이 작업은 NIH 보조금 P20 GM109098과 Praespero에서 Edwin Wan까지의 혁신 상 프로그램에 의해 지원되었습니다. 유세포 측정 실험은 NIH grants S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 및 P20 GM103434에 의해 지원되는 WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility에서 수행되었습니다.

수행 된 모든 프로토콜과 절차는 웨스트 버지니아 대학의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 마우스는 웨스트버지니아 대학교의 vivarium에서 특이적-병원체-비함유 조건 하에 수용되었다.
1. 용액의 제조
<ol><li>관류 완충액(인산완충식염수, PBS)을 준비한다. 마우스 당 약 두 개의 얼음처럼 차가운 PBS 분취량을 사용하십시오.</li>
	<li>폐 세포 배지 / FACS 버퍼를 준비하십시오. FACS 완충액은 1% 소 태아 혈청(FBS)으로 보충된 PBS를 함유한다. 폐 절제와 이동의 전체 과정을 위해 중간 정도를 차갑게 유지하십시오. 폐 샘플 당 약 8 mL를 준비하십시오. 실험 전에 신선한 배지 / FACS 버퍼를 준비하십시오.</li>
	<li>단일 세포 분리를 위해 해리 완충액을 준비하십시오. 완충액은 행크의 완충 염 용액(HBSS)에 1mg/mL 콜라게나제 D와 200μg/mL DNase I을 함유한다. 실험 전에 원액 (100 mg / mL 콜라게나제 D 및 10 mg / mL DNase I)에서 신선하게 준비하십시오. 폐 샘플 당 약 6 mL가 필요합니다. 사용하기 전에 버퍼가 실온에 도달하는지 확인하십시오.</li>
	<li>폐 조직 균질화를 위한 균질화 완충액을 준비한다. 완충액은 PBS 및 1x 프로테이나제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 함유한다(스톡=100x). 실험 전에 신선하게 준비하십시오. 전체 균질화 과정 동안 버퍼를 차갑게 유지하십시오. 대략 200 μL의 완충제는 폐의 단일 우로브를 균질화하기에 충분하다.</li>
</ol>2. 일시적인 중간 대뇌 동맥 폐색 (tMCAO)
참고: 중간 대뇌 동맥에 모노필라멘트 삽입을 통한 tMCAO에 대한 절차는 이전에10에 상세히 문서화되었다. 이들 실험에서, 25-30 g의 체중을 갖는 8-12주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하였다.
<ol><li>간단히 말해서, 수술 전에 마우스에 2 mg / kg 멜록시캄을 피하 투여하십시오. 마우스를 5% 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 깊이 마취시킨다. 발가락 핀치 방법을 사용하여 깊은 마취를 확인하십시오. 코 콘을 사용하여 수술 중에 1-2 % 이소 플루란으로 마취를 유지하십시오. 마우스 아래에 따뜻한 담요를 놓아 시술 내내 체온을 36.5 - 38 °C로 유지하십시오. 모든 수술 도구는 수술 하루 전에 오토클레이브 살균해야합니다.</li>
	<li>면도하고 70 % 에탄올을 사용하여 복부 목의 피부를 준비한 다음 클로르헥시딘 스크럽을 준비하십시오. 첫 번째 절개를하기 전에 절개 부위에 2mg / kg bupivacaine을 피하 투여하십시오. 건조를 방지하기 위해 눈을 가리기 위해 눈 연고를 사용하십시오. 중간 선 목 절개를하십시오. 기관 주위의 연조직을 부드럽게 당겨 내립니다.</li>
	<li>왼쪽 일반적인 경동맥과 외부 경동맥을 확인하십시오.</li>
	<li>혈액의 흐름을 막기 위해 일반적인 경동맥에 임시 봉합사 (크기 6/0)를 적용하십시오. 외부 경동맥을 절개하십시오.</li>
	<li>실리콘 고무 코팅 모노필라멘트(크기 6-0)를 외부 경동맥에 삽입한 다음, 모노필라멘트를 중간 대뇌 동맥으로 전진시킨다. 모노 필라멘트를 중간 대뇌 동맥에 60 분 동안 두십시오 (폐색).</li>
	<li>레이저 도플러 유량계를 사용하여 혈류 속도를 모니터링합니다. 중간 대뇌 동맥으로의 유속의 감소가 > 80%는 성공적인 폐색을 나타낸다.</li>
	<li>60분의 폐색 후, 모노필라멘트를 제거하여 재관류가 일어나도록 한다. 절개를 닫습니다.</li>
	<li>가짜 조작된 마우스에서, 모노필라멘트의 삽입 없이 단계 2.1-2.6을 수행한다. 이 생쥐에서 혈류 속도는 전체 절차 중에 일정하게 유지되어야합니다.</li>
	<li>매일 마우스를 모니터하고 표준 채점 기준11을 사용하여 신경 학적 결핍을 측정하십시오. 0 – 신경 학적 결손 없음; 1 – 꼬리에 의해 들어 올릴 때 반대쪽 앞발을 철회; 2- 꼬리에 의해 들어 올릴 때 대측으로 원; 3- 걷는 동안 대측으로 떨어지는 것; 4 – 자발적으로 걷지 않거나 혼수 상태; 5 - 죽었어.</li>
	<li>수술 후 3 일 동안 24 시간마다 정상 식염수와 진통제 (meloxicam, 2 mg / kg)를 피하 주사하십시오.</li>
	<li>하류 분석을 위해 tMCAO 후 24 및 72 h 후에 폐를 분리한다.</li>
</ol>3. 폐 조직 수확
<ol><li>100 mg / kg의 케타민과 10 mg / kg의 자일라진 주사를 복강 내 (i.p.) 주사하여 마우스를 깊이 마취하십시오. 발가락 핀치 방법을 사용하여 깊은 마취를 확인하십시오.</li>
	<li>전신 심질 관류(12)를 수행하기 위해, 마우스를 수술 플랫폼에 고정하고 70% 에탄올로 모피를 적셔 체강 내로의 모피 분포를 감소시킨다. 미세한 해부 가위를 사용하여 꼬리 복부를 가로 절개 한 다음 복막의 중간 선 절개를 만들어 횡격막을 관통하기 전에 흉강에서 멈 춥니 다.<ol><li>근육을 통해 자르지 말고 복강으로 숨어 복부를 절개하지 마십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>횡격막에 구멍을 뚫기 전에 흉강에 도달하자마자 절개를 중단하십시오. 관류 품질 또는 세포 회복을 저해 할 수있는 심장과 폐를 손상시키지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>미세한 해부 가위를 사용하여 횡격막을 관통하기 전에 흉강에서 멈추는 복막의 중간 선 절개를 만듭니다.</li>
	<li>포셉을 사용하여 흉골의 원위 끝으로 마우스를 잡고 횡격막을 절단하면서 위쪽으로 들어 올려 심장, 폐 또는 혈관 조직을 손상시키지 않도록하십시오. 장기가 보이면 흉곽을 통해 절개를하고 흉곽 케이스를 분리하고 핀으로 고정하여 심장과 폐가 완전히 노출되도록하십시오.</li>
	<li>조심스럽게 대동맥 아치 근처의 오른쪽 심방에서 작은 절개를하십시오. 이것은 관류를위한 유출 역할을 할 것입니다.</li>
	<li>그 직후, 차가운 PBS 10 mL로 채워진 주사기에 부착된 25 G x 5/8 바늘을 좌심실의 원위 우량한 표면 내로 부드럽게 삽입한다. 심실 중격을 통해 우심실에 삽입하지 않도록주의하십시오. 바늘은 좌심실에 간신히 삽입해야합니다. 참고 : 심실 중격이 뚫리면 마우스의 코에서 액체가 흘러 나옵니다. 이것은 관류 품질을 감소시키고 세포 손실을 초래할 것이다.</li>
	<li>원하는 경우, 관류 동안 좌심실 내의 제자리에 바늘을 단단히 고정시키기 위해 클램프를 사용할 수 있다.</li>
	<li>차가운 PBS 10 mL를 꾸준히 부드럽게 밀어 넣는다. 마우스 조직은 유체가 오른쪽 심방에서 빠져 나올 때 혈액을 관류하고 제거해야합니다.<ol><li>충분한 혈액 클리어런스가 발생할 때까지 PBS 10 mL의 두 번째 분취량을 밀어 넣습니다. 간은 밝은 갈색으로 보이고 폐는 붉은 분홍색에서 대부분 흰색으로 변합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>포셉과 미세 해부 가위를 사용하여 심장, 기관, 식도, 흉선, 결합 조직, 림프절 및 대형 기관지를 포함한 모든 주변 조직을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>개별 폐 엽을 분리하고 엽을 차가운 폐 세포 배지의 1-2 mL 분취량을 함유하는 얼음 위에 페트리 접시에 넣는다.</li>
</ol>4. 비드 호모게나이저를 이용한 멀티플렉스 비드 어레이용 폐 조직의 균질화
<ol><li>멸균 2.3mm 지르코니아/실리카 비드 3개가 들어 있는 2mL 원뿔형 스크류 캡 튜브를 미리 식히십시오. 200 μL의 차가운 균질화 완충액을 튜브에 첨가한다.</li>
	<li>엽을 계량하고, 로브를 비드 및 균질화 완충액을 함유하는 미리 냉각된 원뿔형 튜브로 옮긴다. 참고: 200 μL의 완충액에서 균질화된 대략 50-100 mg의 조직은 샘플에서 사이토카인 및 케모카인 발현을 검출하기에 충분할 것이다.<ol><li>비드계 호모게나이저(표 표 참조)를 사용하여 로브를 4,000 rpm에서 2분 동안 균질화한다.</li>
		<li>조직이 완전히 균질화되었는지 확인하십시오. 필요한 경우 시간을 늘리십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>균질화 후, 튜브를 3분 동안 15,870 x g 에서 미리 냉각된 (4°C) 마이크로원심분리기에서 원심분리한다.</li>
	<li>상청액을 미리 냉각된 1.5 mL 마이크로튜브로 옮긴다.</li>
	<li>샘플을 즉시 사용하기 위해 얼음 위에 직접 놓거나 나중에 사용하기 위해 샘플을 -80°C에 보관하십시오. 여러 번의 동결-해동 주기를 피하십시오.</li>
</ol>5. 폐 조직 해리 및 단일 세포 분리
<ol><li>해리 완충액의 희석을 피하기 위해 나머지 폐 엽의 폐 세포 배지를 붓는다. 그런 다음, 해리 완충액 1mL를 함유하는 25G 및 5/8 바늘이 있는 1 mL 주사기를 폐 조직에 조심스럽게 삽입한다.</li>
	<li>해리 버퍼의 작은 분획 (약 1/4~ 1/5th)을 각 폐 엽에 주입하고 부드럽게 팽창시킵니다. 참고 : 대부분의 버퍼는 엽이 절제됨에 따라 팽창 한 직후에 급히 빠져 나옵니다.</li>
	<li>해리 버퍼 1-2x의 주입을 반복하십시오.</li>
	<li>폐 엽을 실온에서 2분 동안 해리 완충액으로 인큐베이션한다.</li>
	<li>미세한 해부 가위를 사용하여 폐 엽을 작은 조각으로 잘게 다듬습니다.</li>
	<li>다진 폐 조각을 해리 완충액과 함께 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.  추가 해리 완충액을 총 6 mL로 보충하십시오. 1 분 동안 격렬하게 소용돌이.</li>
	<li>샘플을 37°C에서 45분 동안 인큐베이션한다. 소용돌이는 7-8 분마다 격렬하게 소용돌이친다.</li>
	<li>45분 인큐베이션 후, 최적의 결과를 위해 샘플을 1분 동안 격렬하게 와류시킨다.</li>
	<li>샘플을 100 μm 세포 스트레이너를 통과시켜 잔존, 바람직하지 않은 결합 및 간질성 조직을 제거함으로써 샘플을 더욱 해리시킨다.</li>
	<li>샘플을 380 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다.</li>
	<li>차가운 폐 세포 배지 5 mL를 샘플에 첨가한다. 부드러운 볼텍싱에 의해 세포 펠릿을 재현탁시킨다.</li>
	<li>샘플을 380 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다.</li>
	<li>차가운 폐 세포 배지 1 mL를 첨가하십시오. 부드러운 볼텍싱에 의해 세포 펠릿을 재현탁시킨다.</li>
	<li>100 μm 세포 스트레이너를 통과시키고, 세포를 계수한다.</li>
</ol>6. 폐 면역 세포 틈새 시장에 대한 유세포 분석
<ol><li>시드 1-2 x 106 세포 / 항체를 96 웰 둥근 바닥 플레이트 (총 3 세트)에 설정합니다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포 펠릿을 고정가능한 생/사 얼룩을 함유하는 50 μL의 차가운 PBS에 재현탁시킨다. 제조업체의 지침에 따라 얼룩을 준비하십시오.</li>
	<li>세포를 빛으로부터 보호된 20분 동안 4°C에서 인큐베이션한다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포 펠렛을 5 μg/mL의 항-마우스 CD16/32 항체를 함유하는 25μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 4°C에서 10-15분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>표 1에 열거된 항체 조합을 함유하는 25 μL의 차가운 FACS 완충액을 세포에 첨가한다. 부드러운 피펫팅으로 혼합하십시오. 참고: 항체 염색을 위한 FACS 완충액의 총 부피는 50 μL이다. 따라서, 항체의 마스터 믹스를 25 μL로 제조할 때, 항체의 농도는 최종 농도의 두 배가 되어야 한다.</li>
	<li>세포를 빛으로부터 보호된 20분 동안 4°C에서 인큐베이션한다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포를 100 μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포를 100 μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 150 μL의 추가 FAC 완충액을 함유하는 폴리스티렌 둥근바닥 5 mL FACS 튜브로 옮긴다. 유세포 분석기를 사용하여 샘플을 즉시 분석하십시오. 참고: 다음 단계를 사용한 셀 고정을 통해 나중에 샘플을 분석할 수 있습니다.</li>
	<li>단계 6.7.에 이어서, 샘플을 PBS 중의 1% 파라포름알데히드의 100 μL로 재현탁시켰다.</li>
	<li>샘플을 빛으로부터 보호된 15분 동안 4°C에서 인큐베이션한다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포를 100 μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포를 100 μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 세포를 4°C에서 저장하고, 빛으로부터 보호한다. 72 h 이내에 샘플을 분석하십시오.</li>
</ol>7. 사이토카인 및 케모카인 검출을 위한 멀티플렉스 비드 어레이
참고: 상업적으로 입수가능한 전염증성 케모카인 및 염증 멀티플렉스 패널( 표 참조)은 제조자 프로토콜에 따라 tMCAO 유도에 따라 폐에서 케모카인 및 사이토카인의 발현을 확인하기 위해 사용되었으며, 이는도 13에 상세히 기술되어 있다.
<ol><li>간단히 말해서, 분석물을 얼음 상에서 해동시키면 조직 균질화 후 -80°C에서 보관하였다. 샘플을 사용하기 전에 4°C에서 2분 동안 590 x g 에서 원심분리하여 임의의 잔류 조직을 제거하였다.</li>
	<li>10ng/mL의 알려진 농도에 있는 표준 칵테일(C7)을 7개의 표준(C1-6)으로 연속적으로 희석하여 표준 곡선을 생성하고, 마지막 표준은 분석 버퍼 단독(C0)입니다.</li>
	<li>모든 시약을 실온으로 가온한 후, 각 표준 25μL와 분석 완충액 25μL를 V 하부 96웰 플레이트에 첨가한다.</li>
	<li>각 샘플 웰에 25 μL의 폐 균질물 (분석물) 및 25 μL의 분석 완충액을 V 하부 96 웰 플레이트에 첨가한다.</li>
	<li>예비코팅된 비드를 격렬하게 볼텍스한 다음, 25μL의 예비코팅된 비드를 각각의 표준 및 샘플 웰에 첨가한다.</li>
	<li>플레이트를 밀봉하고 호일로 덮어 빛으로부터 보호하십시오. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 110 rpm으로 흔들었다.</li>
	<li>230 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 1x에서 세척 완충액 200μL를 첨가한다(원액은 20x, 물로 1x로 희석). 1분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>230 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 표준 및 샘플을 25 μL 검출 항체로 재현탁시킨다.</li>
	<li>빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 밀봉하고 덮으십시오. 플레이트를 실온에서 1 h 동안 110 rpm으로 진탕한다.</li>
	<li>25 μL의 스트렙타비딘-피코에리트린(SA-PE)을 각 표준 및 샘플 웰에 첨가한다.</li>
	<li>빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 밀봉하고 덮으십시오. 실온에서 30분 동안 110rpm으로 흔들어 주십시오.</li>
	<li>플레이트를 230 x g 에서 5분 동안 회전시킨다. 표준 및 샘플을 1x 세척 완충액에 재현탁한다.</li>
	<li>웰 라벨링된 폴리스티렌 둥근바닥 5 mL FACS 튜브로 150 μL의 1x 세척 완충액을 추가로 함유한다.</li>
	<li>유세포 분석기를 사용하여 표준 및 샘플에 대한 PE 신호 형광 강도를 결정한다.</li>
	<li>미리 결정된 농도에 대해 PE의 평균 형광 강도(MFI)를 사용하여 각 케모카인 및 사이토카인에 대한 표준 곡선을 구성한다.</li>
	<li>각 샘플로부터의 표준 곡선 및 MFI를 사용하여 각 케모카인 및 사이토카인의 농도를 결정한다. 멀티플렉스 패널은 각 분석물의 농도를 결정하는 데 사용할 수 있는 데이터 분석 소프트웨어를 제공합니다. apical/superior lobe의 무게는 조직의 밀리그램 당 사이토카인 또는 케모카인의 농도를 결정하는 데 사용됩니다.</li>
</ol>

<ol>
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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+and+Monocyte-Derived+Antigen-Presenting+Cells+Have+Distinct+Gene+Signatures+in+Experimental+Model+of+Multiple+Sclerosis.">Monocytes and Monocyte-Derived Antigen-Presenting Cells Have Distinct Gene Signatures in Experimental Model of Multiple Sclerosis.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2779 (2019).</li><li>Zhai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+to+prepare+a+single+cell+suspension+of+isolated+quiescent+human+hepatic+stellate+cells.">A novel technique to prepare a single cell suspension of isolated quiescent human hepatic stellate cells.</a> Science Reports. 9 (1), 12757 (2019).</li><li>Platzer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-bound+IgE+functions+to+restrain+allergic+inflammation+at+mucosal+sites.">Dendritic cell-bound IgE functions to restrain allergic inflammation at mucosal sites.</a> Mucosal Immunology. 8 (3), 516-532 (2015).</li><li>Shinoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy1+IL-7++lymphatic+endothelial+cells+in+iBALT+provide+a+survival+niche+for+memory+T-helper+cells+in+allergic+airway+inflammation.">Thy1+IL-7+ lymphatic endothelial cells in iBALT provide a survival niche for memory T-helper cells in allergic airway inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 113 (20), 2842-2851 (2016).</li><li>Nakahashi-Oda, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+epithelial+cells+control+the+abundance+of+Treg+cells+at+barrier+surfaces.">Apoptotic epithelial cells control the abundance of Treg cells at barrier surfaces.</a> Nature Immunology. 17 (4), 441-450 (2016).</li><li>Barrott, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+synovial+sarcoma+metastasis+in+the+mouse:+PI3'-lipid+signaling+and+inflammation.">Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).</li><li>Bout&#233;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C3HeB/FeJ+mouse+model+recapitulates+the+hallmark+of+bovine+tuberculosis+lung+lesions+following+Mycobacterium+bovis+aerogenous+infection.">The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection.</a> Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).</li><li>Bal, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1&#946;,+IL-4+and+IL-12+control+the+fate+of+group+2+innate+lymphoid+cells+in+human+airway+inflammation+in+the+lungs.">IL-1&#946;, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs.</a> Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).</li><li>Nakasone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+gamma/delta+T+cells+in+the+lungs+and+their+roles+in+neutrophil-mediated+host+defense+against+pneumococcal+infection.">Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection.</a> Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 기술된 프로토콜은 폐 면역 세포 유형의 확인 및 동일한 마우스에서 케모카인 또는 사이토카인의 발현을 허용한다. 조직병리학 연구가 바람직한 경우, 단일 세포 분리 단계로 진행하기 전에 개별 엽을 제거하고 그 목적을 위해 고정시킬 수 있다. 이 방법의 한 가지 한계는 면역 세포 조성의 변화와 케모카인 및/또는 사이토카인의 발현이 폐의 상이한 엽 사이에 불평등하게 분포될 것으로 ?...

폐는 외부 환경에 노출되는 장벽 기관이므로 병원균 및 알레르겐1과 같은 면역 학적 도전을 끊임없이 받고 있습니다. 폐 거주 면역 세포의 활성화와 주변부에서 면역 세포의 침윤은 폐 환경에서 병원균을 제거해야합니다. 또한, 폐에 거주하는 면역 세포는 공생 박테리아에 대한 내성을 유지하며, 이는 이들 세포가 병원균 제거 및 항상성 유지에 중요한 역할을한다는 것을 암시합니다1. 폐포 및 간질성 대식세포는 패턴 인식 수용체를 통해 병원체를 감지하고 식균작용에 의해 이러한 병원체를 제거하는 폐 상주 감시자 면역 세포 중하나입니다 2. 폐-상주 수지상 세포는 항원 제시3을 통해 선천적 및 적응성 면역 반응을 연결한다. 또한, 활성화된 국소 선천적 면역 세포는 염증 반응을 증폭시키고 단핵구, 호중구 및 림프구와 같은 면역 세포의 폐로의 침윤을 자극하는 사이토카인 및 케모카인을 생성한다1. 허혈성 뇌졸중은 전신 면역을 변형시키고 폐 감염에 대한 감수성을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 그러나 허혈성 뇌졸중 후 폐 구획을 평가 한 연구는 거의 없지만 일부 연구는 염증 상태 4,5,6,7,8,9 동안이를 조사했습니다. 본원에 기재된 방법의 목표는 폐 병리, 면역 세포 조성물, 폐에서의 사이토카인 및 케모카인 발현의 수준을 동시에 결정하여 폐 구획에 대한 변경을 평가하고 허혈성 발작 후 폐 면역 반응에 대한 잠재적 변화를 평가하는 것이다.
여기에 기재된 것은 13가지 유형의 면역 세포를 확인하기 위해 마우스의 폐로부터 단일 세포 현탁액을 수득하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 자동화된 조직 해리제가 필요 없이 콜라게나제 D를 사용한 조직 소화를 기반으로 합니다. 추가적으로, 우리는 유세포 분석기 기반 멀티플렉스 비드 어레이를 사용하여 13개의 상이한 사이토카인 또는 케모카인의 발현 수준을 결정하는데 사용될 수 있는 조직 균질물을 제조하기 위한 프로토콜을 개발하였다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중이 폐 면역에 미치는 영향을 조사하는 데 성공적으로 사용되었으며 다른 질병 모델에서도 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:932px;" width="931">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">B220-APC, clone RA3-6B2</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">103212</td>
			<td style="width:412px;">1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Beadbug 3 position bead homogenizer</td>
			<td style="width:129px;">Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:101px;">D1030</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CCR2-BV421, clone SA203G11</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">150605</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD103-BV421, clone 2E7</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">121422</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD11b-PE/Cy7, clone M1/70</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">101216</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD11c-PE/Cy7, clone N418</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">117318</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">117328</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD4-BV421, clone GK1.5</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">100443</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD45-FITC, clone 30-F11</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">103108</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD64-APC, clone X54-5/7.1</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">139306</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD8-PE, clone 53-6.7</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">100708</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11088882001</td>
			<td>Component in the dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Conical screw cap tube</td>
			<td style="width:129px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">02-681-344</td>
			<td>Tube for tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">DNase I</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Component in the dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Fc block CD16/32 antibody</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">genlteMACS dissociator</td>
			<td style="width:129px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">gentleMACS C tubes</td>
			<td style="width:129px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:101px;">130-093-237</td>
			<td>Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial</td>
			<td style="width:129px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">78442</td>
			<td>Component in the homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Laser doppler monitor</td>
			<td style="width:129px;">Moor</td>
			<td style="width:101px;">MOORVMS-LDF</td>
			<td>Blood flow monitoring during tMCAO</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">LEGENDplex proinflammatory chemokine panel</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">740451</td>
			<td>Multiplex bead array</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">LIVE/DEAD fixable near-IR stain</td>
			<td style="width:129px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">L34976</td>
			<td>Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Ly6C-PE, clone HK1.4</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">128008</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Ly6G-BV510, clone 1A8</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">127633</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">MCAO suture L56 reusable 6-0 medium</td>
			<td style="width:129px;">Doccol</td>
			<td style="width:101px;">602356PK10Re</td>
			<td>tMCAO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">MHC II-BV510, clone M5/114.15.2</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">107636</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">108728</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Siglec F-PE, clone E50-2440</td>
			<td style="width:129px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:101px;">552126</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Silk suture thread, size 6/0</td>
			<td style="width:129px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:101px;">18020-60</td>
			<td>tMCAO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">SomnoSuite anesthesia system</td>
			<td style="width:129px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:101px;">SS-01</td>
			<td>Mouse anaesthetization for tMCAO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">TCRb-BV510, clone H57-897</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">109234</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Zirconia/silica beads, 2.3 mm</td>
			<td style="width:129px;">Biospec</td>
			<td style="width:101px;">11079125z</td>
			<td>Beads for tissue homogenization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of immune cells and proinflammatory mediators in the pulmonary environment

면역 세포 확장, 활성화 및 여러 사이토카인 및 케모카인의 발현에 의해 조절되는 폐로의 밀매는 심각한 뇌 손상에 의해 변경될 수 있다. 이것은 폐렴이 허혈성 뇌졸중으로 고통받는 환자의 주요 사망 원인이라는 사실에 의해 입증됩니다. 이 프로토콜의 목표는 폐포 대식세포, 간질성 대식세포, CD103+ 또는 CD11b+ 수지상 세포(DCs), 혈장 세포질 DCs, 호산구, 단핵구/단핵구 유래 세포, 호중구, 림프구 유래 T 및 B 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함한 마우스의 폐에서 13가지 유형의 면역 세포를 확인하기 위해 다색 유세포 분석의 사용을 설명하는 것이며, 일시적인 중간 대뇌 동맥 폐색에 의한 허혈성 뇌졸중 유도에 이른다. 더욱이, 우리는 비드 균질화 방법을 사용하여 폐 균질액의 제조를 기술하고, 유세포 분석과 결합된 멀티플렉스 비드 어레이에 의해 동시에 13개의 상이한 사이토카인 또는 케모카인의 발현 수준을 결정한다. 이 프로토콜은 또한 감염성 폐 질환 또는 알레르기성 질환과 같은 다른 질병 설정에서 폐 면역 반응을 조사하는데 사용될 수 있다.

우리는 최근에 마우스에서 허혈성 뇌졸중 유도가 폐11의 면역 세포 조성을 변화시킨다고보고했다. 구체적으로, 일과성 뇌 허혈은 폐포 대식세포, 호중구 및 CD11b+ DC의 백분율을 증가시켰고, 폐 구획에서 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포, NK 세포 및 호산구의 백분율을 감소시켰다. 또한, 세포 변화는 폐에서 여러 케모카인의 상당히 감소된 수준에 상응했다. 여기에 기재된 것은 폐 구?...

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Characterization of Immune Cells and Proinflammatory Mediators in the Pulmonary Environment

이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중의 뮤린 모델인 일시적 중간 대뇌동맥 폐색 후 폐 환경에서 면역 세포 조성, 사이토카인 프로파일, 및 케모카인 프로파일의 변화를 확인하기 위한 유세포 분석기의 사용을 기술한다.

폐 환경에서 면역 세포 및 전염증성 중재자의 특성화

Immune cell expansion, activation, and trafficking to the lungs, which are controlled by the expression of multiple cytokines and chemokines, may be ...

characterization-immune-cells-proinflammatory-mediators-pulmonary

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.2K 조회수.  West Virginia University. 이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중의 뮤린 모델인 일시적 중간 대뇌동맥 폐색 후 폐 환경에서 면역 세포 조성, 사이토카인 프로파일, 및 케모카인 프로파일의 변화를 확인하기 위한 유세포 분석기의 사용을 기술한다.

비디오: Characterization of Immune Cells and Proinflammatory Mediators in the Pulmonary Environment

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

연구

면역학 및 감염병학

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is a common modifier of heart and lung function, by elaborating cellular infiltration, production of cytokines and growth factors, and by initiating remodeling processes 1.
Compared to the left ventricle, the right ventricle is a low-pressure pump that operates in a relatively narrow zone of pressure changes. Increased pulmonary artery pressures are associated with increased pressure in the lung vascular bed and pulmonary hypertension 2. Pulmonary hypertension is often associated with inflammatory lung diseases, for example chronic obstructive pulmonary disease, or autoimmune diseases 3. Because pulmonary hypertension confers a bad prognosis for quality of life and life expectancy, much research is directed towards understanding the mechanisms that might be targets for pharmaceutical intervention 4. The main challenge for the development of effective management tools for pulmonary hypertension remains the complexity of the simultaneous understanding of molecular and cellular changes in the right heart, the lungs and the immune system.
Here, we present a procedural workflow for the rapid and precise measurement of pressure changes in the right heart of mice and the simultaneous harvest of samples from heart, lungs and immune tissues. The method is based on the direct catheterization of the right ventricle via the jugular vein in close-chested mice, first developed in the late 1990s as surrogate measure of pressures in the pulmonary artery5-13. The organized team-approach facilitates a very rapid right heart catheterization technique. This makes it possible to perform the measurements in mice that spontaneously breathe room air. The organization of the work-flow in distinct work-areas reduces time delay and opens the possibility to simultaneously perform physiology experiments and harvest immune, heart and lung tissues.
The procedural workflow outlined here can be adapted for a wide variety of laboratory settings and study designs, from small, targeted experiments, to large drug screening assays. The simultaneous acquisition of cardiac physiology data that can be expanded to include echocardiography5,14-17 and harvest of heart, lung and immune tissues reduces the number of animals needed to obtain data that move the scientific knowledge basis forward. The procedural workflow presented here also provides an ideal basis for gaining knowledge of the networks that link immune, lung and heart function. The same principles outlined here can be adapted to study other or additional organs as needed.

A specific and rapid protocol to simultaneously investigate right heart function, lung inflammation, and the immune response is described as a learning tool. Video and figures describe physiology and microdissection techniques in an organized team-approach that is adaptable to be used for small to large sized studies.

폐 마우스의 면역 조직 샘플의 수확과 함께 오른쪽 심실 수축기 압력 측정

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

지방 조직 면역 세포의 분리

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

를 사용하여 폐렴 구균 식민지에서 생균제의 효과를 조사<em&gt; 체외</em&gt; 준수의 분석

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

항 종양 특성을 가진 분리 및 호중구의 특성

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

절연, 특성화 및 잇몸 면역 세포 네트워크의 기능 시험

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...