간질은 널리 퍼진 신경질환입니다. 라인 피질-해마 organotypic 조각은 생체 간질에서 유사하고 따라서 간질 발생의 전 생체 모델로 사용될 수 있는 진화하는 간질 같이 사건을 묘사합니다. 이 시스템은 실제로 간질 발생의 역학 및 진행을 모니터링하기위한 훌륭한 도구뿐만 아니라이 뇌 병리학에 대한 잠재적 인 치료 목표를 선별합니다.
저와 함께 절차를 시연하는 것은 제 학생 프란시스코 메다와 마팔다 카르발호가 될 것입니다. 산후 날부터 7마리의 스프라그-Dawley 새끼까지 뇌를 수확하려면 먼저 GBSS의 5밀리리터에서 머리를 세 번 씻으세요. 생물 안전 캐비닛에서 작업, 단단히 장소에 머리를 잡고 전두엽에 척추 대원에서 중간라인을 따라 두피를 잘라 얇은 팁 가위를 사용하기 위해 눈 소켓에 날카로운 집게를 삽입합니다.
같은 방식으로 두개골을 잘라 대뇌 횡단 균열을 따라 곡선 긴 집게를 사용하여 두개골 조각을 분리합니다. 주걱을 사용하여 후각 전구를 버리고 뇌 등쪽을 차가운 GBSS 5 밀리리터를 포함하는 60mm 플레이트로 옮춥니다. 소뇌에 미세 한 집게를 삽입 하 고 조심스럽게 반구를 열 중간 라인을 따라 주걱을 삽입.
짧은 곡선 포셉을 사용하여 해마 구조를 건드리지 않고 해마를 덮는 과잉 조직을 조심스럽게 제거한 다음 각 해마 아래로 자른다. 한 번에 한 반구를 한 번에 위로 하고 서로 평행하게 필터 용지 조각으로 옮길 수 있습니다. 필터 용지를 칼날에 수직으로 반구가 있는 티슈 헬기에 놓고 반구를 350미크론 슬라이스로 자른다.
슬라이스된 조직을 차가운 GBSS 5밀리리터가 들어 있는 새로운 페트리 접시에 옮기고 둥근 팁 전극을 사용하여 구조적으로 손상되지 않은 라인 피질과 해마로 시료만 유지하는 슬라이스를 조심스럽게 분리합니다. DG 및 CA 영역은 내측 및 회반 피질 영역뿐만 아니라 완벽하게 정의되어야합니다. 주걱과 둥근 팁 전극을 사용하여 최대 4개의 손상되지 않은 슬라이스를 개별 인서트에 잘 당 1.1 밀리리터의 배양 배지를 함유한 6웰 플레이트의 적절한 수의 우물에 배치합니다.
P20 파이펫을 사용하여 각 슬라이스 주위에서 초과 해부 매체를 제거합니다. 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 매 2~3일마다 배지를 변경합니다.
집게를 사용하여 인서트를 들어 올립니다. 해당 우물에서 매체를 흡인하고 인서트를 제자리에 다시 배치합니다. P1000 파이펫을 사용하여 각 웰에 섭씨 37도의 신선한 미디엄 1밀리리터를 추가합니다.
폐쇄 회로에서 전기 생리학 설정을 준비합니다. 인터페이스 유형 챔버의 유량이 분당 2밀리리터로 설정되어 있고 탄수화물 밸브를 엽니다. 시스템의 수위를 확인하고 필터 용지 한 조각을 인터페이스 기록 챔버에 배치하여 초과 매체를 배출합니다.
프레임 아래에 렌즈 클리닝 용지를 놓고 중간 을 슬라이스에 공급하고 온도 컨트롤러, 증폭기 및 마이크로 조작기를 켭니다. 주사기를 사용하여 갓 준비된 인공 뇌척수액을 사용하여 유리 전극을 적재하십시오. 유리 전극을 수신 전극에 넣고 인터페이스 챔버의 온도가 섭씨 37도에서 안정될 때까지 기다립니다.
생물 안전 캐비닛에서 작업, 중간 의 방울60 밀리미터 접시에 삽입을 배치합니다. 날카로운 블레이드를 사용하여 삽입에서 슬라이스를 자르고 해마가 있는 인터페이스 챔버에 슬라이스를 오른쪽 하단으로 배치한 다음 수신 전극을 CA3 피라미드 세포 층에 넣고 연속 획득 프로토콜을 시작하고 30분 동안 슬라이스를 기록합니다. 프로피듐 요오드 섭취량 분석기를 수행하려면 생물 안전 캐비닛에서 작업하십시오.
우물에서 인서트를 들어 올리고 프로피듐 요오드를 중간 크기로 추가하여 음액 2개의 미세몰라를 최종 농도로 추가합니다. 삽입을 우물에 다시 넣기 전에 천천히 접시를 동요하고 조각 아래에 거품이 없다는 것을 주의하십시오. 모든 슬라이스가 처리되면 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.
슬라이스의 면역 염색을 위해, 프로피듐 요오드 인큐베이션의 끝에, 각 우물의 바닥에서 배지를 흡인하고 각 삽입물의 상단과 하단에 4 %의 파라 포름 알데히드의 1 밀리리터를 추가합니다. 실온에서 1시간 후, 슬라이스를 10분 동안 2회 세척하고, 세탁당 PBS 1밀리리터를 세척하고 소수성 펜을 사용하여 현미경 슬라이드에 두 개의 직사각형을 그립니다. 날카로운 블레이드를 사용하여 인서트에서 슬라이스를 자르고 한 조각을 각 사각형에 놓습니다.
각 슬라이스에 투과성 차단 용액을 추가하여 실온에서 3시간 배양할 수 있습니다. 인큐베이션의 끝에서, 하룻밤 4섭씨 잠복에 대한 각 슬라이스에 관심의 1 차적인 항체를 추가합니다. 다음 날 아침, PBS-Tween으로 슬라이스를 세척당 10분 동안 세 번 씻고 실온에서 4시간 동안 적절한 이차 항체로 슬라이스를 배양합니다.
그 후, 입증된 대로 슬라이스를 세척하고 각 슬라이스에 50 마이크로리터의 Hoechst 용액을 추가하여 실온에서 20분 간 배양할 수 있습니다. Hoechst 인큐베이션후, 슬라이스를 다시 씻고 50 마이크로리터의 장착 매체를 각 에 추가한 다음, 조각 위에 커버슬립을 놓고 매니큐어로 밀봉합니다. 실온에서 24시간 동안 슬라이드를 건조할 수 있게 한 후, 공초점 현미경으로 면역염색 및 오오드 섭취를 시각화합니다.
라인 피질-해마 organotypic 조각체는 체외에서 7 일 동안 혼합 된 간 및 ictal 와 같은 활동을 묘사합니다. 14일 체외에서 자발적인 활동은 ictal 방전이 특징이며, 이는 1분 이상 지속되는 ictal 이벤트로 체외에서 21일 동안 압도적인 ictal 활동으로 진화합니다. 신경 마커 NeuN에 대한 프로피듐 요오드 섭취량과 면역 조직 화학은 해마의 모든 영역에서 체외에서 14 일에서 상당히 증가되는 체외 슬라이스에서 7 일 동안 일부 뉴런 죽음을 밝혔다.
시험관 내 7일 동안, CD68 발현이 낮은 ramified microglia는 Iba1 양성 CD68 양성 반응성 마이크로글리아보다 더 풍부하다. 반면 14일 체외에서, 해마의 모든 영역에서 Iba1 양성 CD68 양성 아모에보이드 M1 마이크로글리아는 낮은 CD68 발현을 가진 마이크로글리아를 초과한다. 시험관 내 14일, 하이퍼 파급 효과를 가진 일부 Iba1 양성 CD68 양성 세포를 찾아내어 M2 항염증성 마이크로글리아 표현형의 가능성을 시사한다.
시험관 내 7일체에서 CD3의 발현은 거의 검출할 수 없는 반면, 14일 체외 슬라이스에서 비대성 신경교 세동산성 단백질 양성 CD3 양성 성상세포는 A1 성상세포의 점진적 활성화를 암시한다. 심신경 피질-해마 슬라이스를 극도의 주의를 기울여 준비하십시오. 슬라이스 하는 동안 슬라이스 무결성을 손상시킬 수 있기 때문에 해마 위의 과잉 조직을 제거해야 합니다.
구조적 적자는 슬라이스 생존가능성에 부정적인 영향을 미칩니다. 입증된 접근법 외에도, 서양 블롯 분석, 실시간 PCR 및 ELISA와 같은 과다한 분석법을 이 시스템에 적용하여 간질 발생과 관련된 특정 질문을 해결할 수 있습니다.
