저자는 그녀의 초기 공헌 연구 설계에 대 한 헤더 Currey 박사 Swarup Mitra 원고 그의 중요 한 검토를 위해 감사 하 고 싶습니다. 우리는 또한 마이클 B. 해리스 박사 의견, 개선,이 방법론의 시범 생산 지원을 감사 하 고 싶습니다. 변종 꼬마 유전학 센터, 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 NIH 사무실에 의해 자금에 의해 제공 되었다. 이 간행물에서 보고 된 연구에 의해 국립 연구소의 일반 의료 과학 수상 번호 UL1GM118991, TL4GM118992, 또는 RL5GM118990 국립 보건원의와 제도적 개발 상 수상 (IDeA는)에 의해 지원 되었다 국립 연구소의 종합 의료 과학 보조금 번호 5P20GM103395-15 국립 보건원의. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다. UA는 AA/EO 고용주 및 교육 기관 및 개인에 대 한 불법 차별 금지: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

1. 꼬마 체 건설 및 사용
<ol><li>
건설 프로토콜
	<ol>
<li>50 mL 원뿔 튜브 (그림 1A)에서 2 뚜껑을 얻을.</li>
		<li>(하단, 그림 1B에서 볼) 때 뚜껑의 안쪽 입술 안쪽 중심 영역을 제거 분 젠 버너와 뜨거운 금속 프로브 또는 납땜을 사용 하 여 또는 드릴 비트를 강화. 참고: 상해의 위험이 있기 때문에 블레이드 보다는 플라스틱 뚜껑을 열을 사용 하 여입니다.</li>
		<li>청소 하 고 잘라 가장자리를 모래 톱 곡선된 파일 또는 로타리 연마 도구 (예를 들어, Dremel) 표면. 그림 1C참조.</li>
		<li>적절 한 지름 (그림 1D) monofilament 메시의 동그라미를 잘라. 이 위해, monofilament 나일론 메쉬 시트에 뚜껑을 추적 하 고 그려진 라인 안에 그냥 잘라.</li>
		<li>접착제 (그림 1E) 플라스틱에 적용 되 면 두 개의 뚜껑의 접착을 강화 하는 뚜껑의 위쪽 표면에 홈/슬래시 잘라.</li>
		<li>에탄올과 뚜껑을 깨끗 하 고 건조 그들을 보자.</li>
		<li>외부 가장자리를 유지 하는 두 뚜껑의 위쪽 표면에 cyanoacrylate 접착제를 적용 합니다. 참고: 접착제 조금 먼 길을 간다.</li>
		<li>하나 붙어 뚜껑 (그림 1 층)에 표 1에 따라 monofilament 메쉬를 하다. 메쉬; 위에 거꾸로 두 번째 뚜껑을 배치 두 뚜껑 함께 그들의 꼭대기를가지고 있어야 합니다. 단단히 함께 (그림 1G)을 누릅니다. 메쉬 긴장 된 인지 확인 합니다. 참고: 안전 조치로, 뚜껑에는 메쉬를 사용 하 여 족집게.</li>
		<li>접착제의 초기 레이어는 건조 되 면 뚜껑 사이의 외부 간격 주위 cyanoacrylate 접착제의 링을 적용 합니다. 이 무결성을 추가 하 고 떨어져 또는 새 어떤 필 링 방지 관대 한 수 있습니다.</li>
		<li>필터 monofilament 메시의 메시 기 공 크기와 레이블을 지정 합니다. 참고: 여기, 우리가 사용 하 여 두 개의 메시 기 공 크기-20 µ m, 50 µ m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
프로토콜을 사용 하 여
	<ol>
<li>미리 체 젖은.<ol>
<li>염 분 해결책, M9 등 플라스틱 [5 g의 NaCl, 나2HPO46 g, KH2포4, 1 초순 H2O, L 그리고 MgSO4 (1 M)의 1 mL의 3 세대]17, 방울 양식까지 체의 센터를 통해 압축, 및 필터 아래쪽 (그림 2A)의 중심에서 drips. 필요에 따라 모양 아래쪽에 보풀 지우기 (예, Kimwipe)을 적용 하거나 메시에 수 분 물방울을 확산.</li>
			<li>50 mL 원뿔 튜브 위에 체를 놓습니다. '폐 튜브' 튜브 라벨 (그림 2B).</li>
		</ol>
</li>
		<li>한 천 배지에서 C. 선 충 의 인구를 씻어.<ol>
<li>M9 버퍼와 접시 세척 하 고 한 번 (그림 2C)에 웜 포함 된 매체 monofilament 메쉬 1 mL의 위쪽에 배치. 메시의 중심에서 작동 해야 합니다. 모든 벌레는 접시에서 씻는 다. 참고: 일반적으로, 60 m m 플레이트 m 9의 3 mL 충분 하다.</li>
			<li>Pipetting에 벌레의 수를 최소화 하기 위해 유리 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 접시에서와 메쉬 센터 (필요에 따라 반복)에 벌레를 이동.</li>
			<li>상단에서 M9 버퍼와 필터를 씻어. 다시, 메시의 센터에서 운영 하 고 그 지역에서 모든 벌레를 헹 굴에 있는지 확인 하십시오. 모든 박테리아와 작은 벌레는 메시를 통해 전달 되도록 필요한 만큼 여러 번 씻는 다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>체에서 크기 일치 하는 동물을 수확.<ol>
<li>단계의 새 컬렉션 튜브 (그림 2D)의 내부를 직면 하는 1.2.2.3 어른 벌레와 체의 상단에 새로운 50 mL 원뿔 튜브를 연결 합니다.</li>
			<li>첫 번째 관 (폐기물 관)을 제거 하 고 신속 하 게 체 고을 드롭릿에 마이그레이션 하는 것을 막기 위해 새로운 튜브를 뒤집어 (그림 2E). 참고: 무 균 필요 하지 않은 경우 사용 하 여 보풀 지우기 (예, Kimwipe) 윅 유체를 튀기기 전에 메시의 하단에서.</li>
			<li>새로운 위쪽 (그림 2F)에서 새로운 50 mL 튜브에 M9와 메쉬 린스. 다시, 메쉬 센터에서 운영 하 고 메시의 밑면에 작은 물방울을 유지 합니다.</li>
			<li>정착 하거나 부드럽게 아래로 회전 웜 허용 (예를 들어, < 16 x g) 약 1 분 (그림 2G).</li>
			<li>에 벌레, 펠 릿에서 버퍼 솔루션을 이상적으로 발음 > 0.5 mL, 또는 펠 릿을 방해 하지 않고 최대한 많은 액체를 제거.</li>
			<li>플라스틱 유리 NGM 접시에 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 웜 하 고 그들을 건조. 공간 여러 방울 밖으로 새로운 접시에 그래서 그들은 더 빠른 (그림 2 H)를 건조.</li>
		</ol>
</li>
		<li>체를 청소.<ol>
<li>에탄올과 역방향 삼 투 물으로 체를 부드럽게 하 고 철저 하 게 린스. 건조 하자.</li>
			<li>무기한 미래의 사용에 대 한 깨끗 한 용기에 그것을 저장 합니다.</li>
			<li>메시 "sag" 외관을 개발 했을 때 그것을 폐기.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 꼬마 체 정렬 방법의 유효성 검사
<ol><li>일반 유지 보수
	<ol>
<li>모든 실험에 대 한 문화 표준 선 충 류 성장 미디어17 에 벌레 (NGM의 1 L 펩, 한 천, 3 g의 NaCl, 이중 증 류 물, 5 mg/mL 콜레스테롤, 1 M CaCl2 의 1 mL의 1 mL의 975 mL의 17 g의 2.5 g의 구성 1 mL의 1 M MgSO4, 1m KHPO4, 25 mL 및 100 mg/mL 스의 0.5 mL) 25 ° c.에</li>
	</ol></li>
	<li>실험 치료 관리
	<ol>
<li>3 치료 그룹을 비교: 선택, fluorodeoxyuridine (FUDR), 그리고 꼬마 체.<ol>
<li>FUDR 치료 그룹에 대 한 NGM 미디어 어떤 자손 생산을 방지 하기 위해 100 μ M의 최종 농도를 100mg/mL FUDR을 추가 하 고 매일 음식 소모를 피하기 위해 신선한 NGM 접시에 벌레를 전송.</li>
			<li>선택 그룹에 대 한 선택 하 고 웜 백 금 루프를 사용 하 여 수동으로 전송 합니다.</li>
			<li>꼬마 체 치료 그룹에 대 한 1.2 단계를 수행 하 고 플라스틱 NGM 접시에 벌레.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>꼬마 체 백분율 수확량
	<ol>
<li>C. 선 충분류에 얼마나 효과적인 체는 계량, 25 ° C (즉, 달걀 누워 후 48 h)에서 성년의 날 1 세 동기 N2 동물을 성장 하 고 신선한 NGM 접시에 그들을 수확 하 여 그들을 전송 (총 N = 50 또는 N = 트 레 당 100 동물 atment 그룹)입니다.</li>
		<li>24 시간 복구의 새로운 NGM 번호판 인구 전송 후 다음 위의 꼬마 체와 프로토콜 (단계 1.2 참조) 하 고 성공적으로 전송 된 동물의 수를 계산.</li>
		<li>100 (%)을 곱한 전송의 시작 부분에 시작 번호에 비해 전송 하는 동물의 수의 비로 백분율 수확량을 계산 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Healthspan 분석 실험 참고: 일 2, 4, 6, 및 8 나이 동기화 N2 동물 25 ° c.에 유지에 대 한 성인 기의 운동 성 클래스, 인 두 펌프 속도 및 모두는 앞쪽 및 후부 부드러운 터치 응답의 healthspan 매개 변수를 점수<ol>
<li>추적 운동<ol>
<li>클래스를 기반으로 시스템 (A, B 및 C 클래스)에 따라 운동 성 점수를 할당 Herndon 외 의 방법에 따라 18. 통계 분석 소프트웨어에는 서 수 물류 통계 모델을 사용 하 여 세 가지 실험 그룹의 효과 비교. 참고: 클래스 A 개인 일반, 정현파 패턴에서 자연스럽 게 이동합니다. 클래스 B 개인 현저 하 게 비 정현파 움직임에 이동 하 고 장려 운동 괴롭히는 필요할 수 있습니다. 클래스 C 개인 괴롭히는에 그들의 머리 또는 꼬리를 이동 하지만 agar 가로질러 이동할 수 없습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>인 두 펌프 속도<ol>
<li>1 분에 대 한 최종 배율 X 600 stereomicroscope에서 시각적으로 동물의 터미널 인 두 전구의 분쇄기 움직임을 계산 합니다.</li>
			<li>Α와 일방통행 ANOVA와 통계 분석 = 0.05, Bonferroni 후 테스트 α = 0.05.</li>
		</ol>
</li>
		<li>터치 응답<ol>
<li>부드러운 터치 응답을 기록 하 고 3 개의 치료 그룹 사이 비교. Calixto 연구진이 설명 하는 방법에 따라 분석 실험을 수행 19.</li>
			<li>레코드는 앞쪽 및 후부 부드럽게 쓰 다듬어 속눈썹 선택 수직 꼬리 또는 동물의 머리 (5 x, 번갈아가 며 머리와 꼬리) 하 여 응답을 터치 합니다.</li>
			<li>앞쪽 및 후부 응답에 대 한 0 ~ 5의 규모에 1 점으로 선의 반대 방향으로 움직임을 점수.</li>
			<li>Α와 일방통행 ANOVA와 통계 분석 = 0.05, Bonferroni 후 테스트 α = 0.05.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>통치 분석 결과
	<ol>
<li>25 ° c.에 성년의 날 2에 나이 동기 N2 동물 복제에 꼬마 체의 영향의 사용을 확인 하려면 성장</li>
		<li>달걀 누워 후 60 h 플래티넘 선택 또는 꼬마 체 새로운 NGM 번호판 동물을 전송 하 고 그들 복구에 4 h (20-30 분에 대 한 체질된 접시 건조).</li>
		<li>복구, 개별적으로 접시 속눈썹 통해 동물 NGM 번호판 선택 후 그들에 게 산란, 24 h 하 고 동물을 제거 합니다. 또 다른 24 h에 대 한 25 ° C에서 표준 상태 하에서 개발을 각 접시에 자손을 허용 합니다. 참고: 속눈썹 선택은 인간의 속눈썹 매니큐어와 파스퇴르 피 펫의 끝을 확보 하 고 에탄올으로 소독.</li>
		<li>실행 가능한 F1 세대 개인의 수를 계산 합니다. Α와 T-검정을 사용 하 여 통계 분석을 수행 = 0.05. 참고: 가능한 자손 계란 성공적으로 해치 고 일반 애벌레 사이클을 통해 그들의 개발을 시작 하는 것으로 간주 됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 기자 스트레스 응답 분석 실험
	<ol>
<li>스트레스의 잠재적인 마커를 감지 하 세 가지 일반적으로 사용 되는 형광 기자 분석 수행: 스트레인 [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]20; 세포의 핵에 DAF 16::GFP 전 hsp-16.2 식 [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; 그리고 잔디-3 식 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.</li>
		<li>각 분석 결과 대 한 문화 20 ° C에서 3 개의 치료 그룹에서 나이 동기 동물 및 성년의 날 3에 그들을 검토: 부정적인 제어를 사용 하 여 (매일, 수동으로 백 금 선택과 동물의 그룹 전송), (매일에 긍정적인 통제 백 금 선택 플러스 설립된 스트레스와 수동으로 동물의 그룹 전송), 그리고 꼬마 체 (체 동물을 통과 하 고 이미징 직전 NGM에 30 분 동안 복구 하도록 허용).</li>
		<li>DAF 16::GFP 분석 결과에서 열 충격을 30 분 동안 37 ° C에서 긍정적인 제어 동물20이미징 하기 전에. Hsp-16.2 분석 결과 대 한 열 충격 90 분,21이미징 하기 전에 20 h 긍정적인 제어 동물. Sod-3 분석 결과 대 한 이미징22전에 4 h 100 m m 파라콰트와 긍정적인 제어 동물을 취급 합니다.</li>
		<li>속눈썹 선택으로 즉시 벌레를 수확 하 고 벌레를 무력화 하는 36% poloxamer 407 계면 활성 솔루션의 1 μ와 coverslip에 탑재.</li>
		<li>다른 coverslip로 탑재 된 웜 샌드위치 표준 유리 현미경 슬라이드 및 이미지를 두 개의 coverslips 벌레는 거꾸로 형광 현미경 (80 X의 전반적인 확대)에 8 배 확대와 지속적인 노출 FITC 필터를 사용 하 여 탑재 합니다.</li>
		<li>DAF 16::GFP 분석 결과에서 세 그룹 간의 차이 감지, DAF 16::GFP 기자 (핵 기자 기자 cytosol, 그리고 중간에 있는 cytosolic 핵을 translocated 경우의 위치에 따라 동물 분류 기자 핵 그리고 cytosol에 위치한).</li>
		<li>통계 분석 소프트웨어에는 서 수 물류 통계 모델을 사용 하 여 결과 비교 합니다. Hsp-16.2 및 잔디-3 식 분석 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 α와 = 0.05와 Tukey의 임시 게시물 테스트 α = 0.05 머리 영역의 총 형광 비교 하.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Abbas, S., Wink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+Tea+Extract+Induces+the+Resistance+of+Caenorhabditis+elegans+against+Oxidative+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress.</a> Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).</li>
<li>Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+pretreatment+increases+the+X-radiation+resistance+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다. 저자는 연구 잠재적인 상충으로 해석 될 수 있는 어떤 상업적 또는 금융 관계의 부재에서 실시 되었다 선언 합니다.

여기, 우리 디자인 및 정렬 및 선 충 C.유지를 위한 도구로 서, 효과적인 꼬마 체의 사용을 소개 했다. 이 도구는 수동으로 개별 동물, 인구, 화학 치료 (예를 들어, FUDR), 그리고 더 비싼 방법 분리 동물의 세척을 따기 위해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 꼬마 체 효율적이 고 신속 하 게 (20 분 미만) 동물 (표 2)의 큰 혼합된 인구에서 자손을 정렬. 또한, 도구를 사용 하 여 효과가 없습니다 감지 독성 동물 healthspan (그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6)에, 잘 설명된 유전 스트레스 기자 (그림 7, 그림 8 을 유도 하지 않습니다. 그림 9), 문화 접시 또는 어떤 분자 분석 결과를 적용 된 치료를 그 후에 영향을 미칠 수 있는 외국 화학 물질의 양을 감소 시킨다. 사용의 용이성은 상당한 이점을; 그들의 교육의 모든 단계에서 연구원 (그림 1 및 그림 2; 그것을 사용 하 여 훈련 될 수 있다 프로토콜)입니다.
제조 체 (예, 펫, 버퍼)의 사용에 필요한 자료는 쉽게 사용할 수 있는 표준 연구소; 따라서, 깨진, 꼬마 체 교체 또는 수리 하는 비용이 되지 않습니다. 자체 생성 된 성격의 꼬마 체 다양 한 도구가 될 수 있습니다: 다른 C. 선 충 에 대 한 적절 한 메쉬 크기와 건설 수 있습니다 발달 단계와 고기. 꼬마 체 분석 실험을 실시 하는 다른 선 충 종 또는 제조 시 사용 되는 적절 한 매쉬의 크기를 제공 하는 작은 유기 체를 분리 하는 경우에 사용할 수 있습니다.
혜택이이 도구 제공 합니다 C. 선 충 인구 유지 보수에 대 한 체 다른 실험 응용 프로그램에서 사용 하기 전에 동물을 청소 하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 마이크로 C. 선 충 을 개발 연구 칩 사용 및 청소의 문제가 온다. 동물에 부착 된 세균의 금액에 따라 특별 한 예방 조치를 미세 칩, 그것을 사용할 수 없게29렌더링을 방해할 주의가 필요 합니다. 종종 C. 선 충 은 미세 칩에 전송 됩니다 때 세균 잔디밭에서 잔류물 그들과 함께 가져입니다. 이 찌 꺼이 기 수 고는 미세 채널, 칩 고장는 다음 청소 또는 교체를 방해할지 않습니다. 이 프로토콜에서 장치 구성 뿐만 아니라 마이크로, 뿐만 아니라 청소 미세 장치에 그들의 삽입 전에 동물에 대 한 동기화 된 동물을 수확 하는 방법을 제공 합니다. 파편과 동물, 수집 하는 때 채택 세균 잔류물을 제거 하 여 미세 채널 따라서 개별 칩의 작동 생활 하 고 그들과 함께 지휘 되는 연구의 후속 처리량을 증가 고장, 적은 경향이 있다.

선 충 벌레, 꼬마 선 충, 최고의 모델 생물 이다. 실험실에 있는 그들의 경작의 간단 하 고 제어 특성, 뿐만 아니라 그들의 전체 게놈 시퀀스1 이며 각 셀의 개발 운명2알려져 있다. 이러한 기능을 구현, C. 선 충 유전자 연구에 대 한 널리 사용 되는 모델 생물 이다. 그러나, 이러한 유익한 특성 함께 연구자에 대 한 몇 가지 과제를 올. 그들의 빠른 생성 시간 때문에 C. 선 충 인구 음식에서 신속 하 게 실행할 수 있습니다 또는 여러 세대와 인구 혼합 되 고 발달 단계를 한 번에 제시. 따라서, 고체 선 충 성장 매체 (NGM)에서 수행 하는 실험 연구자 세균 식량 고갈 시키고 새로운 애벌레 개발 하기 전에 물리적으로 신선한 번호판 동물 이동에 필요 합니다. 이 자식 세대와 혼합 되 고에서 실험적인 인구를 방지 하는 데 필요한 동물의 빈번한 전송 지루한 될 수 있습니다. 아직도, 실험 동물 및 확장된 시간 포인트 (예, 성인 기에 DNA 또는 RNA 추출)의 둘 다 다 수 필요합니다. 이 정확 하 게 동기화 된 인구를 유지 하 고 전송 하는 동물의 많은 수의 문제 화합물.
C. 선 충 NGM에서 양식 전송의 현재 방법 따기 또는 세척 동물 격판덮개; 화학적 치료 동물 (예를들면, DNA 복제 억제 물 fluorodeoxyuridine 또는 FUDR); 또는 cytometry 정렬 다 잘 판에 동물을 사용 하 여. 따기 개인 또는 여러 동물3,4를 수동으로 전송 하는 얇은 백 금 철사 또는 속눈썹로 만든 손 도구를 사용 하 여를 포함 한다. 이 방법은 정확한 하지만 기술 그리고 시간 요구 이며 동물의 많은 수를 포함 하는 연구에 대 한 제한. 또한 5 월을 따기 되며 물리적으로 손상 동물에 스트레스 잠재적으로 힘의 부 자연스럽 고 일관성 없는 금액에 개인을 쓰는 하 여. 세척 포함 버퍼 솔루션 문화 접시를 헹 구 고 새로운 문화 접시에는 동물 들과 함께 솔루션 유리 파스퇴르 피 펫을 통해 전송 됩니다. 이 방법은 신속 하 고 효율적인 하지만 여러 세대와 동물의 발달 단계는 대량에서 전송에 정확 하지 않다. FUDR, 같은 화학 치료는 차단 어떤 DNA 복제 그리고 이렇게, 생식 체 생산 및 계란 개발 통해 자손의 생산을 방지 하기 위해 자란 미디어에 녹아 수 있습니다. 동안 효과, 즉, 자사의 관리3이전 동물을 전송 하는 요구는 여전히 그리고 정상적인 발달 과정을 방해 하지로 발달 성숙 후이 메서드를 적용 해야 합니다. 이 메서드는 또한 여러 개의 셀룰러 신호 경로, 결과 동물에 눈에 띄는 효과 (예를 들어, 수명 연장 또는 변경 된 proteostasis) C. 선 충 사용5의 변형에 따라 영향 6,,78,,910. 교류 cytometry 방법을 자동으로 정렬 하 고 다른11한 멀티 잘 플레이트에서 개별 C. 선 충 을 전송. 이 방법은 매우 효과적이 고 효율적인 동안 흐름 cytometry 장비는 엄청나게 비싼 많은 연구원에 액세스할 수 있습니다. 동물을 전송 하는 대신 온도 등 그다지 15 fem-1, 온도 조정12살 균 되는 민감한 돌연변이 모델을 사용 하는 것입니다. 돌연변이 동물을 사용 하 여 하는 것이 어떤 상황에 유용 하지만 이러한 특정 변종 야생-타입 동물 보다 느리게 성장 하 고 그들은 에이징 또는 건강 한 벌레에 대 한 불 쌍 한 대표자로 봉사 하는 변경 된 게놈에 의존. 또한, 무 균을 유도 하기 위해 온도 변화에 대 한 의존도 또한 정적 환경의 부재에 발생 하 고 온도 변화 유전자 식13,14, 에 영향을 쉽게 표시 되었습니다 15. 연구 그룹 이전 크기16 C. 선 충 을 필터링 하는 메시의 사용을 설명 하는 기술을 출판. 그러나, 우리가 이전 작품 어떤 변화 같은 필터의 사용과 관련 된 전반적인 건강 결과에 대 한 테스트를 찾을 수 없었습니다.
따라서, 문화 판 사이의 동물의 많은 수를 전송 하기 위한 저렴 한 가격, 신속, 효율적이 고 정확한 방법에 대 한 C. 선 충 연구 커뮤니티 내에서 필요 하다. 향상 된, 액세스할 수 (라는 이름의 꼬마 체) 장비 및 그것의 제조 및 C. 선 충 연구 커뮤니티의 요구를 충족 하는 작업에 대 한 연결된 프로토콜의 조각을 개발 했습니다. 여기, 우리 꼬마 체 및 그 사용 방법의 디자인을 공유 하 고 우리는 그것의 사용 영향을 주지 않는 일반적인 건강 또는 표준 수동 채집 및 치료는 일반적으로 사용 되에 비교 될 때 어떤 스트레스 마커 입증 다 산 제한 화학 FUDR

<table><tbody><tr><td>Safety glasses</td><td>Uline</td><td>S-21076</td><td></td></tr><tr><td>Protective heat resistant glove</td><td>Grainger</td><td>Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic Nylon mesh</td><td>Dynamic&lt;br/&gt; Aqua-Supply Ltd</td><td>NTX20 and NTX50</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Scotch Super Glue Liquid</td><td>SAD114</td><td></td></tr><tr><td>Pliers</td><td>Vampliers</td><td>VMPVT-001-8</td><td></td></tr><tr><td>Dremmel tool with circular file</td><td>Lowe&#039;s</td><td>Item # 525945 Model # 100-LG</td><td></td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506</td><td></td></tr><tr><td>NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)</td><td>BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)</td><td>BD bioscience 211677, Lab Express 1001,&amp;nbsp; Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat dichloride hydrate</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>FSX100</td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis sieve: a low-tech instrument and methodology for sorting small multicellular organisms

꼬마 선 충 (C. 선 충)은 기본 및 생물 의학 연구의 범위에 걸쳐 사용 되는 기초가 튼튼한 모델 유기 체. 선 충 연구 커뮤니티 내에서 C. 선 충의 큰, 나이 일치 하는 인구를 유지 하는 저렴 하 고 효과적인 방법에 대 한 필요가 있다. 여기, 우리 기계적으로 정렬 및 청소 C. 선 충에 대 한 방법론을 제시. 우리의 목표는 동물의 균일 한 크기와 실험에 그들의 사용에 대 한 생활 단계를 비용 효과적, 효율적, 빠르고 간단한 프로세스입니다. 이 도구, 꼬마 체 사용 사용자 뚜껑 시스템을 일반적인 원뿔 실험실 튜브에 스레드 및 선 충 C. 신체 크기에 따라 정렬 합니다. 우리 또한 그 꼬마 체 효과적으로 동물에서에서 전송 하나의 문화 접시는 빠른 정렬, 동기화, 및 건강의 표시를 영향을 주지 않고 청소에 대 한 다른 허용 보여 운동 성 포함 하 고 스트레스를 유도할 수 있는 진 기자입니다. 이 접근 가능 하 고 혁신적인 도구 C. 선 충 인구를 유지 하기 위한 빠르고, 효율, 비-스트레스 옵션입니다.

꼬마 체 이루어져 있다 2 나사 모자, 짠된 나일론 monofilament 메쉬 간단한 세척 기술을 사용 하 여 생물의 라이브 인구를 추출 하는 데 사용, 원하는 개발 시대의 몸 직경 보다 작은 영역을 확보. 그것은 표준 원뿔 관에 부착 하 고 메쉬 스크린을 사용 하 여 기계적으로 동물 몸 직경, 튜브에 추가 유지 관리 및 실험 (예를 들어, 전송 또는 유전 수확)에 대 한 준비가 원하는 동물을 떠나 정렬. 꼬마 체 세척 부드러운 매뉴얼은 빠른, 60-100 mm 접시 당 약 5 분 및 유기 체는 망에서 쉽게 복구할.
비율에 따라 동물의 항복 꼬마 체 사용 꼬마 체의 백분율 수확량을 설정 하기 위해 장치는 20 μ m와 50 μ m 기 공 크기 메시 성인 동물에 시험 되었다. A 의미의 양보는 > 90% 성공 동물 전송 모두 메쉬 크기 테스트 (표 1)에 대 한 달성 했다.
Monofilament 간격 동물의 다른 생활 단계를 구분 하는 데 사용할 수 있습니다 다양 한 크기와 메쉬. 메쉬 20 μ m 간격으로 떨어져 배아 및 후자 유지 4 애벌레 단계 보다 작은 애벌레 단계 개발에 적합 하다 (L4; 32 μ m의 평균 신체 직경) 및 생활 후기, 메쉬 50 μ m 간격으로 모든 수 있도록 하는 동안에 어떤 동물 든 지 다른 생활 씻 겨 (표 2)를 (70 μ m의 평균 신체 직경)와 성인에서 옆으로 단계.
꼬마 체 사용 healthspan 통계에 영향을 주지 않습니다 운동 성: C. 선 충 에서 정상적인 정현파 운동 (즉, 운동 성) 나이18 와 하락 이며 전반적인 건강의 감 적. 있 었 하는지 확인 꼬마 체 좌우 운동 성, 운동 성 점수를 비교 선택, FUDR, 그리고 꼬마 체 치료 그룹 성인 기의 2, 4, 6, 및 8 일에 합니다. 모든 그룹에 걸쳐 모든 동물 (n = 10/그룹) 성인 기에 걸쳐 여러 연령대에서 정상적이 고 자발적인 운동 패턴 (클래스 A) 전시 (일 2, 4, 6, 및 8 성인; p > 0.05 모든 일, 그림 3에 여러 비교).
인 두 펌프 속도: C. 선 충 인 두 근육의 능력을 펌프 나 이와 함께 감소 이며 healthspan23의 다른 바이오 마커. 동물 인 두 펌프 속도, 선택, FUDR, 그리고 꼬마 꼬마 체 영향을 경우 확인 하려면 체 치료 그룹 일 2, 4, 6, 및 8 성인에 비교 했다 (n = 8 ~ 10 그룹 당). 일 6에 따기 받았다 동물과 FUDR 메서드 사이 상당한 차이가 있었다 (p < 0.001) 및 8 (p < 0.001). 또한, 6 일에 체 및 FUDR 그룹 사이 상당한 차이가 있었다 (p < 0.001) 및 성년의 날 8 (p < 0.001). 그러나, 어떤 날에 대 한 선택 및 꼬마 체 그룹 간의 통계적으로 유의 한 차이가 없었다 (p > 0.05, 그림 4), 체 healthspan의이 측정을 영향 하지 않습니다 나타내는.
부드러운 터치 응답: 기계적 자극에 응답은 에이징 또는 일반 건강24,25; 평가 하는 생리 적 마커 따라서, 다른 전송 메서드는 앞쪽 및 후부 부드러운 터치 응답에 미치는 영향 테스트 되었습니다. 선택, FUDR, 그리고 꼬마 사이 통계적으로 유의 한 차이가 없었다 체 치료 그룹 (n = 8/그룹), anteriorly 또는 뒤로, 테스트의 모든 날에 대 한 (p > 0.4 모든 비교; 그림 5A 그리고 5B).
통치: 설정 여부 꼬마 체 영향 C. 선 충, 성인 기의 3 일 동안 24 시간 기간에서 개별 자손에 의해 생산 가능한 자손의 금액을 계산 되었고 비교 (n = 그룹 당 20 ~ 22). 꼬마 체를 사용 하 여 크게 선택 치료 그룹에 비해 생산 하는 자손의 수에 영향 하지 않았다 (p = 0.61, 그림 6).
분석 실험 분자 기자 DAF 16 핵 전 좌: C. 선 충, 녹음 방송 요인 DAF-16의 활성화는 스트레스 증가 저항26연결 됩니다. DAF-16의 핵 지 방화 유전자 변형 선 충 스트레인 DAF-16 녹색 형광 단백질 (DAF-16::GFP)20융합을 표현 하는 TJ356에 시험 되었다. 정상적인 성장 조건 하에서 DAF 16::GFP는 cytosol에서 주로 지역화 됩니다 하지만 다양 한 스트레스 (예를 들어, 열 스트레스)에서 핵20으로 translocated 급속 하 게 이다. DAF-16 전 좌에 꼬마 체와 정렬의 영향을 테스트 하려면 DAF 16::GFP 있어 긍정적인 통제 그룹 (열 스트레스)에 일치 하는 나이 하루-5 성인에 비교 했다 부정적인 제어 그룹 (수동 전송 선택 통해), 그리고 꼬마 체 치료 그룹 (n = 10/그룹). 꼬마 체와 전송 DAF-16::GFP의 핵 전 좌에는 영향을 미치지 않았다 고 부정적인 제어 동물에 유사한 표현 형을 보였다 (p > 0.05, 그림 7).
hsp-16.2 기자: HSP 16.2 같은 작은 열 충격 단백질은 스트레스 반응의 biomarkers 그리고 그들은 높은 열 충격 또는 산화 스트레스 에이전트21,27에 노출 하는 동안 표시 됩니다. TJ375 변형 정상 조건21에서 비활성화 되는 hsp 16.2 발기인 융합 GFP 취재 원 유전자가 있다. 그러나, 열 충격에 노출, HSP 16.2 단백질 발현을 유도 하 고 동물 표시 GFP 식21의 높은 수준의 키를 누릅니다. 인 두 지역에서 꼬마 체 HSP 16.2 중재 하는 스트레스 반응에의 참여, 형광 밀도 테스트 하려면 (n = 10 동물/그룹) 나이 일치 하는 동물의 긍정적인 통제 그룹 (열 사이 하루 5 성인에 비교 했다 스트레스), 부정 (따기), 그룹 및 꼬마 체 치료 그룹을 제어 합니다. 꼬마 체와 전송에 크게 HSP의 식을 유도 하지 않았다-16.2::GFP (hsp-16.2::gfp) 부정적인 제어에 비해 (p > 0.05, 그림 8).
sod-3 기자: C. 선 충, 산화 유전자는 superoxide dismutase 3 (잔디-3)에 대 한 코드에서는 위로 산화 스트레스28중입니다. 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하는 선 충 C. 스트레인 CF1553-표시 잔디 3 발기인, 그 식 파라콰트5같은 산화 스트레스에 의해 유발 됩니다. 꼬마 체 정렬 C. 선 충에서 항 산화 반응에의 참여를 테스트 하려면 일치 하는 나이 하루-5 성인 머리 지역에 형광 밀도 긍정적인 통제 인구 (100 μ M 파라콰트 사이 비교 되었다 치료), 부정적인 컨트롤 인구 (수동 따기), 그리고는 꼬마 체 전송 인구. 꼬마 체와 전송 크게 떼-3::gfp 부정적인 제어에 비해 표현의 유도 하지 않았다 (p > 0.05, 그림 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig1.jpg"> 그림 1: 꼬마 체 건설. 도구의 '자작' 제조의 진행이 표시 됩니다. 이러한 패널 표시 (A) 두 50 mL 원뿔 튜브 캡 (B)의 센터를 제거 (C) 부드럽게 가장자리를 잘라 고 (D - F) C. 선 충의 원하는 생활 단계에 해당 하는 monofilament 메쉬 장착 (자세한 내용은 프로토콜 참조). (G) 완성 된 체도 표시 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig2.jpg"> 그림 2: 단계별 이미지 표현의 꼬마 체 사용. (A) 체 미리 M9 솔루션의 방울으로 젖은 이며 (B) 50 mL 원뿔 튜브 위에 맞는. (C) 1 mL M9 벌레 솔루션 체, (D) 50 mL 원뿔 튜브는 튜브, 및 (E)와 새로 연결 된 체의 내부를 직면 하는 벌레 체 상단에 배치의 윗면에 pipetted의 위 관은 신속 하 게 뒤집힌된 o 버전 (G) 체는 M9 씻어 서 새로운 50 mL에 원하는 동물을 운반 튜브 및 벌레 튜브의 아래쪽에 중력에 의해 정착 허용 됩니다. (H) 벌레 pipetted 및 신선한 NGM 접시에 방울으로 배치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig3.jpg"> 그림 3: 꼬마 체 수명에 걸쳐 운동 영향 하지 않았다. 이 그림 2, 4, 6, 및 8, FUDR, 선택에 대 한 성인 기의 일에 동물의 운동 성 클래스 분포와 꼬마 체 치료 그룹. 클래스 A 동물 이동 일반적으로 그리고 자발적으로, 클래스 B 동물 비정상적으로 이동 하 고 괴롭히는, 그리고 클래스 C 동물 하지 못했습니다 이동 필요 할 수도 있습니다. 꼬마 체, 선택 및 FUDR 그룹 사이 차이가 없었다 (p > 0.05). 3 복제 (n = 10 동물 치료 접시 당) 실시 하 고 서 수 로지스틱 모델 분석 했다. 클래스 B 동물입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig4.jpg"> 그림 4: 꼬마 체 사용 않았다 영향 수명에 걸쳐 인 두 펌핑. 이 그림의 인 두 펌프 속도, FUDR, 선택한 꼬마 체 치료 그룹, 2, 4, 6, 및 성인 기의 8 날에 비해. 별표 표시, 선택 사이의 의미 체, 및 일에 대 한 FUDR 치료 그룹 지정 (* * * p < 0.05). 꼬마 체 및 선택 그룹 (p > 0.05) 사이 차이가 없었다. 두 복제 (N = 10 동물 치료 접시 당) 실시 되었고 일방통행 ANOVA와 Bonferroni 테스트 후 분석. 막대는 평균 ±를 표준 오차의 의미를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig5.jpg"> 그림 5: 꼬마 체 사용 수명에 걸쳐 앞쪽 터치 응답을 영향 하지 않았다. 이러한 패널 표시 (A)는 이전 하 고 (B) 선택, FUDR, 그리고 꼬마 의 후부 터치 응답 수 체 치료 그룹 2, 4, 6, 및 8 성년의 날에 비해. 두 복제 n 실시 했다 = 각 치료 그룹에 대 한 10 하 고 일방통행 ANOVA와 Bonferroni 테스트 후 비교 (p = 0.4이 고 p = 0.9 앞쪽 및 후부, 각각). 막대는 평균 ±를 표준 오차의 의미를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig6.jpg"> 그림 6: 꼬마 체 않았다 하지 영향을 가능한 자손 양의 성년의 날 3. 부모 동물에 대 한 성인 기의 3 일에 걸친이 그림 3 일 성인의 가능한 자손 24 h 낳는 기간 후. 막대는 평균 ±를 표준 오차의 의미를 나타냅니다. N = 20-22 동물 치료 그룹 당 두 개 이상의 별도 생물 복제에서. 치료 그룹은 t와 비교-테스트 (p > 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig7.jpg"> 그림 7: 꼬마 체 미치지 않았다 DAF 16::GFP의 핵 전 좌. 이러한 패널 (A) 열 충격 그룹 (긍정적인 통제), (B) 선택 그룹 (부정적인 제어), 및 (C) 꼬마 체 치료 그룹의 DAF-16 전 좌의 대표 이미지를 표시합니다. (D) 긍정적인 통제 그룹에 동물 표시 DAF 16 핵 전 좌의 활성화. 꼬마 체 핵 전 좌를 유도 하지 않았다 고 부정적인 제어 그룹에서 동물에 유사한 cytosolic 융해 단백질을 표시. N = 3 개 이상 별도 생물 복제에서 치료 그룹 당 10 동물. 치료 그룹 일방통행 ANOVA와 Tukey의 임시 게시물 테스트 비교 되었다. 눈금 막대 100 μ m =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig8.jpg"> 그림 8: 꼬마 체 미치지 않았다 hsp16.2::gfp의 식. 열 충격 그룹 (긍정적인 통제), 선택 그룹 (부정적인 제어), 그리고 꼬마 체 치료 그룹의 (임의의 형광 단위로) HSP 16.2 식 비교 됩니다. 별표 표시는 크게 다른 치료 그룹에서 다른 긍정적인 컨트롤 그룹에 대 한 hsp16.2::gfp의 높은 식 (* * * p < 0.05). 꼬마 체 hsp16.2::gfp 식에는 영향을 미치지 않았다 고 형광 강도 동물 비슷한 부정적인 제어 그룹에 표시 (p > 0.05). 3 복제 n 실시 했다 = 각 치료 그룹에 대 한 10 하 고 일방통행 ANOVA와 Tukey의 임시 게시물 테스트와 비교. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58014/58014fig9.jpg"> 그림 9: 꼬마 체 미치지 않았다 잔디 3::gfp의 식. 100 μ M 파라콰트 그룹 (긍정적인 통제), 선택 그룹 (부정적인 제어), 그리고 꼬마 체 치료 그룹의 (임의의 형광 단위로) 잔디-3 식 표시 됩니다. 별표 표시 잔디-다른 그룹에서 현저 하 게 달랐다는 긍정적인 컨트롤 그룹에 대 한 3::gfp의 높은 식 (* * * p < 0.05). 꼬마 체 잔디 3::gfp 식에는 영향을 미치지 않았다 고 형광 강도 동물에 유사한 부정적인 제어 그룹에 표시 (p > 0.05). 3 복제 n 실시 했다 = 각 치료 그룹에 대 한 10 하 고 일방통행 ANOVA와 Tukey의 임시 게시물 테스트와 비교. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58014/58014fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>메쉬 크기</td>
			<td>N = 50</td>
			<td>N = 100</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 μ m</td>
			<td>95.33%</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>50 μ m</td>
			<td>99.00%</td>
			<td>93.33%</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 메쉬 크기의 백분율 수확량. 이 표에서 결과 n 테스트는 20 μ m 장치 = 3 복제와 n 테스트 50 μ m 장치 50 성인 2 복제에 대 한 50 성인 =, N = 3 복제에 대 한 100.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>메쉬 크기</td>
			<td>발달 단계</td>
			<td>본체 지름</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 μ m</td>
			<td>애벌레 단계 4</td>
			<td>~ 35 μ m</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 μ m</td>
			<td>1 일 성인</td>
			<td>~ 70 μ m</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 평균 몸 직경. 이 테이블 평균 몸 직경 3 측정 각 측정된 생활 단계에서 동일 하 게 15 동물에 대 한 각 웜 분산 평균 하 여 인수를 표시 합니다.

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Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

정렬 및의 인구 나이 일치의 청소에 대 한 방법론을 포함 하는 현재 프로토콜 꼬마 선 충. 그것은 연구에 대 한 선 충의 큰 실험적인 인구를 간단 하 고, 저렴 한, 그리고 효율적인 맞춤 도구를 사용 합니다.

꼬마 체: 낮은 악기와 작은 Multicellular 유기 체를 정렬에 대 한 방법론

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a well-established model organism used across a range of basic and biomedical research. Within the nematode ...

caenorhabditis-sieve-low-tech-instrument-methodology-for-sorting

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Caenorhabditis Sieve: A Low-tech Instrument and Methodology for Sorting Small Multicellular Organisms

6.2K 조회수.  University of Alaska Fairbanks. 정렬 및의 인구 나이 일치의 청소에 대 한 방법론을 포함 하는 현재 프로토콜 꼬마 선 충. 그것은 연구에 대 한 선 충의 큰 실험적인 인구를 간단 하 고, 저렴 한, 그리고 효율적인 맞춤 도구를 사용 합니다.

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Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

연구

발생학

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical applications driven by microorganisms. Next generation sequencing methods are widely utilized to resolve microbiomes, but they are generally resource and time intensive and deliver mostly qualitative information. Flow cytometric microbiome analysis does not suffer from those disadvantages and can provide relative subcommunity abundances and absolute cell numbers at-line. Although it does not deliver direct phylogenetic information, it can enhance the analysis depth and resolution of sequencing approaches. In sharp contrast to medical applications in both research and routine settings, flow cytometry is still not widely used for microbiome analysis. Missing information on sample preparation and data analysis pipelines may create an entry barrier for the researchers facing microbiome analysis challenges that would often be textbook flow cytometry applications. Here, we present three comprehensive workflows for pure cultures, complex communities in clear medium and complex communities in challenging matrices, respectively. We describe individual sampling and fixation procedures and optimized staining protocols for the respective sample sets. We elaborate the cytometric analysis with a complex research centered and an application focused bench top device, describe the cell sorting procedure and suggest data analysis packages. We furthermore propose important experimental controls and apply the presented workflows to the respective sample sets.

Flow cytometric analysis has proven valuable for investigating pure cultures and monitoring microbial community dynamics. We present three comprehensive workflows, from sampling to data analysis, for pure cultures and complex communities in clear medium as well as in challenging matrices, respectively.

특성화 미생물 역학-Cytometry 워크플로 순수 문화에서 자연 커뮤니티를 기반으로

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

환경과학

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

대규모 혼합 단계 Caenorhabditis 예인단 인구의 문화와 분석

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

유전학

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

의 자동 분리<em&gt; C. 엘레</em&gt; 가변 세균성 병원체에 의해 식민지

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

면역학 및 감염병학

Automatic Image Processing to Determine the Community Size Structure of Riverine Macroinvertebrates

Body size is an important functional trait that can be used as a bioindicator to assess the impacts of perturbations in natural communities. Community size structure responds to biotic and abiotic gradients, including anthropogenic perturbations across taxa and ecosystems. However, the manual measurement of small-bodied organisms such as benthic macroinvertebrates (e.g., &gt;500 &#181;m to a few centimeters long) is time-consuming. To expedite the estimation of community size structure, here, we developed a protocol to semi-automatically measure the individual body size of preserved river macroinvertebrates, which are one of the most commonly used bioindicators for assessing the ecological status of freshwater ecosystems. This protocol is adapted from an existing methodology developed to scan marine mesozooplankton with a scanning system designed for water samples. The protocol consists of three main steps: (1) scanning subsamples (fine and coarse sample size fractions) of river macroinvertebrates and processing the digitized images to individualize each detected object in each image; (2) creating, evaluating, and validating a learning set through artificial intelligence to semi-automatically separate the individual images of macroinvertebrates from detritus and artifacts in the scanned samples; and (3) depicting the size structure of the macroinvertebrate communities. In addition to the protocol, this work includes the calibration results and enumerates several challenges and recommendations to adapt the procedure to macroinvertebrate samples and to consider for further improvements. Overall, the results support the use of the presented scanning system for the automatic body size measurement of river macroinvertebrates and suggest that the depiction of their size spectrum is a valuable tool for the rapid bioassessment of freshwater ecosystems.

The article is based on the creation of an adapted protocol to scan, detect, sort, and identify digitized objects corresponding to benthic river macroinvertebrates using a semi-automatic imaging procedure. This procedure allows the acquisition of the individual size distributions and size metrics of a macroinvertebrate community in about 1 h.

강변 거대 무척추 동물의 군집 크기 구조를 결정하기위한 자동 이미지 처리

Body size is an important functional trait that can be used as a bioindicator to assess the impacts of perturbations in natural communities. Community ...

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

시투에 바이오 프로세스에서 단세포 형태학의 실시간 측정을 위한 현미경 검사법

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

생체공학

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these organisms form networks of interconnected hyphae, known as pellets, which are heterogeneous in size. Here we describe a method to analyze and sort mycelial pellets using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS). Detailed instructions are given for the use of the instrument and the basic statistical analysis of the data. We furthermore describe how pellets can be sorted according to user-defined settings, which enables downstream processing such as the analysis of the RNA or protein content. Using this methodology the mechanism underlying heterogeneous growth can be tackled. This will be instrumental for improving streptomycetes as a cell factory, considering the fact that productivity correlates with pellet size.

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Liquid-grown Streptomyces cultures are characterized by mycelial pellets that are heterogeneous in size. We here describe a method to analyze and sort such pellets in a high-throughput manner. These pellets can be used for further analyses, which will provide leads to understand and control growth heterogeneity.

의 정렬<em&gt; 스트렙토 마이 세스 (Streptomyces)</em복잡한 개체 파라 메트릭 분석기 및 분류기를 사용하여&gt; 셀 펠렛

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

생물학

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

거대한 바이러스 혼합물 분리를 위한 형광 활성화 세포 분류에 대한 대체 전략으로서의 단일 세포 마이크로 포부

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting for the Isolation of Scleractinian Cell Populations

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the mechanisms are not well understood. To investigate coral response to stressors, we need tools for analyzing cellular responses. In particular, we need tools that facilitate the application of functional assays to better understand how cell populations are reacting to stress. In the current study, we use fluorescence-activated cell sorting (FACS) to isolate and separate different cell populations in stony corals. This protocol includes: (1) the separation of coral tissues from the skeleton, (2) creation of a single cell suspension, (3) labeling the coral cells using various markers for flow cytometry, and (4) gating and cell sorting strategies. This method will enable researchers to work on corals at the cellular level for analysis, functional assays, and gene expression studies of different cell populations.

Corals create biodiverse ecosystems important for both humans and marine organisms. However, we still do not understand the full potential and function of many coral cells. Here, we present a protocol developed for the isolation, labeling, and separation of stony coral cell populations.

Scleractinian 세포 인구의 격리를 위한 형광 활성화 세포 분류

Coral reefs are under threat due to anthropogenic stressors. The biological response of coral to these stressors may occur at a cellular level, but the ...