아실 수지 보조 포획 또는 Acyl-RAC는 다양한 생물학적 샘플에서 단백질 S-acylation을 검출하는 데 사용할 수 있는 민감하고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 프로토콜은 대사 라벨링 및 무선 라벨링의 일부 한계를 우회하고 여러 단백질의 S-acylation을 동시에 검출할 수 있습니다. 살아있는 세포뿐만 아니라 1 차 조직 및 냉동 샘플.
S-acylation은 단백질 인신 매매, 플라즈마 멤브레인 타겟팅, 신호 트랜스듀션, 철 수송 및 단백질 단백질 상호 작용과 같은 다양한 세포 과정을 조절할 수 있습니다. 티오에스테르 결합의 효율적이고 구체적인 분열을 보장하기 위해 각 실험에 대해 신중하게 조정된 pH를 사용하여 갓 준비된 하이드록실라민 용액을 사용하는 것이 중요합니다. 이 방법의 데모를 사용하면 클로로폼, 메탄올 강수량과 같은 단계에 중요합니다.
이 단계에서 얻은 팬케이크 모양 펠릿은 매우 신중하게 처리해야합니다. 단계 도중 시료의 깨지기 쉽고 부분적인 손실이 고르지 않은 시료 회수로 이어질 수 있다. 절차를 시연하는 것은 우리 실험실대학원생인 사바나 웨스트(Savannah West)가 될 것입니다.
세포 리자트를 얻으려면 관심 있는 세포를 원심분리기 튜브로 수집합니다. 그리고 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거합니다. PBS의 5 밀리리터에 펠릿을 세척.
그리고 갓 준비된 리시스 버퍼의 600 마이크로리터에서 세포를 즉시 다시 중단합니다. 시료를 분당 1, 500회전에서 온도 4도에서 30분 동안 열 셰이커로 채취한다. lysates를 지우기 전에, 원심분리에 의한 펠릿 세제 및 수용성 물질.
원심 분리의 끝에서, 얼음에 미리 냉각 된 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에서 클리어 라이세이트를 수집합니다. 그리고 표준 프로토콜에 따라 단백질 농도를 추정하기 위해 브래드포드 또는 bicinchoninic acid 분석기를 수행한다. 메탄올과 클로로폼을 추가하여 2:1 비율로 lysate합니다.
균일한 현탁액을 만들기 위해 엄격하게 흔들어 서 서 원심분리 시료를 수집 하 고 수성 및 유기 상 사이의 인터페이스에서 단백질 펠릿을 수집 합니다. 튜브를 기울이고 바늘이나 젤 로딩 팁을 사용하여 가능한 한 많은 용매를 흡인하십시오. 단백질 펠릿을 몇 분 동안 공기 건조시십시오.
튜브 내용기를 메탄올 600 마이크로리터와 부드럽게 혼합하기 전에 펠릿을 분해하지 않도록 주의하십시오. 메탄올 세척을 조심스럽게 제거한 후, 약 5분간 벤치 탑에 단백질 펠릿을 건조시키십시오. 다음으로, 2SHB 완충제의 200 마이크로리터에서 단백질 펠릿을 다시 중단한다.
그리고 온도 42도, 1, 500 회전에서 열 셰이커. 펠릿이 용해되면 2SHB에 0.2%MMTS의 200 마이크로리터를 샘플에 추가합니다. 그리고 온도 42도에서 15 분 동안 단백질을 배양하고 열 셰이커에서 분당 1, 500 회전을 배양합니다.
인큐베이션이 끝나면 시연된 대로 3:4 클로로폼 메탄올 침전을 수행합니다. MMTS를 제거하려면, 소용돌이와 신선한 2SHB 버퍼의 100 마이크로 리터에 펠릿을 용해. 그리고 각 강수량 후 완충 A의 300 마이크로 리터로 샘플을 희석.
최종 강수량 후, 2SHB 버퍼의 200 마이크로리터에 샘플을 용해하고 완충 A.의 240 마이크로리터로 희석하고 단백질 농도를 다시 측정하고 입력 컨트롤로 각 샘플에서 40 마이크로리터를 따로 둡니다. 샘플을 200 마이크로리터의 두 개의 동일한 부부로 분할합니다. 그리고 튜브를 하이드록실라민과 마이너스 하이드록실라민으로 표시합니다.
새로 준비된 50개의 마이크로리터를 400밀리머에 첨가한 하이드록실라민 튜브에 최종 농도가 추가됩니다. 그리고 중성 2개의 어금니 나트륨염화나트륨의 50마이크로리터가 마이너스 하이드록실라민 튜브이다. 그런 다음 각 튜브에 30 마이크로리터의 TS 비드 슬러리를 추가합니다.
그리고 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 튜브를 회전합니다. 인큐베이션의 끝에서 어떤 잔류 하이드록실라민을 제거하기 위해 버퍼 A에 1 %SDS와 4 번 구슬을 세척. 마지막 세척 후, 3 개의 부드러운 1 분 미세 원심 분리로 모든 비드 샘플을 씻으라.
수퍼네이터를 조심스럽게 흡입하고 각 세척시 완충 A에서 1% SDS의 500 마이크로리터로 구슬을 재차스닝합니다. 마지막 세척 후, 시연된 대로 구슬을 부드럽게 회전시합니다. 그리고 구슬을 방해하지 않고 가능한 한 많은 슈퍼 나티브를 흡인.
구슬에서 단백질을 회수하려면 각 튜브에 4%SDS 샘플 버퍼의 50 마이크로리터를 추가하고 온도 셰이커에서 15분 동안 분당 섭씨 80도 및 1, 500 회전으로 샘플을 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 완전히 구슬을 펠렛 원심분리하기 전에 샘플을 냉각하자. 그런 다음 젤 로딩 팁을 사용하여 용출된 단백질을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮길 수 있습니다.
그리고 SDS-PAGE 젤에 샘플을 실행하여 서양 블로팅에 의한 관심 있는 단백질의 S-acylation을 분석한다. 티로신 키나제 Lck은 중성 2개의 어어 하이드록실라민으로 처리된 리자이트에서 검출될 수 있다. 시스테인 잔류물과 지방산 의 양모 사이의 티오에스테르 결합을 갈라.
단백질 Fyn 및 LAT에 대하여 항체로 제거및 재검하는 것은 아실 수지 지원한 포획 분석이 동시에 다중 단백질의 S-acylation을 분석하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여줍니다. 또한, Lck, Fyn 및 LAT의 S-acylation은 1차 마우스 비장에서 쉽게 검출될 수 있다. 이 수정은 두 종 사이에 보존된다는 것을 나타냅니다.
새로운 S-acylated 단백질의 식별 이외에, 이 방법은 또한 다른 생물학 조건하에서 단백질 S-acylation에 있는 변경을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 새로 확인된 S-acylated 단백질의 수는 이중 업이 Acyl-RAC와 같은 빠르고 신뢰할 수 있는 기술을 의미한 후에 엄청나게 증가했습니다. 새로운 S-acylated 단백질의 식별 이외에, 이 방법은 또한 다른 생물학 조건하에서 단백질 S-acylation에 있는 변경을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다.
