의해 조절된다 마우스 앞니 치과 간엽 줄기 세포의 항상성을 보여 주었다. 24 - 그럼에도 불구하고, 치아 개시, 개발 및 재생에 신경 분포의 역할은 여전히 포유 동물 (22) 매우 논쟁의 여지가있다. 생체 내 연구의 과다는 다양한 동물 모델 13,25,26의 개발 및 수리 과정에서 치아 조직의 신경 분포의 패턴에 대한 중요한 정보를 제공하고 있습니다. 그러나, 이들의 대부분은 아프로통증은 신경 섬유 및 대상 기관과 조직 사이의 상호 작용의 분자 기초를 강조 최적 없습니다. 29 - 공동 문화 조사하고 제어 및 격리 된 환경 (26)에서 신경 섬유와 치아 사이의 상호 작용을 조작 할 수있는 가치있는 방법을 구성한다. 동시에, 공동 배양은 다양한 기술에 따라 조정된다. (32) - 예를 들어, 신경 및 특정 치아 조직 (예를 들면, 치과 펄프, 치과 대과, 치과 상피) 종종 30 시간의 긴 기간 동안 조직의 생존을 보장하기 위해 서로 다른 배지를 필요로한다. 29 - 지난 수십 년 동안, 동일한 배양 배지를 이용하여, 종래의 공 배양 감각 신경 섬유 (27)에 구강 및 치아 조직의 개발은 매력적인 또는 반발 효과를 조사하기 위해 매우 짧은 기간 (예 이틀)에 대해 수행되었다.그러나, 배양 기간의 연장은 치아 형태 형성과 신경 분포 cytodifferentiation에의 영향을 조사하고, 표적 기관 내의 분기 신경 섬유의 역학을 연구 할 필요가있다. 따라서, 비 연속 공동 문화는 신경 - 치아 조직의 상호 작용에 대한 연구를 수행하는 것이 더 적합 할 것입니다. 마이크로 유체 시스템은 적절한 배지에서 신경원과 다른 종류의 세포 공동 배양을 허용한다. 그들의 표적 조직 (33)을 포함 함을 향해 마이크로 채널을 통해 신경 세포체에서 축삭 성장을 허용하면서 이러한 장치에서, 치아 조직 및 신경 세포는 다른 구획으로 분리된다. 미세 유체 장치가 이미 암 및 혈관 신생 (35)에 세포 상호 작용에 뉴런과 마이크로 글 리아 (34, 35) 사이의 상호 작용뿐만 아니라 세포를 연구하기 위해 사용되었다. 더욱이, 이러한 시스템은 DORS 간의 상호 작용을 연구하는데 사용되어왔다알 루트 신경과 조골 세포 (36). 우리는 최근 삼차 신경절 (TG)와 치아를 오랜 기간 동안 생존 할 수 있음을 입증 한 경우 공동 배양 한 미세 유체 장치 (37)에. 또한, 우리는 다른 발달 단계에서 이빨이 체외 조건들이 생체 (37)에 표시 삼차 신경 분포에 같은 반발 또는 매력적인 효과를 유지하고 있음을 증명하고있다. 이 프로토콜은 간단하고 강력하고 유연한 방식으로하는 공동 배양 신경 / 신경과 대상 조직 및 제어 및 격리 된 환경에서 이러한 상호 작용의 특정 분자의 역할을 연구에 대한 정보를 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AXIS Axon Isolation Devices</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AX15010-TC</td>
			<td>Microchannels of different lenght are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse beta-NGF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1156-NG-100</td>
			<td>Human and Rat beta-NGF (R&#38;D Systems) are equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of developing tooth germ innervation using microfluidic co-culture devices

신경 분포는 기관 및 조직의 발달, 항상성 및 재생에 중요한 역할을한다. 그러나 이러한 현상의 기초가되는 메커니즘은 아직 잘 이해되지 않는다. 특히, 치아 발달 및 재생의 신경 분포의 역할은 무시된다. 생체 내 연구의 여러 다양한 동물 모델의 개발 및 수리 과정에서 치아 조직의 신경 분포의 패턴에 대한 중요한 정보를 제공하고 있습니다. 그러나 이러한 접근 방법의 대부분은 신경 섬유 및 대상 기관과 조직 사이의 상호 작용의 분자 기초를 강조 최적 없습니다. 공동 문화 조사하고 제어 및 격리 된 환경에서 신경 섬유와 치아 사이의 상호 작용을 조작 할 수있는 유용한 방법을 구성한다. 지난 수십 년 동안, 동일한 배양 배지를 이용하여 종래의 공동 배양이 매우 짧은 기간 동안 수행되었다 (예 이틀)감각 신경 섬유에 구강 및 치아 조직을 개발하는 매력 또는 반발 효과를 알아보고자 하였다. 그러나, 배양 기간의 연장은 치아 형태 형성과 신경 분포 cytodifferentiation에의 영향을 조사 할 필요가있다. 마이크로 유체 시스템은 적절한 배지에서 신경원과 다른 종류의 세포 공동 배양을 허용한다. 우리는 최근 삼차 신경절 (TG) 및 치아 장기간 생존 할 수 있음을 증명하고있다 때 공 배양 미세 유동 장치에있어서, 그들이 이러한 조건들은 생체 내에서 보여 같은 신경 분포 패턴을 유지하는 것이다. 이를 바탕으로, 우리는 분리하고 미세 공 배양하면 시스템의 프로토콜에서 삼차 신경과 치아 세균을 개발하고 공동 문화가 간단하고 유연한 방법에 공동 배양 신경 / 신경과 표적 조직 등을 설명하는 방법을 설명하는 역할을 연구하기 제어 방식에서 이러한 상호 작용에 대한 특정 분자olled과 격리 된 환경을 제공합니다.

이러한 결과는 절연 삼차 신경절은 절연 치아 세균의 개발은 미세 유체 소자의 다른 구획에서 장기간 지속되어, 추가로, 미세 유체 소자의 한 구획에서 성장할 수 있음을 나타낸다. 다른 문화 매체는 두 구획에 사용되는, 두 구획 사이의 마이크로 그루브가 개발 치아 세균으로 삼차 신경절에서 축삭의 확장을 할 수 있습니다. 그림 3 마우스의 공동 문화, 면역 형광 (37)를 통해 ?...

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Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices

Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

미세 유체 공동 문화 장치를 사용하여 치아 세균 신경 분포를 개발 분석

Innervation plays a key role in the development, homeostasis and regeneration of organs and tissues. However, the mechanisms underlying these phenomena ...

analysis-developing-tooth-germ-innervation-using-microfluidic-co

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K 조회수.  University of Zurich. Co-cultures represent a valuable method to study the interactions between nerves and target tissues and organs. Microfluidic systems allow co-culturing ganglia and whole developing organs or tissues in different culture media, thus representing a valuable tool for the in vitro study of the crosstalk between neurons and their targets.

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Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

차 쥐 두피 뉴런과 Glia의 Bilaminar의 공동 문화

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

연구

신경과학

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

문화 접시에있는 기능성 모터 단위 : 척수의 Explants와 근육 세포의 공동 문화

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

Proper neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central nervous system (CNS). This bidirectional communication is sophisticatedly mediated by specific signaling pathways between neuron and glia1,2 . Identification and characterization of these signaling pathways is essential to the understanding of how neuron to glia interaction shapes CNS physiology. Previously, neuron and glia mixed cultures have been widely utilized for testing and characterizing signaling pathways between neuron and glia. What we have learned from these preparations and other in vivo tools, however, has suggested that mutual signaling between neuron and glia often occurred in specific compartments within neurons (i.e., axon, dendrite, or soma)3. This makes it important to develop a new culture system that allows separation of neuronal compartments and specifically examines the interaction between glia and neuronal axons/dendrites. In addition, the conventional mixed culture system is not capable of differentiating the soluble factors and direct membrane contact signals between neuron and glia. Furthermore, the large quantity of neurons and glial cells in the conventional co-culture system lacks the resolution necessary to observe the interaction between a single axon and a glial cell.
	In this study, we describe a novel axon and glia co-culture system with the use of a microfluidic culture platform (MCP). In this co-culture system, neurons and glial cells are cultured in two separate chambers that are connected through multiple central channels. In this microfluidic culture platform, only neuronal processes (especially axons) can enter the glial side through the central channels. In combination with powerful fluorescent protein labeling, this system allows direct examination of signaling pathways between axonal/dendritic and glial interactions, such as axon-mediated transcriptional regulation in glia, glia-mediated receptor trafficking in neuronal terminals, and glia-mediated axon growth. The narrow diameter of the chamber also significantly prohibits the flow of the neuron-enriched medium into the glial chamber, facilitating probing of the direct membrane-protein interaction between axons/dendrites and glial surfaces.

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform MCP-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

This study describes the procedures of setting up a novel neuronal axon and (astro)glia co-culture platform. In this co-culture system, manipulation of direct interaction between a single axon (and single glial cell) becomes feasible, allowing mechanistic analysis of the mutual neuron to glial signaling.

마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

Proper  neuron to glia interaction is critical to physiological function of the central  nervous system (CNS). This bidirectional communication is ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

횡격막 모터 뉴런에 의해 다이어프램 신경 분포의 기능 및 형태 학적 평가

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique cells regarding their extended ramified morphologies and consequently raise several methodological challenges for volume measurement. In the particular case of in vitro neuronal growth, the chosen methodology should include sub-micrometric axial resolution combined with full-field observation on time scales from minutes to hours or days. Unlike other methods like cell shape reconstruction using confocal imaging, electrically-based measurements or Atomic Force Microscopy, the recently developed Fluorescence eXclusion method (FXm) has the potential to fulfill these challenges. However, although being simple in its principle, implementation of a high-resolution FXm for neurons requires multiple adjustments and a dedicated methodology. We present here a method based on the combination of fluorescence exclusion, low-roughness multi-compartments microfluidic devices, and finally micropatterning to achieve in vitro measurements of local neuronal volume. The high resolution provided by the device allowed us to measure the local volume of neuronal processes (neurites) and the volume of some specific structures involved in neuronal growth, such as growth cones (GCs).

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of cells. We describe a fluorescent exclusion method allowing full-field measurement of in vitro neuronal volume with sub-micrometric axial resolution required for the analysis of neurites and dynamic structures implied in neuronal growth.

고해상도 볼륨 이미징의 뉴런 형광의 사용 제외 방법에 의해 및 미세 장치 전용

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

Data Acquisition and Analysis In Brainstem Evoked Response Audiometry In Mice

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as visually evoked potentials (VEPs) or somatosensory evoked potentials (SEPs), the auditory evoked potentials (AEPs) are triggered by the repetitive presentation of identical stimuli, the electroencephalographic (EEG) response of which is subsequently averaged resulting in distinct positive (p) and negative (n) deflections. In humans, both the amplitude and the latency of individual peaks can be used to characterize alterations in synchronization and conduction velocity in the underlying neuronal circuitries. Importantly, AEPs are also applied in basic and preclinical science to identify and characterize the auditory function in pharmacological and genetic animal models. Even more, animal models in combination with pharmacological testing are utilized to investigate for potential benefits in the treatment of sensorineural hearing loss (e.g., age- or noise-induced hearing deficits). Here we provide a detailed and integrative description of how to record auditory brainstem-evoked responses (ABRs) in mice using click and tone-burst application. A specific focus of this protocol is on pre-experimental animal housing, anesthesia, ABR recording, ABR filtering processes, automated wavelet-based amplitude growth function analysis, and latency detection.

Brainstem evoked response audiometry is an important tool in clinical neurophysiology. Nowadays, brainstem evoked response audiometry is also applied in the basic science and preclinical studies involving both pharmacological and genetic animal models. Here we provide a detailed description of how auditory brainstem responses can be successfully recorded and analyzed in mice.

마우스에서 뇌간 에서 데이터 수집 및 분석 음성 응답 청력 측정

Brainstem evoked response audiometry (BERA) is of central relevance in the clinical neurophysiology. As other evoked potential (EP) techniques, such as ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

인간 줄기 세포 유래 내피 세포 및 GABAergic 뉴런에 대한 이동, 화학 적 매력 및 공동 배양 어세포

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials through saltatory conduction. Moreover, an increasing number of reports suggest that oligodendrocytes interact with neurons beyond myelination, notably through the secretion of soluble factors. Here, we present a detailed protocol allowing purification of oligodendroglial lineage cells from glial cell cultures also containing astrocytes and microglial cells. The method relies on overnight shaking at 37 &#176;C, which allows selective detachment of the overlying oligodendroglial cells and microglial cells, and the elimination of microglia by differential adhesion. We then describe the culture of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). We also provide the kinetics of OCM treatment or oligodendrocytes addition to purified hippocampal neurons in co-culture experiments, studying oligodendrocyte-neuron interactions.

Herein, we display an efficient method for the purification of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium that can be used for co-culture experiments.

공동 문화 실험을 위한 올리고엔드로시테 및 올리고엔드로시테-컨디셔닝 배지 생성

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal growth, development, and survival. We describe a detailed method for the use of microfluidic chambers (MFCs) for tracking axonal transport of fluorescently labeled organelles in MN axons. This method is rapid, relatively inexpensive, and allows for the monitoring of intracellular cues in space and time. We describe a step by step protocol for: 1) Fabrication of polydimethylsiloxane (PDMS) MFCs; 2) Plating of ventral spinal cord explants and MN dissociated culture in MFCs; 3) Labeling of mitochondria and acidic compartments followed by live confocal imagining; 4) Manual and semiautomated axonal transport analysis. Lastly, we demonstrate a difference in the transport of mitochondria and acidic compartments of HB9::GFP ventral spinal cord explant axons as a proof of the system validity. Altogether, this protocol provides an efficient tool for studying the axonal transport of various axonal components, as well as a simplified manual for MFC usage to help discover spatial experimental possibilities.

Axonal transport is a crucial mechanism for motor neuron health. In this protocol we provide a detailed method for tracking the axonal transport of acidic compartments and mitochondria in motor neuron axons using microfluidic chambers.

미세 유체 챔버 시스템을 사용하여 모터 뉴런 배양에서 세포기관의 축축한 수송

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing

The aim of this study was to examine the distribution and origin of the calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive sensory nerve fibers of the cranial dura mater using immunofluorescence, three-dimensional (3D) reconstruction and retrograde tracing technique. Here, the nerve fibers and blood vessels were stained using immunofluorescence and histochemistry techniques with CGRP and fluorescent phalloidin, respectively. The spatial correlation of dural CGRP-immuoreactive nerve fibers and blood vessels were demonstrated by 3D reconstruction. Meanwhile, the origin of the CGRP-immunoreactive nerve fibers were detected by neural tracing technique with fluorogold (FG) from the area around middle meningeal artery (MMA) in the cranial dura mater to the trigeminal ganglion (TG) and cervical (C) dorsal root ganglia (DRGs). In addition, the chemical characteristics of FG-labeled neurons in the TG and DRGs were also examined together with CGRP using double immunofluorescences. Taking advantage of the transparent whole-mount sample and 3D reconstruction, it was shown that CGRP-immunoreactive nerve fibers and phalloidin-labeled arterioles run together or separately forming a dural neurovascular network in a 3D view, while the FG-labeled neurons were found in the ophthalmic, maxillary, and mandibular branches of TG, as well as the C2-3 DRGs ipsilateral to the side of tracer application in which some of FG-labeled neurons presented with CGRP-immunoreactive expression. With these approaches, we demonstrated the distributional characteristics of CGRP-immunoreactive nerve fibers around the blood vessels in the cranial dura mater, as well as the origin of these nerve fibers from TG and DRGs. From the perspective of methodology, it may provide a valuable reference for understanding the complicated neurovascular structure of the cranial dura mater under the physiological or pathological condition.

Here we present a protocol to visualize spatial correlation of calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive nerve fibers and blood vessels in the cranial dura mater using immunofluorescence and fluorescent histochemistry with CGRP and phalloidin, respectively. In addition, the origin of these nerve fibers was retrograde traced with a fluorescent neural tracer.

면역 형광 및 신경 추적을 가진 쥐 두개골 듀라 마터의 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드 면역 반응성 내적 내부 발산 시각화

The aim of this study was to examine the distribution and origin of the calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive sensory nerve fibers of the ...