이 작품은 OOM에 수여 CBS 브리징 그랜트에 의해 지원됩니다. OOM, PAA 및 AS는 연구를 설계하고 실험을 수행했습니다. AS와 PAA는 결과를 분석했습니다. OOM과 PAA는 원고를 준비했습니다. 우리는 우리의 사용에 대 한 AAV를 사용할 수 있도록 칼 디세로스 박사 (스탠포드 대학) 감사.

모든 실험 및 동물 취급 절차는 루이지애나 주립 대학 수의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 실험동물
<ol><li>5-6 주 된 쥐를 사용.</li>
	<li>12h번의 빛과 어두운 주기의 표준 조건하에서 케이지당 3-5마리의 동물을 보관합니다. 음식과 물은 광고 리비툼을 제공해야합니다.</li>
</ol>2. 두개골 절제술 및 동물 준비
참고: 이 섹션에서는 마우스 두개골 절제술에 대한 사전 및 peri 수술 절차를 설명합니다. 표준 입체 장치와 적절한 좌표(Anteroposterior: AP, 평범석: ML 및 도르소벤트랄: DV)을 사용합니다. 관심있는 뇌 영역에 대한 좌표를 결정하기 위해 마우스 뇌 아틀라스를 참조하십시오.
<ol><li>인트라테오네아 케타민(100 mg/kg)/자일라진(10 mg/kg) 칵테일 주사로 쥐를 마취시킵니다. 수술 이 시작되기 전에 감각의 부재를 보장하기 위해 발가락 핀치 테스트를 수행. 참고: 또는 적절한 코 챔버가 있는 이소플루란 마취도 이 단계에 사용될 수 있다.</li>
	<li>스테레오탁스 장치에 동물의 머리를 부드럽게 고정합니다. 참고: 이 과정에서 동물을 조심스럽게 처리하는 것이 중요합니다. 또한 수술을 진행하기 전에 호흡 속도 및 기타 활력을 확인하십시오. 동물이 스트레스를 줄이기 위해 ~ 7 분 동안 휴식을 취하도록 허용하십시오.<ol>
<li>동물의 몸이 그것에 누워 있도록 스테레오 테틱 프레임에 가열 패드를 배치합니다. 이것은 체온을 유지하고 절차를 벗어나더라도 동물을 따뜻하게 유지하는 데 도움이됩니다. 수술 후 관리 및 회복을위한 가열 패드를 유지합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>클리퍼를 사용하여 두피에 머리카락을 제거하고 요오드 용액으로 피부를 청소하십시오.<ol>
<li>국소 리도카인을 적용하여 두피에 센세이션을 차단합니다.</li>
		<li>메스를 사용하여 전두엽에서 후수 부위까지 이어지는 중간 두피 절개를 만듭니다.</li>
		<li>요오드 용액으로 절개 부위를 청소한 다음 calvaria를 노출시하십시오. 참고: 소량의 과산화수소 용액을 적용하여 칼바리아에서 골막수를 제거할 수 있습니다. 이렇게 하면 랜드마크(브레그마와 람다)와 봉합사의 가시성이 향상됩니다.</li>
		<li>마우스 뇌 스테레오테전술 아틀라스를 사용하여, BREgma에 비해 AP 및 ML 좌표를 결정합니다.</li>
		<li>VTA 주사의 경우, 좌표 AP에 초미세 무딘 점 바늘 주사기(예: 신경 주사기)를 좌표 AP에 배치: -3.08 mm/ML: 0.5 mm 의 브레그마에 상대한다.</li>
		<li>표시된 AP/ML 좌표에서 두개골에 1mm 구멍(두개골 절제술)을 뚫기 위해 드릴링 도구를 사용합니다. 참고: 이 단계에서는 상당한 수준의 주의가 필요합니다. 드릴 비트가 뇌 조직을 분쇄하는 것을 방지하기 위해 드릴링하는 동안 최소한의 압력을 가해야 합니다. 현재 연구에서드릴 비트는 0.8mm였고 드릴 속도는 15,000rpm으로 설정되었습니다. 주의: 과산화수소가 절개 또는 칼바리아 를 세척하는 데 사용되었다면, 용액을 완전히 제거하거나 드릴링 전에 완전한 건조를 허용하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. AAV 칵테일 주입
참고: 이 섹션에서는 성인 C57BL/6 마우스(23-27 g)의 VTA내A내A에 AAV 주입 과정을 설명합니다. 상기 기술된 방법은 표준 입체 장치 및 적절한 좌표를 사용하여 임의의 뇌 영역으로 AAV 주입을 위해 사용될 수 있다. 이러한 프로토콜을 입증하기 위해 eYFP 및 hChR2는 CaMKIIα 프로모터(도1)에서AAV5 매개 트랜스페션을 사용하여 VTA 글루타민트 뉴런으로 발현되었다. Cre-lox 재조합도 이 단계에 사용할 수 있습니다.
<ol><li>인젝터에 초미세 무딘 점 바늘 (32 G, 100 nL 정확도로 5 μL 용량)을 장착한 주사기를 장착합니다. 마이크로 조작기에서 주사기 홀더를 수정합니다. 참고: 이 절차의 경우 1.6nL 교정이 있는 수동 주사기 홀더가 사용되었습니다. 자동 인젝터를 사용할 수도 있습니다.</li>
	<li>주사기를 이중 증류수로 채우고 유체의 흐름을 청소하고 테스트합니다.</li>
	<li>얼음에 AAV (세로형 5) 칵테일의 알리쿼트를 해동. AAV는 좋은 표현을 위해 바이러스 성 티터를 유지하기 위해 -80 °C에 저장되는 것이 가장 좋습니다.</li>
	<li>장착된 주사기를 1,000nL의 AAV 용액(인산염 완충식식염수(PBS), pH 7.4로 채우는 다. 주사 부위로 바늘을 낮추기 전에 액체의 흐름을 확인하기 위해 AAV 용액의 10 nL을 분배합니다.</li>
	<li>마이크로 조작기를 사용하여 바늘을 원하는 깊이(DV 좌표)로 고정적으로 낮춥니다. 바늘을 원하는 깊이로 하강한 후 주사 전에 주사기를 10분 동안 제자리에 두도록 하십시오. 참고: 이 절차의 경우, 바늘은 뇌의 피알 표면으로부터 4.5mm의 깊이(DV)에서 VTA로 하부되었다. 다른 뇌 영역의 경우 적절한 등소 벤트랄 좌표를 사용하십시오 (마우스 뇌 아틀라스참조).</li>
	<li>VTA에 AAV의 600-800 nL을 주입합니다. 사출 부피는 대상 사이트의 크기에 따라 조절될 수 있다.<ol>
<li>60nL/분(3분 간격)의 속도로 AAV 솔루션을 제공합니다.</li>
		<li>VTA 글루타민트 뉴런 및 프로젝션에서 eYFP 및 hChR2를 발현하려면 AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP를 주입하십시오. 참고: Cre-lox 재조합 방법은 실험의 목표에 따라 사용할 수도 있습니다.</li>
		<li>AAV 주입 후 15 분 동안 바늘을 제자리에 유지하십시오. 이렇게 하면 확산 및 역류가 줄어듭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>주사기 바늘을 철회한 다음 절개를 봉합하여 상처를 닫습니다.</li>
	<li>수술 후 치료의 일환으로 항생제와 진통을 관리하십시오. 따뜻한 패딩 플랫폼에 마우스를 놓고 깨어날 때까지 동물을 모니터링합니다. 참고: 3주 간의 주사 후 마우스 뇌 섹션에서 기자 단백질(eYFP)의 형광 검출에 의해 AAV 발현을 관찰할 수 있다. 또한, 사진 자극 실험은 3주 후에 수행될 수있다(도 2).</li>
</ol>4. 광유전학을 가진 생체 내 신경 기록에 대한 설정
참고: 이 섹션은 뇌 회로의 광유전학 추적 (CA1에 VTA 글루타메이트 뉴런 프로젝션)을 가진 급성 신경 기록의 단계를 설명합니다. 필요한 경우 이 단계를 시작하기 전에 시스템(증폭기 및 연결)에서 전기 소음 및 접지 문제를 확인합니다. 패러데이 케이지에서 이 단계를 수행하면 녹음에서 전기 노이즈를 제거할 수 있습니다.
<ol><li>AAV 주입 후 3주 후, 인트라테오탄 주사(0.2 mg/kg)로 마우스를 마취한다. 주의: 우레탄은 발암성이며 보호 장비를 착용하는 동안 조심스럽게 처리해야합니다. 또한, 이 농도에서 우레탄 마취를 투여하는 것은 생존이 아니다.</li>
	<li>이전에 설명한 바와 같이 동물의 머리를 입체 프레임에 부착합니다(2.2단계, 그림 3A). 두라(그림3A)를노출시키기 위해 두개골 절제술을 수행한다. 드릴링 도구(비트 크기: 0.8mm, 속도: 15,000rpm)를 사용하여 정수리 뼈의 일부를 제거합니다.<ol>
<li>두개골 절제술은 폭이 약 3mm x 4mm여야 합니다. 건조를 방지하기 위해이 지역에 인공 뇌척수액 (aCSF)의 방울을 적용합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>해부 (디지털) 현미경하에서, 노출된 두라를 소비하기 위해 구부러진 바늘 팁(27 G)을 사용한다. 이 지역의 섬세한 피알 덮개와 피질 조직을 분리하지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>나사를 잡기 위해 목막 뼈에 구멍을 뚫고 (비트 크기 : 0.8 mm, 속도 : 10,000 rpm) 지상 나사 (팬 헤드 필립스 나사; M0.6 x 2.0 mm).</li>
	<li>스테인리스 스틸 접지 와이어를 연결합니다. 참고 : 다른 유형의 전선도 사용할 수 있습니다(그림 3b).</li>
	<li>결합된 사진 자극(VTA) 및 신경 기록(CA1)의 경우, 초미세(10 μm 또는 1 μm) 미세 조작기가 장착된 다중 레일 스테레오택시 장치를 사용하십시오. 광섬유와 기록 신경 프로브를 각각 10 μm 범위 및 1 μm 범위 마이크로 조작기에 장착합니다.<ol>
<li>필요한 경우 헤드 스테이지 프로브 어댑터(그림3c)를사용합니다. 참고: 현재 프로토콜에서 32채널 헤드 스테이지에는 4채널 레코딩 전극(도3d)을보유하는 어댑터가 장착되었습니다. 스테인레스 스틸 접지 와이어는 어댑터의 접지 연결 포트로 납땜되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>좌표 AP: -3.08 mm ML: 0.5 mm, VTA에 400 μm 직경 광섬유를 낮춥다.<ol>
<li>광섬유를 낮추기 전에 광섬유 케이블(스테인리스 스틸 또는 세라믹 페룰)에 페룰을 연결하여 광섬유 결합 LED 소스에 연결합니다. 참고: 빛의 강도와 초점이 원하는 대로 설정되어 있는지 확인합니다. LED 광원의 선택은 대상이 되는 작전과 일치해야 합니다. 여기서, 470nm(블루라이트) LED 드라이버가 hChR2 포토활성화(도4a)에사용되었다.</li>
		<li>광 펄스를 신경 기록과 동기화하려면 LED 드라이버 및 레코딩 컨트롤러 디지털 IN 포트를 트랜지스터 트랜지스터 로직(TTL) 펄스(도4b)에연결합니다. 이는 BNC 스플리터를 사용하여 달성할 수 있습니다. 참고: TTL 펄스러를 사용하면 원하는 펄스 트레인 주파수와 지속 시간을 디지털 방식으로 설정할 수 있습니다. 현재 프로토콜에서 10ms 광 펄스는 50Hz18에서트리거되었습니다. LED 드라이버의 TTL 컨트롤의 경우 드라이버를 "트리거"로 전환합니다. 이 모드에서는 "노브"를 돌려 광 강도를 조절할 수 있습니다. 자극 주파수는 실험 변수를 수용하기 위해 조정할 수 있으며 1~100Hz 범위일 수 있습니다. 신경 회로 추적의 경우 >20Hz의 자극 주파수를 권장합니다.</li>
		<li>노브를 조정하여 광전 아티팩트를 생성하지 않고 응답을 생성할 수 있는 효과적인 강도를 결정합니다. 필요한 경우, 광학 섬유를 재배치하여아티팩트(19)를제거한다. 참고: 현재 프로토콜에 사용되는 LED 드라이버는 ~21.8mW의 광전력을 생성합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 신경 녹음
<ol><li>15-50 μm 두께의 생크가 있는 급성 신경 프로브를 사용하여 길이가 최소 5mm이상측정됩니다. 참고: 깊은 뇌 구조에서 기록 하면 더 긴 생크와 신경 프로브 필요 합니다. 현재 연구에서는 20mm 생크 길이를 가진 프로브가 사용되었습니다.</li>
	<li>시리얼 주변 인터페이스(SPI) 케이블을 통해 사전 증폭기 헤드 스테이지를 레코딩 컨트롤러에 연결합니다. 레코딩 컨트롤러 포트에서 LED 색상 조명을 확인합니다. 녹색 및 노란색 LED는 연결된 앰프 보드에 적절한 전압을 나타냅니다. 빨간색 LED는 작동하는 소프트웨어 헤드 스테이지제어(그림 5b)를나타냅니다.</li>
	<li>마이크로 조작기를 사용하여 CA1의 피라미드 세포 층에 전극 접촉 부위를 배치합니다(AP: -1.94mm, ML: +1.0mm, DV: +1.1 ~ 1.2mm). 참고: 광섬유와 전극은 사진 화와 녹음을 위해 다른 원하는 뇌 영역에 배치할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 증폭기 및 필터 설정
<ol><li>USB 3.0 포트를 통해 레코딩 컨트롤러 증폭기 시스템을 컴퓨터에 연결합니다. SPI 케이블을 사용하여 헤드 스테이지를 앰프에 연결합니다. 컨트롤러 소프트웨어를 실행합니다. 제대로 연결되지 않으면 시스템에 "장치가 찾을 수 없는" 메시지가 표시됩니다.</li>
	<li>실행 실행을 클릭하여 채널에서 활동을 봅니다. 각 파형은 전압(y축) 대 시간(x축)으로 플로팅됩니다. 관심 영역에 따라 전압 및 시간 축척을 조정하여 파형 디스플레이를 조정합니다.</li>
	<li>몇 채널만 활성 상태인 경우 사용되지 않는 채널을 사용하지 않도록 설정하여 저장소 디스크의 파일 크기를 줄입니다.</li>
	<li>획득 소프트웨어에서 대역폭 매개 변수를 편집하여 샘플링 속도와 절충 주파수를 설정합니다. 단일 단위 레코딩의 경우 상하 컷오프 주파수를 각각 300Hz 및 5,000Hz로 설정합니다. 증폭기 샘플링 속도를 30kS/s로 변경합니다. 참고: 높은 샘플링 속도를 선택하면 파일 크기가 커집니다.</li>
	<li>녹화하기 전에 1,000Hz에서 임피던드를 측정하여 전극 채널의 무결성을 확인하십시오. 이 작업은 사용자 인터페이스(컨트롤러 소프트웨어)에서 함수를 시작하여 수행할 수 있습니다. 작업 채널에는 0.1에서 5MΩ범위의 임피던스 값이 있어야 합니다.</li>
	<li>오디오 출력(스피커)이 ANALOG OUT 포트에 연결되어 있는 경우 최적의 스파이크 사운드를 위해 게인 및 소음기를 조정합니다.</li>
	<li>스파이크 레코딩에 TTL 펄스 트레인 마커를 표시하려면 디지털 IN 마커에 대한 디스플레이를 활성화합니다. 펄스 트레인 타임스탬프를 기록하려면 메인 실험 전에 디지털 IN 채널 디스플레이를 사용하도록 설정합니다. 참고: 일반적으로 하나 이상의 "디지털 IN" 채널(1 또는 2)이 있습니다. TTL 펄스의 BNC 케이블이 레코딩 컨트롤러 소프트웨어에 표시되도록 선택한 "DIGITAL IN" 포트에 연결되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>스파이크 파형의 실시간 보기를 위해 스파이크 범위 창을 열고 마우스 클릭을 사용하여 임계값을 설정합니다.</li>
	<li>루트 평균 사각형(μV의 RMS)을 모니터링하여 노이즈 레벨을 검사합니다. 클린 스파이크 레코딩의 경우 신경 스파이크 임계값이 최소 5배 RMS인 것이 바람직하다.</li>
	<li>설정이 완료되면 파일 출력 형식을 선택합니다. 참고: 여기, CA1 신경 스파이크는 .rhd 형식으로 기록되었습니다. 다른 파일 형식(.rhs 및 .dat)도 분석 소프트웨어에서 허용하는 파일 형식과 일치하도록 선택할 수 있습니다.</li>
</ol>7. 생체 내 광유전학 적고 및 설정
<ol><li>다양한 조정 가능한 펄스 매개 변수를 표시하는 TTL(펄스 제어 소프트웨어)을 엽니다. 소프트웨어에서 적절한 COM 포트를 선택합니다. 기차 및 그룹 설정을 조정하여 펄스 매개 변수를 설정합니다. 참고: 펄스 상태는 실험 변수 및 설계를 고려하여 결정되어야 합니다.</li>
	<li>증폭기 컨트롤러 소프트웨어에서 실행을 클릭하여 해마 또는 원하는 뇌 영역에서 신경 스파이크를 감지합니다. 필요한 경우 전극 깊이를 조정하여 실행 가능한 활성 뉴런을 감지합니다.</li>
	<li>세포외 전압 활동이 감지되면 기준선 스파이크를 15분 동안 관찰하고 동물의 활력을 모니터링합니다. 또한, 광 펄스를 테스트하여 CA1 또는 원하는 해부학 표적 영역 내에서 반응성 뉴런을 검출한다. 참고: 광전 유물을 확인하고 광강도 또는 광섬유 위치를 조정하여 제거합니다.</li>
	<li>원하는 주파수에서 광 펄스를 트리거하기 전에 ~10 분 동안 기준 활성을 기록합니다(그림 5a,b). 이렇게 하면 조명이 있거나 없는 발사 또는 버스트 속도를 비교할 수 있습니다. 참고: 현재 연구에서기준 활성은 조명 없이 10분 동안 기록되었고, 그 다음으로 50Hz(Movie1)에서조명이 뒤따랐다.</li>
</ol>8. 분석
<ol><li>.rhd 파일을 넥스5 출력 형식으로 변환합니다.</li>
	<li>파일 이름을 처리합니다. Nex5 파일은 단일 단위 래스터 열차 및 파형을 감지하는 오프라인 선별기 소프트웨어의 파일(그림 5a-b).<ol>
<li>드롭다운 창에서 원하는 채널을 선택합니다. 참고: 지속적으로 기록된 스파이크 데이터는 OFSS의 별도의 창에서 볼 수 있습니다. 시간 척도도 조정할 수 있습니다. 테트로드를 사용하는 경우 OFSS는 4개의 채널을 테트로드로 정렬하도록 설정할 수 있습니다.</li>
		<li>임계값 교차 파형 추출에 대한 전압 레벨을 설정합니다. 주의: 적절한 스파이크 감지를 위해 최소 5배의 RMS를 사용합니다.</li>
		<li>파형을 감지한 다음, 계곡 을 구사(자동) 또는 K-means(반자동) 방법을 사용하여 스파이크 정렬을 수행합니다. 필요한 경우 PCA(3D 주체 구성 요소 분석) 공간의 유사한 영역을 차지하는 병합 단위입니다.</li>
		<li>정렬된 내보내기입니다. 추가 분석을 위한 넥스5 파일(그림5c-d). 참고: 인터스파이크 간격, 발사 속도 및 버스트 속도에 대한 분석 결과를 다른 분석 플랫폼으로 내보낼 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. AAV 발현의 형광 검출
<ol><li>녹음 후, 이소플루란 챔버에서 동물을 안락사.</li>
	<li>10mM PBS(~10mL)로 경외 관류를 수행하고, 4% 인산염 완충 파라포름데히드(PB-PFA, ~10mL)를 수행한다.</li>
	<li>전체 뇌를 그대로 제거하고 48 시간 동안 4 % PB-PFA로 수정하십시오.</li>
	<li>고정 된 뇌를 4 ° C에서 냉동 보존을위한 30 % 자당을 포함하는 4 % PB-PFA로 전송합니다. 72시간 후, 뇌를 극저온으로 절개하고 젤라틴 코팅 슬라이드에 슬라이스를 장착합니다. 참고: 현재 프로토콜에서, 해마의 폐쇄된 부분(rostral)을 포함하는 단면이 DG, CA3 및 CA1에서 AAV 표지단을 시연하도록 선택되었다.</li>
</ol>

<ol>
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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+vector:+use+for+transgene+expression+and+anterograde+tract+tracing+in+the+CNS.">Recombinant adeno-associated virus vector: use for transgene expression and anterograde tract tracing in the CNS.</a> Brain Research. 793 (1-2), 169-175 (1998).</li><li>Zingg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+anterograde+transsynaptic+tagging:+mapping+corticocollicular+input-defined+neural+pathways+for+defense+behaviors.">AAV-mediated anterograde transsynaptic tagging: mapping corticocollicular input-defined neural pathways for defense behaviors.</a> Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).</li><li>Wang, C., Wang, C., Clark, K., Sferra, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+AAV+serotype+1+transduction+efficiency+and+tropism+in+the+murine+brain.">Recombinant AAV serotype 1 transduction efficiency and tropism in the murine brain.</a> Gene therapy. 10 (17), 1528 (2003).</li><li>Ahlgrim, N. S., Manns, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Stimulation+of+the+Basolateral+Amygdala+Increased+Theta-Modulated+Gamma+Oscillations+in+the+Hippocampus.">Optogenetic Stimulation of the Basolateral Amygdala Increased Theta-Modulated Gamma Oscillations in the Hippocampus.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13, 87 (2019).</li><li>Buzsaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+probing+local+circuits:+high-density+silicon+probes+combined+with+optogenetics.">Tools for probing local circuits: high-density silicon probes combined with optogenetics.</a> Neuron. 86 (1), 92-105 (2015).</li><li>Benardo, L. S., Prince, D. 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Y., Foerde, K., Galvan, A., Shohamy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Upside+to+Reward+Sensitivity:+The+Hippocampus+Supports+Enhanced+Reinforcement+Learning+in+Adolescence.">An Upside to Reward Sensitivity: The Hippocampus Supports Enhanced Reinforcement Learning in Adolescence.</a> Neuron. 92 (1), 93-99 (2016).</li><li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reward+and+Aversion.">Reward and Aversion.</a> Annual Review of Neuroscience. 39, 297-324 (2016).</li><li>Kahn, I., Shohamy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+connectivity+between+the+hippocampus,+nucleus+accumbens,+and+ventral+tegmental+area+in+humans.">Intrinsic connectivity between the hippocampus, nucleus accumbens, and ventral tegmental area in humans.</a> Hippocampus. 23 (3), 187-192 (2013).</li><li>Lisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+hippocampal+circuitry+to+function:+recall+of+memory+sequences+by+reciprocal+dentate-CA3+interactions.">Relating hippocampal circuitry to function: recall of memory sequences by reciprocal dentate-CA3 interactions.</a> Neuron. 22 (2), 233-242 (1999).</li><li>Lisman, J. E., Grace, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hippocampal-VTA+loop:+controlling+the+entry+of+information+into+long-term+memory.">The hippocampal-VTA loop: controlling the entry of information into long-term memory.</a> Neuron. 46 (5), 703-713 (2005).</li><li>Broussard, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+Regulates+Aversive+Contextual+Learning+and+Associated+In+Vivo+Synaptic+Plasticity+in+the+Hippocampus.">Dopamine Regulates Aversive Contextual Learning and Associated In Vivo Synaptic Plasticity in the Hippocampus.</a> Cell Reports. 14 (8), 1930-1939 (2016).</li><li>Hansen, N., Manahan-Vaughan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1/D5+receptors+mediate+informational+saliency+that+promotes+persistent+hippocampal+long-term+plasticity.">Dopamine D1/D5 receptors mediate informational saliency that promotes persistent hippocampal long-term plasticity.</a> Cerebral Cortex. 24 (4), 845-858 (2014).</li><li>Salvetti, B., Morris, R. G., Wang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+rewarding+and+novel+events+in+facilitating+memory+persistence+in+a+separate+spatial+memory+task.">The role of rewarding and novel events in facilitating memory persistence in a separate spatial memory task.</a> Learning &amp; Memory. 21 (2), 61-72 (2014).</li><li>Ntamati, N. R., Luscher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VTA+Projection+Neurons+Releasing+GABA+and+Glutamate+in+the+Dentate+Gyrus.">VTA Projection Neurons Releasing GABA and Glutamate in the Dentate Gyrus.</a> eNeuro. 3 (4), (2016).</li><li>Yoo, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventral+tegmental+area+glutamate+neurons+co-release+GABA+and+promote+positive+reinforcement.">Ventral tegmental area glutamate neurons co-release GABA and promote positive reinforcement.</a> Nature Communications. 7, 13697 (2016).</li><li>Funahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+Memory+in+the+Prefrontal+Cortex.">Working Memory in the Prefrontal Cortex.</a> Brain Sciences. 7 (5), (2017).</li><li>Luo, A. H., Tahsili-Fahadan, P., Wise, R. A., Lupica, C. R., Aston-Jones, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+context+with+reward:+a+functional+circuit+from+hippocampal+CA3+to+ventral+tegmental+area.">Linking context with reward: a functional circuit from hippocampal CA3 to ventral tegmental area.</a> Science. 333 (6040), 353-357 (2011).</li><li>McNamara, C. G., Dupret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+sources+of+dopamine+for+the+hippocampus.">Two sources of dopamine for the hippocampus.</a> Trends in Neurosciences. 40 (7), 383-384 (2017).</li><li>McNamara, C. G., Tejero-Cantero, A., Trouche, S., Campo-Urriza, N., Dupret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons+promote+hippocampal+reactivation+and+spatial+memory+persistence.">Dopaminergic neurons promote hippocampal reactivation and spatial memory persistence.</a> Nature Neuroscience. 17 (12), 1658-1660 (2014).</li><li>Cardin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nature Protocols. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Mei, Y., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+and+approaches+for+optogenetics.">Molecular tools and approaches for optogenetics.</a> Biological Psychiatry. 71 (12), 1033-1038 (2012).</li><li>Zingg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-Mediated+Anterograde+Transsynaptic+Tagging:+Mapping+Corticocollicular+Input-Defined+Neural+Pathways+for+Defense+Behaviors.">AAV-Mediated Anterograde Transsynaptic Tagging: Mapping Corticocollicular Input-Defined Neural Pathways for Defense Behaviors.</a> Neuron. 93 (1), 33-47 (2017).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+opsin+family+of+optogenetic+tools.">The microbial opsin family of optogenetic tools.</a> Cell. 147 (7), 1446-1457 (2011).</li><li>Aravanis, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+neural+interface:+in+vivo+control+of+rodent+motor+cortex+with+integrated+fiberoptic+and+optogenetic+technology.">An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology.</a> Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).</li><li>Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+optogenetics.">Two-photon optogenetics.</a> Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).</li></ol>

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지난 10년 동안 AAV 구조의 설계가 크게 발전했습니다. 이와 같이, 더 많은 뉴런 특이성 프로모터는 향상된 형질 전환특이성(14)을위한 AAV 혈청형배열에 편입되었다. 형광 단백질, 수송기, 수용체 및 이온 채널을 위한 유전자를 결합함으로써, AAV의 도서관은 지금 화상 진찰, 신경 변조 및 시냅스 활동 검출을 위해 존재합니다. 시판되는 AAV-constructs에서, 유전적으로 인코딩된 형광소 ?...

지난 10년 동안, 뉴런형 변조의 특이성을 높이기 위해 다양한 유전도구가 개발되었으며, 복잡한 신경망1의매핑. 특히, 신경 세포에서 감염 하 고 복제 하는 고유 한 능력을 가진 신경 tropic 바이러스 는 표현 하거나 뉴런 하위 유형에 특정 단백질을 ablate 배포 되었습니다. 형광 단백질 또는 유전적으로 인코딩된 시냅스 활동 지표를 수용할 때, 전감염된 AAV 벡터 라벨및 뇌 영역2,3을통해 신경망을 묘사한다. AAV 구조에서 프로모터의 선택은 어느 정도의특이성(프로모터 의존식)을 가진 뉴런 유형에서 벡터의 발현을 지시한다. 그러나, Cre-lox 재조합을 통해, AAV 구문은 뉴런 라벨링4,5,6,7에대한 더 큰 특이성을 가지고 배포된다. 참고로, AAV 벡터에 포장된 광활성화 미생물 opsinsins 및 형광 단백질은 다양한 뉴런 아형8으로발현될 수 있으며, 이미징, 뉴런 형 회로 추적 및 광변조9,10에이상적입니다.
AAV는 뇌 영역(또는 핵)에 스테레오전술적으로 주입되어 소마, 원점 및 축축단 단자에서 리포터 단백질의 발현을 구동한다. AAV의 신경발현은 기자 유전자(eYFP)를 수용하는 것으로 다른 뇌 영역을 온팎으로 신경세포체및 해부학적 추적의 라벨링을 용이하게 한다11,12,13,14. AAV-eYFP는 빛 제어 옵신(예를 들어 hChR2)을 운반하는 구조물을 영상6,15 및 자극 기반의 생리학적 추적을 위한 도구로 전개하여 생체 내 뇌 영역을 표적으로 삼을 수 있다. AAV 혈청형에 따라, 뉴런 라벨링의 방향은11,12의역행 또는 역행일 수 있다. 이전 연구는 AAV5 뉴런에서 선행 여행 것을설립했다 12. 따라서, hChR2를 발현하는 세포 체의 사진 자극은 뇌의 다른 곳에서 미리 생성효과를 생성(표적)17.
여기서, CaMKIIα 프로모터를 사용한 AAV(혈청형 5)는 VTA 글루타민트 뉴런 및 축삭 프로젝션에서 eYFP(리포터) 및 hChR2(opsin)를 발현하는 데 사용되었다. 이 연구의 결과는 CA1, CA3 및 DG 해마 지역에서 VTA 글루타민제 전시냅스 말단의 층 의존 분포를 보여줍니다. 또한 VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 기준값과 비교할 때 생체 내에서 CA1 다중 유닛 및 단일 단위 발사 속도를 증가시켰습니다. 이 프로토콜은 신경 회로 추적 실험에서 얻은 데이터의 품질을 높일 수있는 저렴한 도구와 시판되는 소프트웨어를 사용합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3% Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>H312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV-CaMKII&#945;-ChR2-eGYP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #26969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC cable</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC Splitter</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Split Mating Sleeve for &#216;1.25mm Ferrules.</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ADAL1-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>LR 39098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin coated slides</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>OBSLD01CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton&#39;s syringe (Neuros)</td>
			<td>WPI Inc.</td>
			<td>06H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage adapter</td>
			<td>Neuronexus</td>
			<td>Adpt-Q4-OM32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High impedance silicon probe</td>
			<td>Neuronexus</td>
			<td>Q1x1-tet-5mm-121-CQ4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INTAN 512ch Recording Controller</td>
			<td>INTAN</td>
			<td>RHD2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine solution</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>1425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Spectrum</td>
			<td>K1068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED Driver</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source (470 nm)-blue light</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M470F3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M0-203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optic fiber</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>CFMLC14L05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pan head philips screw (M0.6 X 2mm)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>M0.6 X 2mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-amplifier headstage (32 Channel)</td>
			<td>INTAN</td>
			<td>C3314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>Kopf</td>
			<td>1530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTL pulser</td>
			<td>Prizmatix</td>
			<td>4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td>Company</td>
			<td>Version</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intan Recording Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuroexplorer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexon Offline Spike Sorter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSF Composition:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combined in vivo anatomical and functional tracing of ventral tegmental area glutamate terminals in the hippocampus

두뇌에 있는 신경 하위 인구의 Optogenetic 변조는 연구원이 생체 내및 ex vivo에 있는 신경 회로를 해부하는 것을 허용했습니다. 이것은 신경 회로 내의 신경 모형의 역할 및 학습에 상대적인 정보 인코딩에 있는 그들의 중요성을 결정하기 위한 전제를 제공합니다. 마찬가지로, 이 방법은 깨어 있는 동물및 마취동물에서 두 개 이상의 연결된 뇌 영역의 생리적 중요성을 테스트하는 데 사용될 수 있다. 현재 연구는 VTA 글루타민트 뉴런이 마취 된 마우스의 CA1 (해마)에서 푸티피라미드 뉴런의 발사 속도를 조절하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 해마층의 VTA 전시냅스 글루타메이트 단자 추적을 위해 VTA 글루타민트 뉴런의 아데노 관련 바이러스(AAV)의존 라벨을 사용합니다. VTA 글루타민트 말미제 말단의 전방 추적을 허용한 AAV 벡터에 의해 수용된 광 제어 옵신(channelrhodopsin; hChR2) 및 형광 단백질(eYFP)의 발현( VTA 글루타메이트 뉴런 세포 체체)의 사진 자극(VTA에서). 고임피던스 급성 실리콘 전극은 생체 내에서 VTA 사진 자극에 대한 다중 장치 및 단일 단위 응답을 검출하기 위해 CA1에 배치되었다. 이 연구의 결과는 해마 (CA1, CA3 및 DG)에 있는 전시냅스 VTA 글루타민단 단자의 층 의존분포를 보여줍니다. 또한, VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 생체 내에서 PUTative CA1 피라미드 단위의 발사 및 버스트 속도를 증가시켰습니다.

앤티로그라드 추적
AAV 발현은 C57BL/6 마우스의 VTA에서 기자 단백질(eYFP)의 면역형광 이미징에 의해 확인되었다 21일 후사(그림2). 해마에서 사전 시냅스 VTA 글루타민트 프로젝션의 성공적인 anterograde 라벨링은 또한 DG, CA3 및 CA1의 층에서 eYFP 검출에 의해확인되었다(도 6a-d; 영화 2와 3).
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Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

현재 프로토콜은 해마에 복부 테진 영역 (VTA) 글루타민트 프로젝션을 추적하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 VTA 글루타민단 단자가 생체 내에서 CA1 퍼티티 피라미드 발사 속도를 조절하는 방법을 보여주기 위해 CA1 레코딩과 결합되었습니다.

해마의 생체 내 해부학 및 기능적 추적

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...

combined-vivo-anatomical-functional-tracing-ventral-tegmental-area

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.8K 조회수.  Louisiana State University School of Veterinary Medicine. 현재 프로토콜은 해마에 복부 테진 영역 (VTA) 글루타민트 프로젝션을 추적하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 VTA 글루타민단 단자가 생체 내에서 CA1 퍼티티 피라미드 발사 속도를 조절하는 방법을 보여주기 위해 CA1 레코딩과 결합되었습니다.

비디오: Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

연구

신경과학

Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five decades of inquiry into the molecular deficiencies associated with dopamine regulation. The majority of these inquiries of dopamine regulation in the brain focus upon the molecular basis for its regulation in the terminal field regions of the nigrostriatal and mesoaccumbens pathways; striatum and nucleus accumbens. Furthermore, such studies have concentrated on analysis of dopamine tissue content with normalization to only wet tissue weight. Investigation of the proteins that regulate dopamine, such as tyrosine hydroxylase (TH) protein, TH phosphorylation, dopamine transporter (DAT), and vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) protein often do not include analysis of dopamine tissue content in the same sample. The ability to analyze both dopamine tissue content and its regulating proteins (including post-translational modifications) not only gives inherent power to interpreting the relationship of dopamine with the protein level and function of TH, DAT, or VMAT2, but also extends sample economy. This translates into less cost, and yet produces insights into the molecular regulation of dopamine in virtually any paradigm of the investigators' choice.
We focus the analyses in the midbrain. Although the SN and VTA are typically neglected in most studies of dopamine regulation, these nuclei are easily dissected with practice. A comprehensive readout of dopamine tissue content and TH, DAT, or VMAT2 can be conducted. There is burgeoning literature on the impact of dopamine function in the SN and VTA on behavior, and the impingements of exogenous substances or disease processes therein 1-5. Furthermore, compounds such as growth factors have a profound effect on dopamine and dopamine-regulating proteins, to a comparatively greater extent in the SN or VTA 6-8. Therefore, this methodology is presented for reference to laboratories that want to extend their inquiries on how specific treatments modulate behaviour and dopamine regulation. Here, a multi-step method is presented for the analyses of dopamine tissue content, the protein levels of TH, DAT, or VMAT2, and TH phosphorylation from the substantia nigra and VTA from rodent midbrain. The analysis of TH phosphorylation can yield significant insights into not only how TH activity is regulated, but also the signaling cascades affected in the somatodendritic nuclei in a given paradigm.
We will illustrate the dissection technique to segregate these two nuclei and the sample processing of dissected tissue that produces a profile revealing molecular mechanisms of dopamine regulation in vivo, specific for each nuclei (Figure 1).

Dopamine is distinctly regulated in the midbrain nuclei, which contain the cell bodies and dendrites of the dopamine neurons. Here we describe a dissection and sample-handling approach to maximize results, and thus conclusions and insights, on dopamine regulation in the midbrain nuclei of the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA) in rodents.

Substantia Nigra 및 복부 Tegmental 지역의 도파민 규정의 종합적인 프로파일

Dopamine is a vigorously studied neurotransmitter in the CNS. Indeed, its involvement in locomotor activity and reward-related behaviour has fostered five ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

레이저 캡처 이외에 Microdissection - 개별 도파민 신경 세포의 분리 및 전체 복부 피개 영역의 데모

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

동시<em&gt; 생체</em두 망막의&gt; 기능 테스트로<em&gt; 생체</em&gt; 전위도 시스템

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

결합 된 방법론을 활용하여 축삭 분기 및 신경 세포 형태 형성 동안 플라즈마 멤브레인 배달의 역할을 정의합니다

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to study the molecular composition of membranes produced a significant decline in its use. Recently, there has been a major revival in freeze-fracture electron microscopy thanks to the development of effective ways to reveal integral membrane proteins by immunogold labeling. One of these methods is known as detergent-solubilized Freeze-fracture Replica Immunolabeling (FRIL).
The combination of the FRIL technique with optogenetics allows a correlated analysis of the structural and functional properties of central synapses. Using this approach it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their respective expression of a tagged channelrhodopsin and specific molecular markers. The distinctive appearance of the postsynaptic membrane specialization of glutamatergic synapses further allows, upon labeling of ionotropic glutamate receptors, to quantify and analyze the intrasynaptic distribution of these receptors. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to prepare paired replicas and how to immunolabel them. We will also discuss the caveats and limitations of the FRIL technique, in particular those associated with potential sampling biases. The high reproducibility and versatility of the FRIL technique, when combined with optogenetics, offers a very powerful approach for the characterization of different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.
Here, we provide an example how this approach was used to gain insights into structure-function relationships of excitatory synapses at neurons of the intercalated cell masses of the mouse amygdala. In particular, we have investigated the expression of ionotropic glutamate receptors at identified inputs originated from the thalamic posterior intralaminar and medial geniculate nuclei. These synapses were shown to relay sensory information relevant for fear learning and to undergo plastic changes upon fear conditioning.

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

Optogenetic 및 동결 골절 복제 Immunolabeling는 마우스 편도체에서 글루타메이트 수용체의 입력 특정 배열을 검사하기 위해 결합

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...