이 프로토콜은 48개의 박테리아 분리균주에서 두 개의 C.elegans 균주에서 C.elegans 산화 열 응력 저항에 영향을 미치는 박테리아를 병렬로 스크리닝하는 방법을 설명합니다. 이 접근 방식은 다양하고 확장 가능합니다. 건강에 대한 C.elegans에 영향을 미치는 여러 조건을 신속하게 스크리닝할 수 있으며, 이는 건강 및 질병의 메커니즘 연구에 적용할 수 있습니다.
스트레스 저항성을 건강의 대용으로 사용하는 이 파이프라인은 선충 돌연변이, 녹다운, 형질전환 및 질병 모델에 대한 약물, 항구토제 및 프로바이오틱스의 전임상 스크리닝에 쉽게 적용할 수 있습니다. 많은 조건을 병렬로 테스트 할 수있는 능력은 관련된 복잡한 상호 작용을 연구하고 생리적 과정을 제공 할 수있게합니다. 여기에는 숙주 미생물 상호 작용, 대사 장애, 스트레스 처리 및 노화가 포함됩니다.
전체적으로 오염을 피하는 것이 중요합니다. 웜에 음식이 부족하지 않도록하고 웜이 필요한 단계에 도달하자마자 주요 단계를 수행하십시오. 농축된 E.coli OP50 박테리아 배양의 준비로 시작하여 4개의 1리터 병의 리소제닉 브로스를 각각 2밀리리터의 OP50 스타터 배양으로 접종합니다.
그런 다음 병을 섭씨 37도 및 160G에서 6시간 동안 진탕 인큐베이터에 넣은 다음 박테리아를 섭씨 3057도 및 섭씨 20도에서 15분 동안 펠릿화합니다. 그 후, 상청액을 버리고 6 밀리리터의 OP50 배지로 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 멸균 된 50 밀리리터 원추형 튜브에 농축 된 배양 물을 수집하십시오.
균주당 8개의 6cm NGM 플레이트를 플레이트당 섭씨 37도에서 밤새 성장한 100마이크로리터의 포화 OP50 배양액으로 접종합니다. 그런 다음 사용하기 전에 이틀 동안 접시를 섭씨 20도에 보관하십시오. 그런 다음 메스를 사용하여 최근에 굶주린 NGM 플레이트에서 벌레로 0.5cm의 정사각형 한천 덩어리를 자르고 접종 된 8 개의 6cm NGM 플레이트 각각에 옮깁니다.
이 플레이트를 섭씨 20도에서 3 일 동안 배양하십시오. 다음으로, P1000 피펫을 사용하여 6cm NGM 플레이트에 최대 3밀리리터의 멸균 M 9 버퍼를 추가하여 웜을 다시 현탁시키고, 단일 15밀리리터 원뿔형 튜브에서 균주당 8개의 플레이트 모두에서 웜 용액을 수집합니다. 그 후 섭씨 4도에서 2분 동안 142회 G에서 원심분리하고, 멸균 파스퇴르 피펫 또는 팁이 장착된 P5000 피펫 또는 워터 펌프를 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거한다.
그런 다음 멸균 M 9 버퍼 10ml를 추가하여 웜 펠릿을 세척합니다. 다음으로, 상청액을 제거하고 피펫을 사용하여 농축된 OP50이 보충된 15센티미터 OP50 접종된 NGM 플레이트에 웜을 옮깁니다. 매일 0.5ml의 농축 OP50을 벌레에 다시 공급하여 섭씨 15도에서 3-4 일 동안 직경 15cm의 NGM 플레이트에서 각 벌레 균주를 성장시킵니다.
M 9 버퍼를 수집하고 세척 한 후 각 웜 균주 배양을 더 많은 NGM 플레이트로 옮기고 인구의 95 %가 중력 성인이 될 때까지 섭씨 20도에서 웜을 전파합니다. 그런 다음 표준 알 준비 방법에 따라 중력 성인 벌레를 표백하고 계란을 섭씨 15도에서 24시간 동안 파종되지 않은 15cm NGM 플레이트 2개에 옮겨 모든 L one 유충이 후속 단계에서 동시에 부화하고 성장할 수 있도록 합니다. 먼저, 6 센티미터 LB 한천 플레이트에서 이전에 성장한 모든 박테리아 덩어리를 수집하고, 1 밀리리터의 M 9 완충액을 함유하는 표지 된 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브로 옮깁니다.
그런 다음 박테리아 펠릿이 완전히 다시 부유 될 때까지 마이크로 원심 분리기 튜브를 소용돌이치십시오. 다음에, 실온에서 5분 동안 9, 300회 G에서 스핀다운하고, 700 마이크로리터의 상청액을 제거한다. 다시 와류에 의해 박테리아 펠릿을 다시 현탁시킨다.
이어서, 200 마이크로리터의 각 박테리아 현탁액을 빈 멸균 96 웰 플레이트의 단일 웰로 옮긴다. 이 플레이트에서 8개의 96웰 NGM 아가로스 플레이트에 다중 채널 피펫을 사용하여 10마이크로리터의 박테리아 용액을 접종하고 뚜껑을 덮고 섭씨 25도에서 24시간 동안 배양합니다. 그런 다음 96웰 서스펜션 플레이트를 깨끗한 접착식 천장 필름으로 밀봉하고 섭씨 15도에서 최대 5일 동안 보관합니다.
시작하려면 플레이트를 보고 동기화된 웜 개체군의 발달 단계를 평가합니다. 웜의 90 % 이상이 L 4 단계에 도달하면 15 밀리리터 원추형 튜브에 최대 10 밀리리터의 멸균 M 9 용액에 웜을 수집합니다. 다음으로, 섭씨 4도에서 2 분 동안 142 배 G로 회전하여 벌레를 4 회 광범위하게 씻고, 각 세척 사이에 10ml의 신선한 멸균 M 9를 추가하여 OP50 박테리아를 제거합니다.
이어서 상청액을 제거하고, 웜 펠렛을 10 밀리리터의 M9에 다시 현탁시킨다. 50 마이크로 리터의 웜 용액을 950 마이크로 리터의 M 9를 포함하는 1.5 또는 2 밀리리터의 낮은 표면 바인딩 튜브로 옮깁니다. 웜 침전을 방지하기 위해 튜브 내용물을 부드럽게 혼합한 후 습식 로우 바인드 피펫 팁을 사용하여 3-4개의 개별 10마이크로리터 방울을 유리 슬라이드 또는 NGM 플레이트에 옮깁니다.
16X 배율의 실체 현미경에서 웜 수를 세고 3-4 방울의 카운트를 평균하여 웜 용액의 마이크로 리터 당 웜 수를 결정합니다. 웜 농도를 15 밀리리터 원추형 튜브에서 마이크로 리터 당 15 웜으로 조정합니다. 그런 다음 8 마이크로 리터의 웜 용액을 다중 채널 피펫 또는 반복 피펫을 사용하여 8 개의 96 웰 NGM 아가 로스 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.
36시간 후, 30 마이크로리터의 M9를 96 웰 플레이트의 각 웰에 분주한다. 다음으로, 낮은 머무름 팁을 사용하여 설정된 레이아웃에 따라 웜을 384웰 플레이트로 옮겨 플레이트 리더가 올바르게 설정되었는지 확인합니다. 그 후, 열 응력 분석을 위해 40 마이크로 리터의 M 9를 추가하고 TBHP 유도 산화 스트레스에 대해 6 마이크로 리터의 TBHP에 34 마이크로 리터의 M 9를 추가하여 웰 당 60 마이크로 리터의 최종 부피를 목표로하여 384 웰 플레이트를 더 많은 M 9로 채웁니다.
그런 다음 TBHP를 추가한 후 2분 이내에 분석을 시작합니다. 그런 다음 투명한 뚜껑으로 플레이트를 닫고 384웰 플레이트의 가장자리를 마스킹 테이프로 밀봉하여 테이프가 뚜껑 위나 플레이트 아래로 가지 않도록 합니다. 그런 다음 플레이트를 플레이트 리더에 삽입하십시오.
피크가 노이즈와 크게 다르지 않은 형광 값을 결정하고 형광 변동이 상승하기 전에 감쇠되는 가장 빠른 시점을 기록하십시오. 그런 다음 최소 및 최대 형광 값이 곡선 피팅에 사용되므로 떨어질 것으로 예상되는 시점을 기록하십시오. 그런 다음 형광 피크의 진폭이 웰 간에 크게 달라지는지 확인하십시오.
원고에 설명된 공식을 사용하여 추가 분석 전에 데이터를 정규화합니다. 먼저 GitHub에서 LFASS를 다운로드하고 MATLAB을 시작한 다음 LFASS 폴더로 이동합니다. 그런 다음 화면의 지시에 따라 명령 창에 fit 폴더를 입력하고 실행합니다.
fit 폴더에 입력 한 후 Excel 파일이있는 데이터 폴더의 이름을 내 데이터로 입력합니다. 그런 다음 현재 프로토콜에서 연속 측정 사이의 시간 간격에 2를 입력하고 노이즈 임계값을 입력합니다. 다음으로, 0.94를 입력하여 공차 상한 임계값을 지정하고 0.06을 입력하여 공차 하한 임계값을 지정하여 시그모이드 피팅을 제한합니다.
시간 간격을 설정하여 최대값과 최소값을 찾습니다. 수렴 피팅을 육안으로 검사하려면 메시지가 표시될 때 적합 곡선과 부드러운 곡선을 표시하지 않으려면 예의 경우 Y를 입력하고 아니오의 경우 N을 입력합니다. 다음으로, 새로운, 하한 및 상한 시간 경계를 제공하여 재적합을 시도합니다.
다시 맞추려면 two를 입력합니다. 그러나 다시 맞추기를 수락하고 다음 곡선으로 이동하려면 0을 입력합니다. 잡음으로 식별된 곡선을 분석할지 또는 적합하지 않은 곡선을 다시 추가할지 선택하려면 Y를 입력하여 승인하고 N을 기각합니다.
나머지 모든 커브에 대해 재적합을 시도하거나 거부하면 프로그램이 종료됩니다. 결과 폴더에서 결과 파일을 검색하고 다운스트림 분석을 위해 dot XLSX로 저장합니다. 열 및 산화 스트레스 저항 분석은 MYB11 또는 MYB115 박테리아 분리물 또는 E coli OP50 대조군 박테리아에 공급된 Bristol N 2개의 야생형 웜에 대해 수행되었습니다.
36시간 후, 성체 야생형 벌레 개체군은 섭씨 42도의 열 스트레스와 7%TBHP 유발 산화 스트레스에 노출되었습니다. 사망 시간의 중앙값은 열 스트레스 분석의 경우 40분에서 130분 사이, 산화 스트레스 분석의 경우 90분에서 240분 사이였습니다. 2.5단계에서 웜이 성장하고 2.1단계가 최대 2시간이 걸릴 수 있는지 확인하려면 플레이트 레이아웃을 그려 4.6단계에서 96웰에서 284웰 플레이트까지 웜을 준비합니다.
단계를 추가하거나 대체할 수 있습니다. 예를 들어, 숙주 게놈 전체 RNA 스크리닝 또는 박테리아 유전자 스크리닝은 각각 RNI 클론 또는 박테리아 돌연변이를 장내 박테리아 분리물로 대체함으로써 수행될 수 있습니다. 그래서 우리는 현재 이 접근법을 사용하여 새로운 프로바이오틱스를 식별하고 감염 및 노화의 맥락에서 숙주 미세 상호 작용과 관련된 유전자 조절 네트워크를 밝히고 있습니다.
