프로토콜의 중요성은 핵 신호에 막에 의존하고 유도 된 만능 줄기 세포의 경우처럼 게놈에 직접 영향을 미치지 않습니다. 혈액 유래 만능 줄기 세포의 비 기질성 특성은 기술의 주요 장점이며, 다양한 재생 의학 분야에서 안전한 임상 적용에 적합합니다. 이 절차를 시연하는 것은 프로젝트 리더인 앤-카트린 쇼트 박사와 실험실의 실험실 조수인 옥사나 그리나크레입니다.
PBMC를 분리하려면 PBS로 희석된 1대 1 혈액 25밀리리터를 밀도 그라데이션 미디어 10밀리리터에 추가하고 혼합물을 30분 동안 300배 G로 원심분리합니다. 파이펫팅을 통해 플라즈마와 밀도 그라데이션 미디어 사이의 인터페이스 레이어를 분리합니다. 멸균 PBS와 원심분리기 5밀리리터로 10분 간 300회 G로 세척합니다.
절차를 두 번 반복한 후, 카운팅 챔버를 사용하여 셀 수를 계산합니다. 15 밀리리터 튜브에 6 x 10을 추가한 다음, 1%BSA로 PBS의 세포에 인간 GPI 연결 막 단백질 특이적 항체를 추가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양함으로써 항체 교차 연결을 수행합니다. 교차 연결 후, 10 %의 FBS로 보충 이스코브의 수정 된 덜벡코의 매체로 인큐베이션 매체를 교체합니다.
15 밀리리터 폴리스티렌 튜브에서 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 흔들어주지 않고 인큐베이터에 넣음으로써 세포를 성장시십시오. 다섯 번째 날에는 이스코브 의 중간 크기의 1~2밀리리터를 15밀리리터 튜브에 10%의 FBS로 보충합니다. 계수 챔버를 가진 배양된 세포를 계산합니다.
그런 다음 약 5 x 10x6세포의 세포 현탁액을 10분 동안 300배 G로 분리하고 멸균 파스퇴르 파이펫으로 생성된 슈퍼네티트를 흡인시한다. 0.5%BSA 와 2 밀리몰러 EDTAp7.2의 사전 냉각 된 PBS의 90 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단. 그런 다음 80 마이크로리터 CD-45 양성 나노 크기의 마그네틱 구슬을 세포 현탁액에 넣고 15분 동안 얼음에 배양합니다.
세포를 세척하려면 PBS 버퍼와 원심분리기 2밀리리터를 10분 동안 300배 G로 추가합니다. PBS 버퍼의 500 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 미리 냉각된 PBS 버퍼 500마이크로리터로 컬럼을 세척하고 자기장에 놓습니다.
셀 서스펜션을 기둥에 놓고 PBS 버퍼 500 마이크로리터로 두 번 세척합니다. 1%BSA로 보충된 Iscove의 매체에서 세포를 수집하고 카운팅 챔버에 있는 세포를 계산합니다. 유리 커버립을 4웰 플레이트에 넣고 희석된 폴리 L-올니틴과 이중 증류수로 코팅합니다.
1시간 동안 섭씨 37도에서 커버립을 배양한 후 이중 증류수로 씻어내라. 라미닌 밀리리터당 0.5~2밀리그램을 천천히 해동하고 커버립 상단에 넣습니다. 2 시간 동안 섭씨 37도에서 배양 한 다음 파이프팅으로 과도한 라미닌을 제거하고 배양 요리에 뉴런 매체 N2를 추가하십시오.
배양 BD 유래 CD-45 네거티브 셀은 라미닌 오르니틴 코팅 유리 커버커버에 N2 배지에서 2일 동안 37도에서 이산화탄소를 5%의 이산화탄소로 커버하여 새로 BD 생성 된 세포의 뉴런 분화를 개시한다. 다음으로, 신경 분화 배지에 있는 배양 세포는 16일 동안 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 인큐베이터에 판을 놓습니다. 멸균물 75밀리리터와 파라포름알데히드 4그램으로 고정물을 준비합니다.
용액이 지워질 때까지 교반할 때 필요에 따라 수산화 나트륨 10을 추가합니다. 용액에 자당 혼합물을 넣고 6개의 일반 염산으로 pH 7.4에 적신니다. 멸균물로 100밀리리터에 볼륨을 가져와보세요.
세포 배양에서 미디어를 제거한 후, 15분 동안 예온 고정물로 배양한 다음 고정을 버리고 세포를 각각 5분 동안 세 번 세척합니다. 즉시 새로 만든 0.3 % Triton-X 솔루션을 추가하고 5 분 동안 세포를 과미화합니다. PBS로 세 번 세척하고 PBS및 5 %BSA의 차단 솔루션을 추가합니다.
로커 플레이트의 실온에서 셀을 1시간 동안 차단합니다. 1%BSA PBS에서 항체의 적절한 희석을 준비하고 실온에서 1.5 시간 동안 로커 플레이트에 항체로 세포를 배양한다. PBS로 셀을 세 번 씻고 세척당 5분간 세척합니다.
세포를 DAPI로 배양하고 현미경으로 시각화를 위한 장착 매체로 커버립을 장착합니다. BD 분화 세포의 형태학적 측면은 1일, 5일, 10일에 연구되었으며, 활성화된 배양에서 비활성화 된 세포의 점진적인 실종 추세와 꾸준히 증가하는 새로운 집단을 보여 주어. BD 분화 세포는 작고 ESC와 유사한 응축 된 크로마틴을 가진 더 적은 세포기관과 큰 핵을 가진 미성숙 한 성립 세포의 특성을 보였다.
세포는 30 일 동안 라미닌 코팅 문화 접시에서 배양 한 후 신경 재분화를 위해 연구되었다. 4 일 일찍, 긴 분기 구조를 가진 첫번째 신경 같이 세포는 검출될 수 있었습니다. 대부분의 작은 구형 세포는 더 큰 길쭉한 모양으로 분기된 세포로 발전하여 신경 혈통으로 분화하는 활성 과정을 암시합니다.
세포의 세포 체와 과정은 미분화 세포보다 더 높은 복잡성을 보였으며, 거친 풍요의 망상과 액틴 필라멘트의 번들의 고밀도를 제시했습니다. 분화 미디어에서 성장하는 세포는 세포 체와 관련된 세포 간 접촉을 자주 확립했으며, 다른 세포는 중성염과 같은 방식으로 세포 프로세스를 포함했습니다. 특정 항체를 사용하여 수행된 면역화학 분석은 BD 분화 세포가 GFAP 성상세포를 포함하여 각종 신경 계보를 향해 재분화할 수 있다는 것을 확인했습니다.
이 기술은 3개의 세균 층의 세포로 재분화할 수 있는 자가성 비 성원 세포를 생성할 수 있게 해, 재생 의학 연구에서 새로운 기회를 열어.
