Name: measuring oxidative stress resistance of caenorhabditis elegans in 96-well microtiter plates
Uploaded: 2015-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
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우리는 C의 Caenorhabditis 엘레 유전학 센터를 인정 엘레 균주. 자금 지원은 테리 폭스 연구소에 의해 제공되었다. 우리는 또한 Rolande과 마르셀 Gosselin의 대학원 재학 및 맥길 통합 암 연구 교육 프로그램의 암 연구 FRN53888에서 CIHR / FRSQ 훈련 보조금에서 EP에 부여 된 지원을 인정합니다.

시약 1. 준비 <ol><li> C의 미디어의 준비 (이 경우, 야생형 동물과 flcn -1- (ok975) 돌연변이 동물) 간스 성장. <ol><li> 트리스 염산 5.5 g을, 트리스베이스의 2.4 G, Bactopetone의 31g, 염화나트륨 20g과 콜레스테롤의 0.08 g의 Youngren 유일의 박토 - 펩톤 (참견 마라) 건조 믹스를 수정 준비합니다. 흔들어 잘 섞는다. 참고 :이 믹스 참견 마라 매체의 10 L를 준비하기에 충분하다. 주 : 정상적인 성장 매체 (NGM) 판 참견 마라 판 (27) 대신에 사용될 수있다. 그러나 판의 동일한 유형 균주간에 독립적 반복 사이의 유효한 비교를 위해 사용되어야한다. 이 프로토콜에서는, 우리는 참견 마라 판을 사용했다. </li><li> 참견 마라 건조 믹스 6g, 한천 17g을 추가하여 참견 마라 매체의 1 리터를 준비하고 122 ℃에서 45 분 동안 H 2 O 및 오토 클레이브와 1 L로 구성한다. 판을 붓고 실온에서 2 일 동안 건조 할 수 있습니다. </li><li> 멸균 기법을 사용 cultu 100 ㎖에 접종E.와 LB 국물 매체의 재 대장균 OP50 박테리아 및 37 ℃에서 O / N 성장. </li><li> E.와 씨앗 참견 마라 판 대장균 OP50 박테리아. 그것은 48 시간 동안 실온에서 성장하도록 허용합니다. </li></ol></li><li> 의 RNAi를 사용하여 유전자의 하향 조절을위한 준비 <ol><li> 참견 마라의 RNAi 수유 판을 준비합니다. 단계 1.1.1과 1.1.2에서와 같이 진행합니다. 오토 클레이브 후, 배지는 약 55 ℃로 냉각하고 추가 할 수있는 1 M 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG), 100 mM의 암피실린 1 ㎖를 1 ㎖. </li><li> 킬 E. 콜라이 HT115 제어 EV 또는 한천 플레이트에 암피실린 flcn -1- 특정의 RNAi (50 μg의 / ㎖) / 테트라 사이클린 (15 μg의 / ㎖)를 발현하는 플라스미드로 형질 전환 된 박테리아. 37 ° C에서 문화 O / N 성장. </li><li> 식민지를 선택하고 E. 접종 대장균 HT115 제어 EV 또는 특정의 RNAi-1 flcn과 하나가 37 &amp; #에서 LB / 암피실린 (50 μg의 / ㎖) 매체와 O / N에서 문화를 성장 표현하는 플라스미드로 형질 전환 된 박테리아를176; C. </li><li> E.와 씨앗 판 대장균 HT115 EV 세균이나 HT115 flcn-1 RNAi의 세균. 참고 : 사용하기 전에 실온에서 판을 48 시간 유지. 공급하여 RNAi의 최저 유효 인 경우, DS-28의 RNA 전달하는 다른 방법을 사용한다. </li></ol></li><li> 파라콰트 (PQ)를 사용하여 산화 스트레스를 유도 : <ol><li> KH 2 PO 4 3g을 혼합하여 M9 버퍼를 준비 나 2의 6g HPO 4, 염화나트륨 5 g 및 황산 0.25 g · 7 H 2 O. 증류수 1 L에 불러옵니다. 실온에서 122 ° C와 저장 병에서 45 분간 고압 솔루션입니다. </li><li> 분석 당일, M9 / PQ - 함유 용액을 제조 하였다. (M9 버퍼의 4 ㎖에 녹이고 PQ의 0.1028 g을 잘 당 M9 / PQ의 40 μL로 전체 96 웰 플레이트를 채우고)이 프로토콜의 경우, 100 mM의 PQ를 사용합니다. 주의 : PQ는 위험하고 독성이 강한 화합물이다. 해당 지침에 따라 처리합니다. 참고 : 때 먼저 새의 실행기차 또는 새 조건, 그것은 7-10 시간 내에 동물을 죽일하기 위해 사용하는 가장 농도를 결정하기 위해 PQ의 농도를 증가에서 생존을 분석하는 것이 좋습니다. </li></ol></li></ol> 나이 동기 L4 인구 2. 준비 <ol><li> E. 시드 신선한 참견 마라 플레이트로 전송 20 임신하는 성인 자웅 동체를 대장균 OP50 박테리아. 분석시 필요한 웜의 수에 따라 몇 접시를 준비합니다. </li><li> 그들이 6 시간 후, 어머니를 제거 백금 와이어 웜을 선택 사용하는 알을 낳는하도록 허용합니다. 누워 계란의 수를 평가하기 위해 현미경으로 번호판을 확인합니다. </li><li> 알이 부화하고 48 시간 동안 20 ℃에서 성장하도록 허용합니다. 이 시점에서, 동물은 늦은 L4 / 젊은 성인 단계에있다. 같은 무대 동물을 선택하고 PQ 솔루션 함유 우물에 전송할 수 있습니다. 참고 : 48 시간 배양 단지 야생형 동물과 유사 성장 돌연변이에 적용하므로,이 발달 모니터링하는 것은 중요새로 테스트 돌연변이 비율은, 야생형 개발 레이트 그렇지 다른 타임 라인이 사용되어야 부합되도록한다. </li><li> 대안 적으로, 동기화 기술을 사용한다. 차아 염소산 용액을 사용하여 L1 유충 웜의 동기 인구 생성 (25 ml의 물, 5.25 %의 차아 염소산 나트륨의 125 ml의 4 M의 NaOH 50 mL로, 빛에서 분리하기 위해 알루미늄 호일로 병 포장). 강렬한 표백 분석 중에 동물의 행동에 영향을 줄 수 있기 때문에,이 분석을 위해, 그것은, 권장되지 않는다. 주의 : 지침에 따라 차아 염소산 용액을 처리합니다. 주 : 다운, 관심 유전자를 조절하는 특정 세균의 RNAi 시드 RNAi의 플레이트에 산모 전사 제외한 제 2 절에 설명 자웅 동체를 동기화 RNAi의 사용시. RNAi에와 최저 약한 경우, 여러 세대에 공급하는 것이 좋습니다. </li></ol> 3. 산화 스트레스 저항 분석을 &lt;공연/ P&gt; <ol><li> 피펫 96 웰 플레이트의 각 웰에 (신선한 제조) 100 mM의 PQ 용액 40 μL. 모든 조건 (치료, 돌연변이 등)의 복제로 최소 12 우물을 사용합니다. 백금선 웜 픽업을 사용하여, 각 웰은 시작 시간과 종료 시간을 나타내는 5-8 L4 유충 동물 옮긴다. </li><li> 다른 조건을 시작할 때, 시작 시간 및 종료 시간을 참고. 시작 시간에서 한 시간 후에 죽은 동물을 벌레를 전송하고 점수 사이의 배양 시간에 20 ° C에서 접시를 놓습니다. </li><li> 해부 현미경을 사용하여, 생존마다 시간을 계산합니다. 조심스럽게 계산을 시작하기 전에 판을 흔들. 죽은 동물로, 심지어 높은 강도의 광을 스폿 팅 한 후에, 이동하지 않은 웜을 표시한다. 또한, 살아있는 동물의 수를 나타낸다. 참고 : 높은 배율에서 벌레 모양, 꼬리와 머리의 움직임을 보면, 살아에서 죽은 벌레를 결정하는 데 도움을줍니다. </li><li> 대부분의 벌레가 죽을 때까지이 단계마다 시간을 반복합니다. </li></ol> &lt;P 클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. 모든 시간 시점에서 생존 비율의 결정 <ol><li> 물론 모든 동물에 전송의 총 수를 가산함으로써 조건 당 동물의 총 수를 계산한다. 손상 또는 이전에 사망 동물을 무시합니다. </li><li> 매 시간 포인트 (12 웰에서 죽은 동물의 합) 조건 당 죽은 동물의 총 수를 계산한다. 때마다 포인트, 생존 (100 마이너스 %의 죽음)의 비율 (죽은 동물 (100)에 의해 동물의 총 개수로 나눈 값과 곱의 수) 죽음의 비율을 계산합니다. </li><li> 이 분석을 최소 3 독립 번 반복합니다. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

C. 엘레 쉽게 배양 될 수 있으므로 생체 내에서 유 전적으로 산화 스트레스 내성을 연구하는 매력적인 모델 생물이며, 급속 전적으로 동일한 자손 다수의 리드. 산화 스트레스 저항을 측정하기 위해 여러 방법이 앞서 설명되어 있으며 그러한 PQ, 로테 논, H 2 O 2, 및 juglone 25,26,29-32 ROS 같은 다양한 소스와 배양 접시의 보충에 기초한다. 여기에서 우리는 100 mM의 PQ...

A reference was corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/52746">Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates</a>. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:
Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).
to:
Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., &#38; Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).

Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

진핵 세포에서 미토콘드리아의 전자 전달계에서 일어나는 산화 적 인산화는 ATP의 형태로 에너지 생산의 주요인이다. 반응성 산소 종 (ROS)은이 프로세스의 자연 부산물이다. 분자 신호로서의 중요한 역할에도 불구하고, 과도한 활성 산소는 DNA 손상, 단백질 카르 보닐, 및 지질 산화 될 수 있습니다. ROS 생산 및 해독 간의 불균형 에너지 고갈, 세포 손상에 이르게 산화 스트레스를 유발하고 세포 사멸을 유발 1,2-. 산화 스트레스는 노화, 암, 당뇨, 심혈관 질환 및 신경 퇴행성 질환 3-9 포함한 많은 생명을 위협하는 질병의 발달에 기여한다. ROS 세포를 적절한 수준을 유지하고 산화 손상 1,2- 대하여 그들의 구성 성분을 보호하는 효소와 비 효소 적 방어 전략을 진화했다. 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제는 (SOD) 효소는 conve 먼저 행동나중에 카탈라아제 또는 과산화 효소에 의해 물로 변환 H 2 O 2에 RT의 슈퍼 옥사이드. 비 효소 적 방어 전략은 대부분 필수 세포 성분을 보호하는 세포 거대 분자에 비해 활성 산소와 빠르게 반응하는 분자를 포함한다. 활성 산소가 효소를 해독의 보호 역할에도 불구하고, 일부 활성 산소 분자는 항산화 방어 메커니즘을 탈출 및 산화 적 손상을 초래할. 감지, 복구 및 손상된 세포 성분의 저하는 산화 스트레스 1,2시 필수적인 방어 전략이다. 스트레스 저항 특히 산화 스트레스에 관여하는 신호 전달 경로 것은 매우 진화 (10, 11)를 보존하고 있습니다. 생명체의 조건이 부분적으로 만 재생되는 세포 배양 실험, 12, 13은 큰 의미를 가지고 모델 생물에서 산화 스트레스의 연구와는 달리. C. 엘레는 막 다른 쉽고 저렴하게 할 수있는 자유 생활 선충이다한천 매체에 세균 잔디밭에 냈다는. 그것은 크기가 작고 일반적으로 (약 1 길이 ㎜) 및 유전자 조작을 용이하게하는 자기 시비 자웅 동체로 성장한다. 그것은 빠른 라이프 사이클과 높은 생식 능력, 세대 당 약 300 자손을 생산하고 그것을 대규모 유전 스크린 (14)을 수행 할 수있는 강력한 도구를하고있다. C. elegans의 게놈 염기 서열을 완전히하고 유전자 40-50 %가 인간의 질병 관련 유전자 15 ~ 18의 동체가 될 것으로 예상된다. 의 RNAi를 사용하여 관심의 유전자의 최저 신속하고 C에서 쉽게 엘레. 유전자 다운 조절은 E. 동물을 공급함으로써 달성 될 수있다 관심 19의 mRNA를 표적의 이중 가닥 RNA를 발현하는 플라스미드를 대장균 박테리아 항구. 따라서, 대규모의 RNAi 스크린을 이용한 유전자 기능의 결정은 암 (20, 21)을 포함하여 인간의 질병을 이해하는데 큰 영향을 미친다. O의 연구C에서 xidative 스트레스 저항 엘레은 산화 스트레스 13,22에 대한 저항의 보존 메커니즘의 식별을 주도했다. 확인 된 일부 경로는 저산소증, 열, 삼투압 스트레스 같은 다른 스트레스뿐만 아니라 이러한 장수와 저항을 조절하는 일반적인 경로이다. 이 경로는 인슐린 신호, TOR 신호, 그리고 자식 작용을 포함한다. 다른 주요 경로는, 또는 손상의 수리 등의 열 충격 및 보호자 단백질 11,13,22 같은 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 효소와 카탈라아제 효소로 활성 산소의 해독을 포함한다. 이 프로토콜은 C의 산화 적 스트레스에 대한 저항을 확인하는 방법에 대해 설명합니다 액체에 간스. 우리는 이전에 C. 손실시 flcn -1- (ok975)를 산화 적 스트레스에 대한 증가 된 내성을 보여 주었다 때문에 우리는 프로토콜을 설명하기 flcn -1- (ok975) 및 야생형 동물을 사용 엘레 (23). 우리는 또한이 증가 저항이 달려 있음을 보여 주었다AMPK와 자식 작용, 세포 생체 에너지를 향상시키고 응력 저항 (23)을 촉진 시그널링 축. PQ는 반응성 산소 종 (24)를 생성하기 위해 전자 전달계를 방해 산화성 스트레스이다. 같은 분석은 적용 할 수 있고, 다른 ROS 소스 또는 활성 산소 생성 화합물은 H 2 O 2와 로테 논 등 사용할 수 있습니다. 유사한 분석은 PQ의 낮은 농도 (25, 26)를 사용하는 플레이트에 개발되어왔다. 이 분석의 장점은 매우 빠르고, 그 결과는 하루에 획득 될 수 있다는 것이다. 또한, 96 웰 플레이트에서 산화 적 스트레스 저항성 검정을 수행하는 데 사용되는 액체의 총량은 PQ - 함유 플레이트를 제조하는 데 사용되는 체적에 비해 낮다. 따라서, 사용 된 PQ의 양이 분석에서 액체 인 것은 저가 분석을 렌더링하고 유해 폐기물의 생성을 제한하는 낮다. 그러나, 플레이트 분석에 비해이 분석의 한계 라 포함액체 분석에서 음식과 액체 산소의 낮은 농도의 CK는 공기에 비해. 이러한 경우에, 결과에 영향을 줄 수있는 중요한 인자이다. 따라서,이 분석에서 얻어진 결과를 지원하기 위해 권장 산화 스트레스 저항성 다른 방법을 사용하여 재현성을 확인하기.

<table><tbody><tr><td>Agar bacteriological grade</td><td>Multicell</td><td>800-010-LG</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological peptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0037</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride biotechnology grade</td><td>Bioshop</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure tris hydrochloride</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>Tris aminomethane</td><td>Bio Basic Canada Inc</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202185A</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bioshop</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>8013-01-2</td><td></td></tr><tr><td>Methyl viologen dichloride hydrate</td><td>Aldrich chemistry</td><td>856177-1G</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 60 x15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Pipet 10 ml</td><td>Fisher</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>G-Biosciences</td><td>RC-084</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>M-5921</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Discovery v8 stereo zeiss microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well clear microtiter plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;flcn-1&lt;/em&gt; RNAi source</td><td>Ahringer Library</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring oxidative stress resistance of caenorhabditis elegans in 96-well microtiter plates

생산 및 반응성 산소 종의 해독 사이의 불균형의 결과이다 산화 스트레스는 심혈관 및 신경 퇴행성 질환, 당뇨, 노화, 암, 인간을 포함한 만성 질환의 주요 원인이다. 따라서, 세포 시스템에서뿐만 아니라 전체 유기체를 사용뿐만 아니라 산화 스트레스를 연구하는 것이 중요하다. C. 엘레 매우 진화 적으로 보존되어 산화 스트레스 신호 전달 경로의 유전학을 연구하는 매력적인 모델 생물이다. 여기서, 우리는 C.에서 산화 적 스트레스 내성을 측정하기 위해 프로토콜을 제공 액체에 간스. 예컨대 파라쿼트 (PQ) 및 H 2 O 2 등 간단히, ROS는 유도 시약 M9 완충액에 용해하고, 용액을 96 웰 마이크로 티터 플레이트의 웰에 분주한다. 동기화 L4 / 젊은 성인 C. 엘레 동물의 우물에 전송된다 (5-8 동물 / 웰) 및 생존율을 측정매 시간마다 대부분의 웜은 죽을 때까지. 데이터의 잘못된 해석을 초래할 수있는 산화 스트레스시 동물의 행동에 영향을 줄 수있는 노화, 스트레스 번호판의 낮은 농도를 사용하는 산화 적 스트레스 내성 시험을 수행 할 때. 그러나, 본원에 기재된 분석에서,이 문제는 L4 / 젊은 성인 동물이 사용되기 때문에 발생하기 어렵다. 또한,이 프로토콜은 저렴하고 결과는 유전 스크린의 매력이 기술을 렌더링 일일에서 얻을 수있다. 전반적으로,이 산화 스트레스 관련 인간의 장애의 더 나은 특성화로 번역 될 수있는 산화 스트레스 신호 전달 경로를 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

비교 야생형 C. 엘레은 flcn-1 (ok975) 돌연변이 동물 여기서 우리는 야생형 C.의 저항을 결정하기 위해 100 밀리미터 PQ 사용 산화 스트레스, 열, 산소 결핍 (23)에 저항하는 것으로 나타났다 flcn -1- (ok975)에 비해 간스 동물. 치료 4 시간, 야생형의 48.3 % 이후 생존으로 flcn-1 (ok975) 동물에서 77.8 %의 생존에 비해. 예상대로, flcn -1- (ok975) 돌...

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Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates.

의 산화 스트레스 저항을 측정<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트에

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

measuring-oxidative-stress-resistance-caenorhabditis-elegans-96-well

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

15.4K 조회수.  McGill University. C. elegans is an attractive model organism to study signal transduction pathways involved in oxidative stress resistance. Here we provide a protocol to measure oxidative stress resistance of C. elegans animals in liquid phase, using several oxidizing agents in 96 well plates. 

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

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Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

연구

생화학

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple and inexpensive method to obtain a large number of animals for the isolation of proteins to proceed with a western blot, mass spectrometry, or further proteomics analyses. Furthermore, an increase of nematode numbers for immunostainings and the integration of multiple analyses under the same culturing conditions can easily be achieved. Additionally, a transfer between plates with different experimental conditions is facilitated. Common techniques in plate culture involve the transfer of a single C. elegans using a platinum wire and the transfer of populated agar chunks using a scalpel. However, with increasing nematode numbers, these techniques become overly time-consuming. This protocol describes the large-scale culture of C. elegans including numerous steps to minimize the impact of the sample preparation on the physiology of the worm. Fluid and shear stress can alter the lifespan of and metabolic processes in C. elegans, thus requiring a detailed description of the critical steps in order to retrieve reliable and reproducible results. C. elegans is a model organism, consisting of neuronal cells for up to one-third, but lacking blood vessels, thus providing the possibility to investigate solely neuronal alterations independent of vascular control. Recently, early neurodegeneration in diabetic retinopathy was found prior to vascular alterations. Thus, C. elegans is of special interest for studying general mechanisms of diabetic complications. For example, an increased formation of advanced glycation end products (AGEs) and reactive oxygen species (ROS) is observed, which are reproducibly found in C. elegans. Protocols to handle samples of adequate size for a broader spectrum of investigations are presented here, exemplified by the study of diabetes-induced biochemical alterations. In general, this protocol can be useful for studies requiring large C. elegans numbers and in which liquid culture is not suitable.

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

This protocol describes a method for the large-scale cultivation of Caenorhabditis elegans on solid media. As an alternative to liquid culture, this protocol allows obtaining parameters of different scales under plate-based cultivation. This increases the comparability of results by omitting the morphological and metabolic differences between liquid and solid media culture.

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Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

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Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

환경과학

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many historical and contemporary studies have identified thousands of lifespan-altering paradigms, including genetic mutations, transgenic gene expression, and hormesis, a beneficial, low-grade exposure to stress. With its many advantages, including a short lifespan, easy and low-cost maintenance, and fully sequenced genome with homology to almost two-thirds of all human genes, C. elegans has quickly been adopted as an outstanding model for stress and aging biology. Here, several standardized methods are surveyed for measuring lifespan and healthspan that can be easily adapted into almost any research environment, especially those with limited equipment and funds. The incredible utility of C. elegans is featured, highlighting the capacity to perform powerful genetic analyses in aging biology without the necessity of extensive infrastructure. Finally, the limitations of each analysis and alternative approaches are discussed for consideration.

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans serve as an excellent model system with robust and low-cost methods for surveying healthspan, lifespan, and resilience to stress.

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

유전학

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

산화 스트레스는 Mitis 그룹 Streptococci 꼬마 선 충 에 의해 발생 하는 공부

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

발생학

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em96 웰 플레이트에 Microtiter> 수명

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

생물학

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on host physiology. It also fluoresces in blue when dying, providing a convenient means of pinpointing death. This property has been exploited to develop high-throughput label-free C. elegans survival assays (LFASS). These involve time-lapse fluorescence recording of worm populations set in multiwell plates, from which population median time of death can be derived. The present study adopts the LFASS approach to screen multiple microbial isolates at once for the effects on C. elegans susceptibility to severe heat and oxidative stresses. Such microbial screening pipeline, which can notably be used to prescreen probiotics, using severe stress resistance as a proxy for host health is reported here. The protocol describes how to grow both C. elegans gut microbiota isolate collections and synchronous worm populations in multiwell arrays before combining them for the assays. The example provided covers the testing of 47 bacterial isolates and one control strain on two worm strains, in two stress assays in parallel. However, the approach pipeline is readily scalable and applicable to the screening of many other modalities. Thus, it provides a versatile setup to rapidly survey a multiparametric landscape of biological and biochemical conditions that impact C. elegans health.

High-Throughput Screening of Microbial Isolates with Impact on Caenorhabditis elegans Health

Gut microbes may positively or negatively impact the health of their host via specific or conserved mechanisms. Caenorhabditis elegans is a convenient platform to screen for such microbes. The present protocol describes high-throughput screening of 48 bacterial isolates for impact on nematode stress resistance, used as a proxy for worm health.

Caenorhabditis elegans 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝

With its small size, short lifespan, and easy genetics, Caenorhabditis elegans offers a convenient platform to study the impact of microbial isolates on ...

C. elegans Survival Assay: A Short-Term Toxicity Test

Source: Possik, E. and Pause, A. <a href="https://www.jove.com/video/2496/measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter">Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video introduces a short-term survival assay that tests a treatment for acute toxicity or tests a genetic strain for resistance to a toxic condition.&#160; The example protocol shows an example survival assay in which worms are tested for their ability to&#160; resist oxidative stress induced by paraquat (PQ).

C. 예쁜꼬마선충 생존 분석: 단기 독성 테스트

Source: Possik, E. and Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.&#160;J. Vis. Exp. ...

의 산화 스트레스 저항을 측정

요약

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