이러한 개별 적인 인간 오디오 모델은 나노 물질 및 지식 약물을 포함 하 여 물질의 급성 면역 반응을 예측 하는 강력한 도구로 관련 된 면역 세포를 사용 합니다. 이 의학은 그 특정 반응을 평가하기 위하여 인간 상피 세포 및 인간 적인 1 차적인 면역 세포를 결합합니다. 신선하고 냉동된 모노사이클을 사용하면 실험 계획에 유연성을 제공합니다.
수많은 연구는이 모델은 행동 감각과 면역 감각 사이의 성간 통신에 대한 통찰력을 제공 할 수 있음을 보여 주었다. 이 데모에는 모델을 세포 배양의 개인적인 특성으로 스터딩하기 위한 모든 중요한 세부 사항을 포함하므로 실험을 복제하는 시각적 지침이 포함됩니다. 방광 프로토콜의 여러 단계는 복잡하고 특별한 취급이 필요합니다.
따라서 쉽게 따를 수 있는 모든 필수 세부 정보로 시연됩니다. 인간 버피 코트에서 말초 혈액 모노사이클을 분리하기 위해 수확버피 코트 백 내용물들을 250밀리리터 원추형 튜브 사이에 고르게 분할합니다. 각 튜브 250 밀리리터의 총 볼륨을 PBS와 조심스럽게 가져와 튜브를 세 가지 부드러운 반전과 혼합합니다.
그런 다음 버피 코트 PBS 용액을 4개의 새로운 50 밀리리터 튜브 사이에 균등하게 분할한 다음, CD 14 양성 자성 구슬의 마이크로리터 10마이크로리터를 튜브에 7번째 총 세포를 추가하고 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 충전시 파이펫을 피펫에서 분리하고 즉시 피펫의 상부 개구부를 엄지 손가락으로 연결한 다음 충전된 파이펫을 한 튜브의 바닥에 놓고 파이펫 개구부를 분리하여 밀도 그라데이션 매체가 버피 코트 PBS 혼합물 아래에 천천히 흐를 수 있도록 피펫 개구부를 분리하여 밀도 그라데이션 매체의 1밀리리터가 파이펫 내부에 남게 됩니다. 밀도 그라데이션 배지가 동일한 방식으로 각 튜브에 첨가되었을 때 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 세포를 분리하고 혈장과 밀도 그라데이션 중간 층 사이의 백색 2~3mm 두께의 말초 혈액 단핵 세포 층을 수집하기 위한 혈청 피펫을 사용합니다.
레이어를 연결하는 가장 좋은 방법은 플라즈마를 먼저 제거한 다음 논리적 파이펫을 억제하여 셀을 수집하는 것입니다. 두 개의 튜브 의 각 세트에서 말초 혈액 단핵 세포를 하나의 새로운 50 밀리 리터 튜브로 당기고 세척 당 신선한 PBS의 총 부피 50 밀리리터로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 상체를 버리고 신선한 PBS의 5 밀리리터로 각각 파이펫을 다시 중단하고 셀 서스펜션을 단일 튜브로 풀로 짜서 계산합니다.
계산 후, 원심 분리하고 일곱 번째 세포에 참석 당 자기 분리 버퍼의 80 밀리리터에 펠레트를 다시 중단. 그런 다음 튜브에 일곱 번째 총 세포에 참석하고 파이펫팅에 의해 잘 혼합 당 CD 14 양성 자기 구슬의 10 마이크로 리터를 추가합니다. 섭씨 4도에서 15분 동안 인큐베이션을 한 후 자기 분리 버퍼 3밀리리터로 자기 컬럼을 헹구고 컬럼에 세포를 추가합니다.
세척당 3밀리리터 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하고 1밀리리터의 신선한 자기 분리 버퍼가 들어 있는 15밀리리터 튜브로 컬럼을 옮겨 넣습니다. 그런 다음 플런저와 5밀리리터의 버퍼를 사용하여 CD 14 양성 세포를 튜브로 플러시합니다. 자기 비드 절연 CD 14 양성 세포의 분화를 유도한다.
먼저, 세포 배양 배지에서 밀리리터 농도당 6개의 세포에 1회 중단한다. 또는 MDDC 분화, 과립 부위 대식세포 식민지 자극인자의 밀리리터당 10나노그램을 튜브에 추가하고 6개의 잘 세포 배양판의 각 웰에 3밀리리터의 세포를 추가하거나, MDM 분화는 세포및 판세포에 대식세포 식민지 자극 인자의 밀리리터당 10나노그램을 첨가한다. 인간 폐포 상피 세포 조직 삼중 세포 공동 배양 모델을 설정하기 위해, 먼저 12웰 플레이트의 웰의 적절한 수로 전침 전 세포 배양 배지의 1.5 밀리리터를 전송하고 각 웰에 세포 배양 삽입을 배치한다.
다음으로 500마이크로리터의 상피 세포 현탁액을 밀리리터당 5배 10의 밀도로 각 삽입물의 정량면에 넣고 세포 배양 인큐베이터에서 4일 간 배양하기 위해 플레이트를 덮는다. 또는 MDDC 파종은 MDDC 분화에 사용되는 6개의 웰 플레이트의 우물에서 상류체를 대체하며, 신선한 웜 셀 배양 배지의 1밀리리터로 셀 스크레이퍼를 사용하여 각 우물에서 부착 세포를 분리합니다. 각각의 슈퍼네이트와 각 우물로 세 번 씻고 모든 세포 솔루션을 단일 원심 분리 튜브에 결합합니다.
수확된 MDDC는 원심분리및 멸균 핀셋에 의해 12개의 웰 플레이트의 인서트를 멸균 페트리 접시에 거꾸로 놓습니다. 삽입물의 기초 측에서 모든 상피 세포를 긁어 내고 신선한 세포 배양 배지에서 MDDC를 재중단하여 밀리리터당 이 세포의 4.2배 10분의 농도를 수행한다. 그런 다음 각 삽입에 150 마이크로리터의 셀을 추가하여 삽입의 전체 기저 표면이 거품없이 액체로 동일하게 덮입니다.
MDDC에 대해 입증된 분화MDDM을 수확한 후 MDDM 파종의 경우, 신선한 세포 배양 배지 농도의 밀리리터당 4개의 세포에 2.5배 10배로 세포를 희석시키고, 각 상피 세포 및 MDDC의 벽 아래로 500 마이크로리터를 추가하여 세포 배양 삽입을 함유한 다음, 2시간 동안 플레이트에 뚜껑을 배치하여 2시간 동안 플레이트에 뚜껑을 배치하였다. 다음 날 각 세포 배양 삽입 및 우물의 정점 및 기저 부위 모두에서 상체를 흡인합니다. 그런 다음 핀셋을 살균하여 우물에서 인서트를 들어 올리고 600 마이크로 떼의 신선한 프리떼를 각 우물에 세포 배양 배지에 추가합니다.
6일간의 분화 후 MDM은 둥근 모양으로 나타나고 MDDC는 더 긴 모양과 관찰 가능한 돌출부를 가진 세포로 구성된 클러스터를 형성합니다. 멤브레인 인서트에 대한 성장 3일 후, 상피 세포는 막 파열에 대한 양성 제어에 노출되면 기저구의 세포 배양 배지에서 현저한 증가와 조밀한 증가, 세포독성 물질에 대한 모델의 반응성을 입증한다. TNF 알파 또는 LPS를 통해 정량 자극시 측정된 젖산 탈수소효소 방출의 증가가 없습니다.
IL6 및 IL8의 방출에서 통계적으로 유의한 증가는 처리되지 않은 세포를 대조하는 것과 비교하여 LPS 및 TNF 알파 처리된 샘플 모두에서 관찰된다. LPS 및 TNF 알파 노출 공동 배양에서 해동 세포를 사용하는 것과 비교하여 신선한 말초 혈액 단핵으로부터 MDDM 및 MDDC를 사용하는 공동 배양 모델 간에 세포 형태에 차이가 관찰되지 않고, 중단된 상피 층을 관찰하였다. 기도 또는 기관지 세포와 같은 다른 유형의 인간 세포를 사용할 수 있으며, 다른 종점도 분석될 수 있다.
주로 연구원은 설정 하 고 하지만 다른 세포 유형으로 비슷한 사용 하 여이 기술에 의해 영감을 되었습니다.
