이 프로토콜은 바다 엘레 간에서 노화를 제공하기위한 가장 낮은 비용과 가장 낮은 기술 방법을 제시합니다. 노화 생물학에서 영향력있는 모델 유기체. 이러한 방법의 가장 큰 장점은 저렴한 장비와 재료를 사용하여 구현이 쉽다는 것입니다.
경험이나 사용 가능한 자금에 관계없이 모든 연구자에게 복종할 수 있도록 합니다. 오래된 노화 연구로서 인구 내 건강에는 자연적인 변동성이 있습니다. 따라서 건강하고 잘 먹으며 단단히 동기화 된 동물에 대한 실험을 수행하는 것이 필수적입니다.
찢어짐 장애를 보장하기 위해 1 리터 선충 성장 배지 또는 NGM 오거 플레이트의 준비를 시작하십시오. 2.5g의 펩 톤, 3.0g의 염화나트륨 및 20g의 오거를 교반 막대가있는 1 리터 플라스크에 넣고 증류수를 최종 부피 970ml로 첨가하십시오. 표준 오토클레이브 또는 매체 멸균기를 사용하여 1리터 플라스크에서 NGM 오거 용액을 멸균합니다.
그리고 용액을 섭씨 60도에서 75도까지 식을 때까지 저어줍니다. 용액이 냉각되는 동안 비드 배스를 섭씨 65도에서 70도까지 가열합니다. NGM 오거 용액이 섭씨 60도에서 75도까지 냉각되면.
액체 첨가제를 넣고 용액이 5 분 동안 완전히 혼합되도록하십시오. 그런 다음 플라스크를 섭씨 65도에서 70도의 비드 배스에 담그면 플레이트에 붓는 동안 매체가 응고되는 것을 방지할 수 있습니다. 9 내지 11 밀리리터의 용액을 각각의 60 밀리리터 플레이트에 피펫팅한다.
완료되면 온도를 유지하고 피펫에서 매체가 응고되는 것을 방지하기 위해 가열된 용액에 피펫을 다시 놓습니다. 모든 플레이트에 대해 이 절차를 반복하고 NGM A 플레이트가 밤새 응고되도록 합니다. 일단 응고되면 박테리아로 접시를 파종하는 데 사용하거나 표백을 통해 벌레를 동기화하기 위해 섭씨 4도에서 최대 3 개월 동안 밀봉 된 용기에 보관하십시오.
페트리 접시를 과도하게 채우지 않고 벌레가 들어있는 접시에 소량의 M9 용액을 부어 선충류를 수집합니다. 그런 다음 M 9 용액을 부드럽게 소용돌이 치며 박테리아 잔디에서 벌레를 풀어줍니다. 다음으로, 혈청 학적 피펫으로 15 밀리리터 튜브에 성인 gravid 벌레를 수집합니다.
피펫 팁으로 오거를 관통하지 마십시오. 동물을 1100배 G에서 30초 동안 센트르씩 펠렛화하고, 상청액을 흡인한다. 새로 준비한 표백 용액 5 밀리리터를 벌레 펠릿에 넣고 모든 성인 벌레 몸체가 녹고 계란 만 혼합물에 남을 때까지 간헐적으로 격렬한 흔들림과 함께 몇 분마다 해부 현미경으로 벌레를 확인합니다.
다음으로, 계란 표백제 혼합물을 1100배 G에서 30초 동안 스핀다운하여 계란을 펠릿하고 표백액을 흡인합니다. 그런 다음 최대 15ml의 M9 용액을 추가하고 튜브를 4-5 번 뒤집어 계란과 용액을 분산시켜 펠렛 계란을 씻습니다. 다시 튜브를 1100배 G에서 30초 동안 원심분리하여 계란을 펠릿화하고 M9 용액을 흡인합니다.
계란 믹스에서 표백제를 제거하기 위해 네 번 세척하십시오. 네 번째 세척 후 원심 주입은 표백 된 웜의 총 수에 따라 100 마이크로 리터에서 2 밀리리터까지 M9 용액을 흡인합니다. 계란을 완전히 흔들어 덩어리를 부수고 계란이 M9 용액에 완전히 재현되도록 합니다.
대안적으로, 동물은 15 밀리리터 크로니클 튜브의 달걀 펠릿에 10 내지 12 밀리리터의 M9 용액을 첨가함으로써 더 엄격한 시간적 동기화를 위해 L1 체포될 수 있다. 벌레가 섭씨 20도에서 최대 24시간 동안 회전 장치에서 회전하도록 합니다. 계란 L 또는 L 농도를 근사화하기 위해 4 마이크로리터의 계란 혼합물을 박테리아가 장착된 NGM 플레이트 상에 피펫팅한다.
그런 다음 마이크로 리터의 배지 당 존재하는 알을 세고 계산하십시오. 근사치를 개선하기 위해 3 또는 4회 반복하여, 근사 플레이트, 적절한 수의 알 또는 L개의 포획된 동물을 선택한 박테리아가 파종된 NGM 오거 플레이트 상에 기초한다. 스래싱을 통해 웜의 기관차 동작을 측정합니다.
NGM 오거 플레이트에서 소량의 성인 벌레를 해부 범위 아래 10-20 마이크로 리터의 M9 용액으로 옮깁니다. 그런 다음 한 번에 하나의 웜에 초점을 맞추고 시편이 15초 안에 오목한 형태에서 볼록한 형태로 전환되는 횟수를 세십시오. 핸드 카운터와 타이머를 사용하여 10-15 개의 웜에 대해 절차를 반복하십시오.
웜을 원하는 나이로 노화시키고 원하는 모든 연령에서 스래싱 측정을 반복합니다. 시각화 된 바와 같이, 오래된 웜은 상당히 느린 속도로 스래시합니다. 수량 및 출산율 측정용.
10-15 개의 Caenorhabditis elegans 웜에서 L 4 개의 웜을 선택하여 선택한 박테리아가 뿌려진 별도의 NGM 오거 플레이트에 넣습니다. 동물이 섭씨 20도에서 밤새 자라도록 하고 새로 씨를 뿌린 접시 배치가 다음 날을 위해 준비되었는지 확인하십시오. Caenorhabditis elegans가 낳은 알의 양을 측정하기 위해 성인 벌레를 약탈 된 박테리아가 뿌려진 신선한 NGM 오거 블레이드로 옮기고 7-8 일 동안 또는 알이 더 이상 보이지 않을 때까지 12-24 시간마다 접시에 놓인 알의 수를 세십시오.
Caenorhabditis elegans의 무리 크기를 측정하려면 성인 벌레를 12-24 시간마다 또는 7-8 일마다 또는 자손이 더 이상 보이지 않을 때까지 박테리아가 뿌려진 신선한 NGM 오거 플레이트로 옮깁니다. 계란이 들어있는 모든 접시를 섭씨 20도에 보관하십시오. 웜을 옮긴 지 이틀 후.
접시에 개발 된 자손을 세십시오. F 2 세대가 결과를 혼동하지 않도록 L 4 단계 또는 그 이전에 살아있는 웜과 발달하는 웜을 모두 세십시오. 계산되는 대로 플레이트에서 모든 벌레를 제거합니다.
부화 또는 발달이 지연된 동물을 놓치지 않도록 다시 점수를 매기기 전에 추가로 1-2 일 동안 플레이트를 유지하십시오. 야생형 N2 선충류의 수명에 대한 살균 방법의 효과는 NGM 오거 플레이트에서 자란 벌레의 수명 변화가 NGM 오거 FUDR 플레이트 또는 NGM 오거 플레이트에서 자란 GLP 4 BN2 돌연변이 동물의 수명과 유사하다는 것을 보여주었습니다. 수명이 짧은 HSF 한 넉다운 동물은 모든 조건에서 수명이 크게 감소하는 것으로 나타났습니다.
야생형 대조군에 비해 HSF 발현 동물에서 알을 낳는 수 및 새끼 크기의 실질적인 감소가 발견되었다. 일부 HSF를 오버 발현한 동물은 생식 건강이 수명과 반비례할 수 있음을 나타내는 완전 불임을 나타내었다. 스래싱 비율은 어린 동물에 비해 늙은 동물의 스래싱이 크게 감소하여 측정된 노화 중 건강을 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공했습니다.
스트레스에 대한 생존은 유기체 건강을 측정하기 위한 신뢰할 수 있는 분석이며, 세망 스트레스를 유발하는 Tunicamycin은 DMSO 대조군에 비해 농도에 관계없이 수명을 단축시켰습니다. 높은 수준의 파라콰트는 수명을 크게 단축시킨 반면 낮은 농도의 파라콰트는 호르메틱 효과로 인해 수명을 늘렸습니다. 내열 분석에서, HSF의 과발현은 모든 수명 및 노화 실험에 대해 섭씨 37도에서 열 내성을 증가시켰다.
살균 기술은 유기체 건강에 다방성 영향을 미칠 수 있으며 이는 결과에 영향을 미친다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 전사, 번역 단백질 응집, 세포 기관, 형태학 및 대사 기능 측정을 포함하여 장비 및 인프라를 사용할 수 있는 경우 건강 기간을 측정하기 위한 많은 추가 및 보완 접근 방식이 존재합니다.
