Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss P20 GM109098 und das Innovation Award Program von Praespero an Edwin Wan unterstützt. Durchflusszytometrie-Experimente wurden in der WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility durchgeführt, die durch die NIH-Zuschüsse S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 und P20 GM103434 unterstützt wird.

Alle durchgeführten Protokolle und Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der West Virginia University genehmigt. Die Mäuse wurden unter spezifisch-pathogenfreien Bedingungen im Vivarium der West Virginia University untergebracht.
1. Vorbereitung von Lösungen
<ol><li>Perfusionspuffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS) vorbereiten. Verwenden Sie ungefähr zwei 10-ml-Aliquots eiskaltes PBS pro Maus.</li>
	<li>Lungenzellenmedium/FACS-Puffer vorbereiten. FACS-Puffer enthält PBS, ergänzt mit 1% fetalem Rinderserum (FBS). Halten Sie das Medium für den gesamten Prozess der Lungenexzision und -übertragung kalt. Bereiten Sie ungefähr 8 ml pro Lungenprobe vor. Bereiten Sie vor den Experimenten einen frischen Medium/FACS-Puffer vor.</li>
	<li>Bereiten Sie den Dissoziationspuffer für die Einzelzellisolierung vor. Der Puffer enthält 1 mg/ml Kollagenase D und 200 μg/ml DNase I in Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS). Vor den Versuchen frisch aus der Stammlösung (100 mg/ml Kollagenase D und 10 mg/ml DNase I) zubereiten. Pro Lungenprobe werden ca. 6 ml benötigt. Stellen Sie sicher, dass der Puffer vor der Verwendung Raumtemperatur erreicht.</li>
	<li>Bereiten Sie den Homogenisierungspuffer für die Homogenisierung des Lungengewebes vor. Puffer enthält PBS und 1x Proteinase und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (Bestand = 100x). Vor den Experimenten frisch zubereiten. Halten Sie den Puffer während des gesamten Homogenisierungsprozesses kalt. Etwa 200 μL des Puffers reichen aus, um einen einzelnen rechten Lungenlappen zu homogenisieren.</li>
</ol>2. Transienter mittlerer Hirnarterienverschluss (tMCAO)
HINWEIS: Verfahren für tMCAO durch Monofilament-Insertion in die mittlere Hirnarterie wurden zuvor ausführlich dokumentiert10. In diesen Experimenten wurden 8- bis 12 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 25-30 g verwendet.
<ol><li>Kurz gesagt, verabreichen Sie den Mäusen vor der Operation subkutan 2 mg/kg Meloxicam. Betäuben Sie die Mäuse in einer Induktionskammer mit 5% Isofluran tief. Bestätigen Sie die Tiefenanästhesie mit der Zehenklemmmethode. Halten Sie die Anästhesie mit 1-2% Isofluran während der Operation mit einem Nasenkegel aufrecht. Halten Sie die Körpertemperatur während des gesamten Eingriffs bei 36,5 - 38 °C, indem Sie eine warme Decke unter die Mäuse legen. Alle chirurgischen Instrumente sollten einen Tag vor der Operation autoklavisch sterilisiert werden.</li>
	<li>Rasieren und bereiten Sie die Haut am Bauchhals mit 70% Ethanol vor, gefolgt von einem Chlorhexidin-Peeling. Subkutan 2 mg/kg Bupivacain über den Inzisionsbereich verabreichen, bevor der erste Schnitt gemacht wird. Verwenden Sie Augensalbe, um die Augen zu bedecken, um Trockenheit zu verhindern. Machen Sie einen Mittellinien-Halsschnitt. Ziehen Sie die Weichteile um die Luftröhre vorsichtig beiseite.</li>
	<li>Identifizieren Sie die linke gemeinsame Halsschlagader und die äußere Halsschlagader.</li>
	<li>Tragen Sie eine provisorische Naht (Größe 6/0) auf die gemeinsame Halsschlagader auf, um den Blutfluss einzudämmen. Machen Sie einen Schnitt in der äußeren Halsschlagader.</li>
	<li>Führen Sie ein silikongummibeschichtetes Monofilament (Größe 6-0) in die äußere Halsschlagader ein und schieben Sie das Monofilament dann zur mittleren Hirnarterie. Lassen Sie das Monofilament in der mittleren Hirnarterie für 60 min (Okklusion).</li>
	<li>Überwachen Sie die Blutflussrate mit der Laser-Doppler-Durchflussmessung. Eine Verringerung der Flussrate zur mittleren Hirnarterie um > 80% deutet auf einen erfolgreichen Verschluss hin.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der 60-minütigen Okklusion das Monofilament, damit die Reperfusion stattfinden kann. Schließen Sie den Einschnitt.</li>
	<li>Führen Sie bei scheinbetriebenen Mäusen die Schritte 2.1-2.6 ohne Einführen des Monofilaments durch. Bei diesen Mäusen sollte die Durchblutungsrate während des gesamten Verfahrens konstant bleiben.</li>
	<li>Überwachen Sie die Mäuse täglich und messen Sie die neurologischen Defizite anhand des Standard-Scoring-Kriteriums11. 0 – kein neurologisches Defizit; 1 – zieht kontralaterale Vorderpfote zurück, wenn sie vom Schwanz angehoben wird; 2- Kreise zum kontralateralen, wenn sie vom Schwanz angehoben werden; 3- beim Gehen auf das kontralaterale fallen; 4 – geht nicht spontan oder ist komatös; 5 – tot.</li>
	<li>Geben Sie subkutane Injektionen von normaler Kochsalzlösung und Analgetikum (Meloxicam, 2 mg / kg) alle 24 Stunden für 3 Tage nach der Operation.</li>
	<li>Isolieren Sie die Lungen 24 und 72 h nach tMCAO für die nachgeschaltete Analyse.</li>
</ol>3. Entnahme des Lungengewebes
<ol><li>Betäuben Sie die Maus tief durch intraperitoneale (i.p.) Injektion von 100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin. Bestätigen Sie die Tiefenanästhesie mit der Zehenklemmmethode.</li>
	<li>Um die Ganzkörper-Transkardperfusion12 durchzuführen, heften Sie die Maus an die chirurgische Plattform und das nasse Fell mit 70% Ethanol, um die Fellverteilung in die Körperhöhle zu reduzieren. Verwenden Sie eine feine Dissektionsschere, um einen Querschnitt im Schwanzabdomen und dann einen Mittellinienschnitt des Peritoneums zu machen, der an der Brusthöhle stoppt, bevor das Zwerchfell durchbohrt wird.<ol><li>Schneiden Sie nicht durch den Muskel / verstecken Sie sich in die Peritonealhöhle und setzen Sie den Schnitt nicht über den Bauch hinaus fort.</li>
	</ol></li>
	<li>Stoppen Sie den Einschnitt, sobald die Brusthöhle erreicht ist, bevor Sie das Zwerchfell punktieren. Achten Sie darauf, Herz und Lunge nicht zu schädigen, was die Perfusionsqualität oder die Zellerholung beeinträchtigen kann</li>
	<li>Mit einer feinen Dissektionsschere machen Sie einen Mittellinienschnitt des Peritoneums, der an der Brusthöhle stoppt, bevor das Zwerchfell durchbohrt wird.</li>
	<li>Fassen Sie die Maus am distalen Ende des Brustbeins mit einer Pinzette und heben Sie sie nach oben, während Sie das Zwerchfell durchschneiden, um sicherzustellen, dass Herz, Lunge oder Gefäßsystem nicht beschädigt werden. Sobald die Organe sichtbar sind, machen Sie einen Schnitt durch den Brustkorb und trennen und stecken Sie das Rippengehäuse zurück, so dass Herz und Lunge vollständig freigelegt sind.</li>
	<li>Machen Sie vorsichtig einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof in der Nähe des Aortenbogens. Dies dient als Abfluss für die Perfusion.</li>
	<li>Führen Sie unmittelbar danach vorsichtig eine 25 G x 5/8-Nadel ein, die an einer mit 10 ml kaltem PBS gefüllten Spritze befestigt ist, in die distale obere Oberfläche des linken Ventrikels. Achten Sie darauf, nicht durch die Ventrikelscheidewand in den rechten Ventrikel einzuführen. Die Nadel sollte kaum in den linken Ventrikel eingeführt werden. HINWEIS: Wenn das Ventrikelseptum durchstochen wird, strömt Flüssigkeit aus der Nase der Maus. Dies verringert die Perfusionsqualität und führt zu Zellverlust.</li>
	<li>Falls gewünscht, kann eine Klemme verwendet werden, um die Nadel während der Perfusion sicher im linken Ventrikel zu halten.</li>
	<li>Drücken Sie gleichmäßig, aber sanft 10 ml kaltes PBS in das Herz. Mausgewebe sollte beginnen zu durchbluten und das Blut zu entfernen, wenn Flüssigkeit aus dem rechten Vorhof austritt.<ol><li>Drücken Sie ein zweites Aliquot von 10 ml PBS, bis eine ausreichende Blutclearance eingetreten ist. Die Leber wird ein hellbraunes Aussehen haben und die Lungen werden von einem rötlichen Rosa zu meist weiß übergehen.</li>
	</ol></li>
	<li>Entfernen Sie mit einer Pinzette und einer feinen Dissektionsschere vorsichtig alle umliegenden Gewebe, einschließlich Herz, Luftröhre, Speiseröhre, Thymus, Bindegewebe, Lymphknoten und große Bronchiale.</li>
	<li>Trennen Sie einzelne Lungenlappen und legen Sie die Lappen in eine Petrischale auf Eis, die ein Aliquot von 1-2 ml kaltem Lungenzellmedium enthält.</li>
</ol>4. Homogenisierung von Lungengewebe für Multiplex-Bead-Arrays mit Bead-Homogenisator
<ol><li>Kühlen Sie ein 2-ml-konisches Schraubverschlussrohr mit 3 sterilen 2,3-mm-Zirkonoxid-/Kieselsäurekügelchen vor. Geben Sie 200 μL kalten Homogenisierungspuffer in das Röhrchen.</li>
	<li>Wiegen Sie den Lappen, geben Sie den Lappen in das vorgekühlte konische Rohr, das die Perlen und den Homogenisierungspuffer enthält. HINWEIS: Etwa 50-100 mg homogenisiertes Gewebe in 200 μL Puffer reichen aus, um die Zytokin- und Chemokinexpression in der Probe nachzuweisen.<ol><li>Homogenisieren Sie den Lappen mit einem perlenbasierten Homogenisator (siehe Materialtabelle) bei 4.000 U/min für 2 min.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig homogenisiert ist. Erhöhen Sie die Zeit bei Bedarf.</li>
	</ol></li>
	<li>Nach der Homogenisierung zentrifugieren Sie das Röhrchen in einer vorgekühlten (4 °C) Mikrozentrifuge bei 15.870 x g für 3 min.</li>
	<li>Die Überstände werden in ein vorgekühltes 1,5 ml Mikroröhrchen überführt.</li>
	<li>Legen Sie die Probe zur sofortigen Verwendung direkt auf Eis oder lagern Sie die Probe bei -80 °C für die zukünftige Verwendung. Vermeiden Sie mehrere Gefrier-Tau-Zyklen.</li>
</ol>5. Lungengewebedissoziation und Einzelzellisolierung
<ol><li>Gießen Sie das Lungenzellmedium von den verbleibenden Lungenlappen ab, um eine Verdünnung des Dissoziationspuffers zu vermeiden. Führen Sie dann vorsichtig eine 1-ml-Spritze mit 25G und 5/8-Nadel mit 1 ml des Dissoziationspuffers in das Lungengewebe ein.</li>
	<li>Injizieren Sie kleine Fraktionen (ca. 1/4 bis 1 /5th) des Dissoziationspuffers in jeden Lungenlappen und blasen Sie ihn sanft auf. HINWEIS: Der größte Teil des Puffers wird kurz nach dem Aufblasen herauseilen, wenn der Lappen herausgeschnitten wurde.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Injektion des Dissoziationspuffers 1-2x.</li>
	<li>Die Lungenlappen mit Dissoziationspuffer für 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Die Lungenlappen mit einer feinen Präparationsschere fein zerkleinern.</li>
	<li>Die gehackten Lungenstücke mit dem Dissoziationspuffer in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführen.  Ergänzung mit zusätzlichem Dissoziationspuffer auf insgesamt 6 ml. Wirbeln kräftig für 1 min.</li>
	<li>Die Probe 45 min bei 37 °C inkubieren. Wirbel kräftig alle 7-8 min.</li>
	<li>Nach 45 Minuten Inkubation die Probe 1 Minute lang kräftig durchziehen, um optimale Ergebnisse zu erzielen.</li>
	<li>Dissoziieren Sie die Probe weiter, indem Sie durch ein 100-μm-Zellsieb gehen, um verbleibendes, unerwünschtes Bindegewebe und interstitielles Gewebe zu entfernen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe für 10 min bei 380 x g, verwerfen Sie den Überstand.</li>
	<li>Geben Sie 5 ml kaltes Lungenzellenmedium in die Probe. Resuspendieren Sie das Zellpellet durch sanftes Wirbeln.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe für 10 min bei 380 x g, verwerfen Sie den Überstand.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml kaltes Lungenzellenmedium hinzu. Resuspendieren Sie das Zellpellet durch sanftes Wirbeln.</li>
	<li>Gehen Sie durch ein 100-μm-Zellsieb und zählen Sie die Zellen.</li>
</ol>6. Durchflusszytometrische Analyse für die Lungenimmunzellnische
<ol><li>Samen 1-2 x 106 Zellen/Antikörper in eine 96 gut abgerundete Bodenplatte (insgesamt 3 Sets). Zentrifugieren Sie die Zellen für 3 min bei 830 x g. Überstände verwerfen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in 50 μL kaltem PBS, das einen fixierbaren lebenden/toten Fleck enthält. Bereiten Sie den Fleck gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 4 °C für 20 min vor Licht geschützt. Zentrifugieren Sie die Zellen für 3 min bei 830 x g. Überstände verwerfen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 25 μL kaltem FACS-Puffer, der 5 μg/ml Anti-Maus-CD16/32-Antikörper enthält. Bei 4 °C 10-15 min inkubieren.</li>
	<li>Geben Sie 25 μL kalten FACS-Puffer, der die in Tabelle 1 aufgeführten Antikörperkombinationen enthält, in die Zellen ein. Durch vorsichtiges Pipettieren mischen. HINWEIS: Das Gesamtvolumen des FACS-Puffers für die Antikörperfärbung beträgt 50 μL. Daher sollte bei der Herstellung einer Mastermischung von Antikörpern in 25 μL die Konzentration der Antikörper doppelt so hoch sein wie die Endkonzentration.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen bei 4 °C für 20 min vor Licht geschützt. Zentrifugieren Sie die Zellen für 3 min bei 830 x g. Überstände verwerfen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen mit 100 μL kaltem FACS-Puffer. Zentrifugieren Sie die Zellen für 3 min bei 830 x g. Überstände verwerfen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen mit 100 μL kaltem FACS-Puffer. Transfer in ein 5-ml-FACS-Röhrchen mit rundem Boden aus Polystyrol, das 150 μL zusätzlichen FAC-Puffer enthält. Analysieren Sie die Probe sofort mit einem Durchflusszytometer. HINWEIS: Durch die Zellfixierung mit den folgenden Schritten können Proben später analysiert werden.</li>
	<li>Nach Schritt 6.7 wird die Probe mit 100 μL 1% Paraformaldehyd in PBS resuspendiert.</li>
	<li>Die Probe bei 4 °C 15 min lichtgeschützt inkubieren. Zentrifugieren Sie die Zellen für 3 min bei 830 x g. Überstände verwerfen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen mit 100 μL kaltem FACS-Puffer. Zentrifugieren Sie die Zellen für 3 min bei 830 x g. Überstände verwerfen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen mit 100 μL kaltem FACS-Puffer. Lagern Sie die Zellen lichtgeschützt bei 4 °C. Analysieren Sie die Probe innerhalb von 72 Stunden.</li>
</ol>7. Multiplex-Bead-Arrays für den Nachweis von Zytokinen und Chemokinen
HINWEIS: Kommerziell erhältliche proinflammatorische Chemokin- und Entzündungsmultiplex-Panels (siehe Materialtabelle) wurden verwendet, um die Expression von Chemokinen und Zytokinen in der Lunge nach tMCAO-Induktion gemäß Herstellerprotokoll zu bestimmen, das im Detail13 beschrieben wurde.
<ol><li>Kurz gesagt, tauen Sie die Analyten auf Eis auf, wenn sie nach der Gewebehomogenisierung bei -80 °C gelagert wurden. Zentrifugieren Sie die Probe bei 590 x g für 2 min bei 4 °C vor Gebrauch, um restliches Gewebe zu entfernen.</li>
	<li>Erzeugen Sie eine Standardkurve, indem Sie den Standardcocktail (C7), der eine bekannte Konzentration von 10 ng / ml aufweist, seriell in 7 Standards (C1-6) verdünnen, wobei der letzte Standard der Assay-Puffer allein (C0) ist.</li>
	<li>Sobald alle Reagenzien auf Raumtemperatur erwärmt sind, fügen Sie 25 μL jedes Standards und 25 μL Assay-Puffer zu einer V-Bodenplatte 96 hinzu.</li>
	<li>Zu jeder Probenmulde werden 25 μL Lungenhomogenat (Analyt) und 25 μL Assay-Puffer zu einer V-Bodenplatte mit 96-Vertiefung hinzugefügt.</li>
	<li>Wirbeln Sie die vorbeschichteten Perlen kräftig aus und fügen Sie dann 25 μL vorbeschichtete Perlen in jede der Standard- und Probenmulden hinzu.</li>
	<li>Verschließen Sie die Platte und schützen Sie sie vor Licht, indem Sie sie mit Folie abdecken. Schütteln Sie die Platte bei 110 U/min für 2 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 230 x g für 5 min. Fügen Sie 200 μL Waschpuffer zu 1x hinzu (Stammlösung ist 20x, verdünnen Sie auf 1x mit Wasser). 1 min inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 230 x g für 5 min. Resuspendieren Sie den Standard und die Probe mit 25 μL Nachweisantikörpern.</li>
	<li>Versiegeln und abdecken Sie die Platte, um den Inhalt vor Licht zu schützen. Schütteln Sie die Platte bei 110 U/min für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Fügen Sie 25 μL Streptavidin-Phycoerythrin (SA-PE) zu jedem Standard hinzu und nehmen Sie eine gute Probe.</li>
	<li>Versiegeln und abdecken Sie die Platte, um den Inhalt vor Licht zu schützen. Bei 110 U/min 30 min bei Raumtemperatur schütteln.</li>
	<li>Drehen Sie die Platte bei 230 x g für 5 min. Standard und Proben in 1x Waschpuffer resuspendieren.</li>
	<li>In ein gut beschriftetes 5 mL FACS-Röhrchen mit rundem Boden aus Polystyrol überführt, das zusätzliche 150 μL 1x Waschpuffer enthält.</li>
	<li>Bestimmung der PE-Signalfluoreszenzintensität für die Standards und Proben mit einem Durchflusszytometer.</li>
	<li>Erstellen Sie eine Standardkurve für jedes Chemokin und Zytokin unter Verwendung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von PE gegen die vorbestimmten Konzentrationen.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Konzentration jedes Chemokins und Zytokins unter Verwendung der Standardkurve und des MFI aus jeder Probe. Das Multiplex-Panel bietet eine Datenanalysesoftware, mit der die Konzentration jedes Analyten bestimmt werden kann. Das Gewicht des apikalen / oberen Lappens wird verwendet, um die Konzentration von Zytokinen oder Chemokin pro Milligramm Gewebe zu bestimmen.</li>
</ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+synovial+sarcoma+metastasis+in+the+mouse:+PI3'-lipid+signaling+and+inflammation.">Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).</li><li>Bout&#233;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C3HeB/FeJ+mouse+model+recapitulates+the+hallmark+of+bovine+tuberculosis+lung+lesions+following+Mycobacterium+bovis+aerogenous+infection.">The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection.</a> Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).</li><li>Bal, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1&#946;,+IL-4+and+IL-12+control+the+fate+of+group+2+innate+lymphoid+cells+in+human+airway+inflammation+in+the+lungs.">IL-1&#946;, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs.</a> Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).</li><li>Nakasone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+gamma/delta+T+cells+in+the+lungs+and+their+roles+in+neutrophil-mediated+host+defense+against+pneumococcal+infection.">Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection.</a> Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die Identifizierung von Lungenimmunzelltypen und die Expression von Chemokinen oder Zytokinen in derselben Maus. Wenn eine histopathologische Untersuchung gewünscht wird, kann ein einzelner Lappen zu diesem Zweck entfernt und fixiert werden, bevor mit den Einzelzellisolierungsschritten fortgefahren wird. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass dieser Ansatz in einigen Krankheitssituationen möglicherweise nicht geeignet ist, wenn die Veränderung der Immunzel...

Die Lunge ist ein Barriereorgan, das der äußeren Umgebung ausgesetzt ist und daher ständig immunologischen Herausforderungen wie Krankheitserregern und Allergenen ausgesetzt ist1. Die Aktivierung lungenresidenter Immunzellen und die Infiltration von Immunzellen aus der Peripherie sind erforderlich, um Krankheitserreger aus der pulmonalen Umgebung zu entfernen. Darüber hinaus halten lungenresidente Immunzellen die Toleranz gegenüber kommensalen Bakterien aufrecht, was darauf hindeutet, dass diese Zellen eine Rolle bei der Pathogenentfernung und der Aufrechterhaltung der Homöostase spielen1. Alveoläre und interstitielle Makrophagen gehören zu den lungenresidenten Sentinel-Immunzellen, die Krankheitserreger über Mustererkennungsrezeptoren wahrnehmen und durch Phagozytosebeseitigen 2. Lungenansässige dendritische Zellen überbrücken die angeborene und adaptive Immunantwort durch Antigenpräsentation3. Darüber hinaus produzieren aktivierte lokale angeborene Immunzellen Zytokine und Chemokine, die die Entzündungsreaktion verstärken und die Infiltration von Immunzellen wie Monozyten, Neutrophilen und Lymphozyten in die Lunge stimulieren1. Es wurde gezeigt, dass ein ischämischer Schlaganfall die systemische Immunität verändert und zu einer erhöhten Anfälligkeit für Lungeninfektionen führt. Allerdings haben nur wenige Studien das Lungenkompartiment nach einem ischämischen Schlaganfall untersucht, obwohl einige Studien es bei entzündlichen Zuständenuntersucht haben 4,5,6,7,8,9. Das Ziel der hierin beschriebenen Verfahren ist es, gleichzeitig die Lungenpathologie, die Immunzellzusammensetzung und die Zytokin- und Chemokinexpression in der Lunge zu bestimmen, um Veränderungen am Lungenkompartiment zu bewerten und mögliche Veränderungen der pulmonalen Immunantwort nach einer ischämischen Attacke zu bewerten.
Hier wird ein Protokoll zur Gewinnung von Einzelzellsuspensionen aus den Lungen der Mäuse beschrieben, um 13 Arten von Immunzellen zu identifizieren. Dieses Protokoll basiert auf der Gewebeverdauung mit Kollagenase D, ohne dass ein automatisierter Gewebedissoziator erforderlich ist. Darüber hinaus haben wir ein Protokoll zur Herstellung von Gewebehomogenaten entwickelt, mit dem die Expressionsniveaus von 13 verschiedenen Zytokinen oder Chemokinen mithilfe von Durchflusszytometrie-basierten Multiplex-Bead-Arrays bestimmt werden können. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um die Auswirkungen eines ischämischen Schlaganfalls auf die pulmonale Immunität zu untersuchen und kann auch in anderen Krankheitsmodellen verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:932px;" width="931">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">B220-APC, clone RA3-6B2</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">103212</td>
			<td style="width:412px;">1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Beadbug 3 position bead homogenizer</td>
			<td style="width:129px;">Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:101px;">D1030</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CCR2-BV421, clone SA203G11</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">150605</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD103-BV421, clone 2E7</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">121422</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD11b-PE/Cy7, clone M1/70</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">101216</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD11c-PE/Cy7, clone N418</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">117318</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">117328</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD4-BV421, clone GK1.5</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">100443</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD45-FITC, clone 30-F11</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">103108</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD64-APC, clone X54-5/7.1</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">139306</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD8-PE, clone 53-6.7</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">100708</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11088882001</td>
			<td>Component in the dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Conical screw cap tube</td>
			<td style="width:129px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">02-681-344</td>
			<td>Tube for tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">DNase I</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Component in the dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Fc block CD16/32 antibody</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">genlteMACS dissociator</td>
			<td style="width:129px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">gentleMACS C tubes</td>
			<td style="width:129px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:101px;">130-093-237</td>
			<td>Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial</td>
			<td style="width:129px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">78442</td>
			<td>Component in the homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Laser doppler monitor</td>
			<td style="width:129px;">Moor</td>
			<td style="width:101px;">MOORVMS-LDF</td>
			<td>Blood flow monitoring during tMCAO</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">LEGENDplex proinflammatory chemokine panel</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">740451</td>
			<td>Multiplex bead array</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">LIVE/DEAD fixable near-IR stain</td>
			<td style="width:129px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">L34976</td>
			<td>Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Ly6C-PE, clone HK1.4</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">128008</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Ly6G-BV510, clone 1A8</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">127633</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">MCAO suture L56 reusable 6-0 medium</td>
			<td style="width:129px;">Doccol</td>
			<td style="width:101px;">602356PK10Re</td>
			<td>tMCAO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">MHC II-BV510, clone M5/114.15.2</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">107636</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">108728</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Siglec F-PE, clone E50-2440</td>
			<td style="width:129px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:101px;">552126</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Silk suture thread, size 6/0</td>
			<td style="width:129px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:101px;">18020-60</td>
			<td>tMCAO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">SomnoSuite anesthesia system</td>
			<td style="width:129px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:101px;">SS-01</td>
			<td>Mouse anaesthetization for tMCAO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">TCRb-BV510, clone H57-897</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">109234</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Zirconia/silica beads, 2.3 mm</td>
			<td style="width:129px;">Biospec</td>
			<td style="width:101px;">11079125z</td>
			<td>Beads for tissue homogenization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of immune cells and proinflammatory mediators in the pulmonary environment

Die Expansion, Aktivierung und der Transport von Immunzellen in die Lunge, die durch die Expression mehrerer Zytokine und Chemokine gesteuert werden, können durch schwere Hirnverletzungen verändert werden. Dies wird durch die Tatsache belegt, dass Lungenentzündung eine der Haupttodesursachen bei Patienten ist, die einen ischämischen Schlaganfall erlitten haben. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Verwendung der mehrfarbigen Durchflusszytometrie zu beschreiben, um 13 Arten von Immunzellen in der Lunge von Mäusen zu identifizieren, einschließlich alveolärer Makrophagen, interstitieller Makrophagen, CD103+ oder CD11b + dendritische Zellen (DCs), plasmazytoide DCs, Eosinophile, Monozyten / Monozyten-abgeleitete Zellen, Neutrophile, lymphoide T- und B-Zellen, NK-Zellen und NKT-Zellen, nach ischämischer Schlaganfallinduktion durch vorübergehenden mittleren Hirnarterienverschluss. Darüber hinaus beschreiben wir die Herstellung von Lungenhomogenaten unter Verwendung einer Perlenhomogenisierungsmethode, um die Expressionsniveaus von 13 verschiedenen Zytokinen oder Chemokinen gleichzeitig durch Multiplex-Bead-Arrays gekoppelt mit durchflusszytometrischer Analyse zu bestimmen. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die pulmonale Immunantwort in anderen Krankheitssituationen wie infektiösen Lungenerkrankungen oder allergischen Erkrankungen zu untersuchen.

Wir berichteten kürzlich, dass die ischämische Schlaganfallinduktion bei Mäusen die Immunzellzusammensetzung der Lunge verändert11. Insbesondere erhöhte die vorübergehende zerebrale Ischämie den Prozentsatz der alveolären Makrophagen, Neutrophilen und CD11b + DCs, während die Prozentsätze von CD4 + T-Zellen, CD8 + T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen und Eosinophilen im Lungenkompartiment abnahmen. Darüber hinaus entsprach die zelluläre Veränderung signifikant verminderten Konzentrationen mu...

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Characterization of Immune Cells and Proinflammatory Mediators in the Pulmonary Environment

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Durchflusszytometrie, um die Veränderungen der Immunzellzusammensetzung, des Zytokinprofils und des Chemokinprofils in der pulmonalen Umgebung nach einem vorübergehenden mittleren Hirnarterienverschluss, einem murinen Modell des ischämischen Schlaganfalls, zu identifizieren.

Charakterisierung von Immunzellen und proinflammatorischen Mediatoren im pulmonalen Milieu

Immune cell expansion, activation, and trafficking to the lungs, which are controlled by the expression of multiple cytokines and chemokines, may be ...

characterization-immune-cells-proinflammatory-mediators-pulmonary

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.2K Aufrufe.  West Virginia University. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Durchflusszytometrie, um die Veränderungen der Immunzellzusammensetzung, des Zytokinprofils und des Chemokinprofils in der pulmonalen Umgebung nach einem vorübergehenden mittleren Hirnarterienverschluss, einem murinen Modell des ischämischen Schlaganfalls, zu identifizieren.

Serie: Characterization of Immune Cells and Proinflammatory Mediators in the Pulmonary Environment

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Mess-Calpain Aktivität in fixierten und lebenden Zellen mittels Durchflusszytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Seven Steps to Cells Stellate

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Intravital Imaging of the Mouse Thymus mittels 2-Photonen-Mikroskopie

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is a common modifier of heart and lung function, by elaborating cellular infiltration, production of cytokines and growth factors, and by initiating remodeling processes 1.
Compared to the left ventricle, the right ventricle is a low-pressure pump that operates in a relatively narrow zone of pressure changes. Increased pulmonary artery pressures are associated with increased pressure in the lung vascular bed and pulmonary hypertension 2. Pulmonary hypertension is often associated with inflammatory lung diseases, for example chronic obstructive pulmonary disease, or autoimmune diseases 3. Because pulmonary hypertension confers a bad prognosis for quality of life and life expectancy, much research is directed towards understanding the mechanisms that might be targets for pharmaceutical intervention 4. The main challenge for the development of effective management tools for pulmonary hypertension remains the complexity of the simultaneous understanding of molecular and cellular changes in the right heart, the lungs and the immune system.
Here, we present a procedural workflow for the rapid and precise measurement of pressure changes in the right heart of mice and the simultaneous harvest of samples from heart, lungs and immune tissues. The method is based on the direct catheterization of the right ventricle via the jugular vein in close-chested mice, first developed in the late 1990s as surrogate measure of pressures in the pulmonary artery5-13. The organized team-approach facilitates a very rapid right heart catheterization technique. This makes it possible to perform the measurements in mice that spontaneously breathe room air. The organization of the work-flow in distinct work-areas reduces time delay and opens the possibility to simultaneously perform physiology experiments and harvest immune, heart and lung tissues.
The procedural workflow outlined here can be adapted for a wide variety of laboratory settings and study designs, from small, targeted experiments, to large drug screening assays. The simultaneous acquisition of cardiac physiology data that can be expanded to include echocardiography5,14-17 and harvest of heart, lung and immune tissues reduces the number of animals needed to obtain data that move the scientific knowledge basis forward. The procedural workflow presented here also provides an ideal basis for gaining knowledge of the networks that link immune, lung and heart function. The same principles outlined here can be adapted to study other or additional organs as needed.

A specific and rapid protocol to simultaneously investigate right heart function, lung inflammation, and the immune response is described as a learning tool. Video and figures describe physiology and microdissection techniques in an organized team-approach that is adaptable to be used for small to large sized studies.

Rechtsventrikulären systolischen Druck Messungen in Kombination mit Harvest of Lung and Immune Gewebeproben in Mäuse

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

Isolation von Fettgewebe Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Untersuchung der Effekte von Probiotika auf Pneumokokken-Kolonisation Mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Einhaltung Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Isolierung und Charakterisierung von Neutrophilen mit Anti-Tumor-Eigenschaften

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

Isolierung, Charakterisierung und funktionelle Untersuchung des Zahnfleisch Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...