Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH P20 GM109098 e dall'Innovation Award Program da Praespero a Edwin Wan. Gli esperimenti di citometria a flusso sono stati eseguiti nella WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, supportata dalle sovvenzioni NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 e P20 GM103434.

Tutti i protocolli e le procedure eseguite sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della West Virginia University. I topi sono stati alloggiati in condizioni specifiche prive di agenti patogeni nel vivaio della West Virginia University.
1. Preparazione delle soluzioni
<ol><li>Preparare tampone di perfusione (soluzione salina tamponata fosfato, PBS). Utilizzare circa due aliquote da 10 ml di PBS ghiacciato per mouse.</li>
	<li>Preparare il mezzo delle cellule polmonari/tampone FACS. Il tampone FACS contiene PBS integrato con siero bovino fetale all'1% (FBS). Mantenere il freddo medio per l'intero processo di escissione e trasferimento polmonare. Preparare circa 8 ml per campione polmonare. Preparare un nuovo mezzo / tampone FACS prima degli esperimenti.</li>
	<li>Preparare il buffer di dissociazione per l'isolamento di una singola cella. Il tampone contiene 1 mg/mL di collagenasi D e 200 μg/mL di DNasi I nella soluzione salina tamponata di Hank (HBSS). Preparare fresco dalla soluzione madre (100 mg/mL collagenasi D e 10 mg/mL DNasi I) prima degli esperimenti. Sono necessari circa 6 ml per campione polmonare. Assicurarsi che il tampone raggiunga la temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare il tampone di omogeneizzazione per l'omogeneizzazione del tessuto polmonare. Il tampone contiene PBS e 1x cocktail di inibitori della proteinasi e della fosfatasi (stock = 100x). Preparare appena prima degli esperimenti. Mantenere il buffer freddo durante l'intero processo di omogeneizzazione. Circa 200 μL del tampone sono sufficienti per omogeneizzare un singolo lobo destro dei polmoni.</li>
</ol>2. Occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media (tMCAO)
NOTA: Le procedure per tMCAO tramite inserimento di monofilamenti nell'arteria cerebrale media sono state documentate in dettaglio in precedenza10. In questi esperimenti, sono stati utilizzati topi maschi C57BL / 6J di 8-12 settimane, del peso di 25-30 g.
<ol><li>In breve, somministrare per via sottocutanea 2 mg/kg di meloxicam ai topi prima dell'intervento chirurgico. Anestetizzare profondamente i topi in una camera di induzione usando isoflurano al 5%. Confermare l'anestesia profonda utilizzando il metodo del pizzico del piede. Mantenere l'anestesia con isoflurano all'1-2% durante l'intervento chirurgico utilizzando un cono nasale. Mantenere la temperatura corporea a 36,5 - 38 °C durante tutta la procedura posizionando una coperta calda sotto i topi. Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati in autoclave un giorno prima dell'intervento.</li>
	<li>Rasare e preparare la pelle sul collo ventrale utilizzando etanolo al 70% seguito da scrub alla clorexidina. Somministrare per via sottocutanea 2 mg/kg di bupivacaina sull'area dell'incisione prima di effettuare la prima incisione. Utilizzare unguento per gli occhi per coprire gli occhi per prevenire la secchezza. Fai un'incisione del collo della linea mediana. Allontanare delicatamente i tessuti molli intorno alla trachea.</li>
	<li>Identificare l'arteria carotide comune sinistra e l'arteria carotide esterna.</li>
	<li>Applicare una sutura temporanea (taglia 6/0) all'arteria carotide comune per arginare il flusso del sangue. Fare un'incisione nell'arteria carotide esterna.</li>
	<li>Inserire un monofilamento rivestito di gomma siliconica (taglia 6-0) nell'arteria carotide esterna, quindi far avanzare il monofilamento verso l'arteria cerebrale media. Lasciare il monofilo nell'arteria cerebrale media per 60 minuti (occlusione).</li>
	<li>Monitorare la velocità del flusso sanguigno utilizzando Laser Doppler Flowmetry. Una riduzione della portata verso l'arteria cerebrale media che è > l'80% indica un'occlusione riuscita.</li>
	<li>Dopo i 60 minuti di occlusione, rimuovere il monofilo per consentire la riperfusione. Chiudere l'incisione.</li>
	<li>Nei topi operati fittizi, eseguire i passaggi 2.1-2.6 senza l'inserimento del monofilamento. In questi topi, la velocità del flusso sanguigno deve rimanere costante durante l'intera procedura.</li>
	<li>Monitorare i topi quotidianamente e misurare i deficit neurologici utilizzando i criteri di punteggio standard11. 0 – nessun deficit neurologico; 1 – ritrae la zampa anteriore controlaterale quando sollevata dalla coda; 2- cerchi al controlaterale quando sollevato dalla coda; 3- cadere al controlaterale mentre si cammina; 4 – non cammina spontaneamente o è in coma; 5 – morti.</li>
	<li>Fornire iniezioni sottocutanee di soluzione salina normale e analgesico (meloxicam, 2 mg / kg) ogni 24 ore per 3 giorni dopo l'intervento.</li>
	<li>Isolare i polmoni 24 e 72 ore dopo tMCAO per l'analisi a valle.</li>
</ol>3. Raccolta dei tessuti polmonari
<ol><li>Anestetizzare profondamente il topo mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) di 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina. Confermare l'anestesia profonda utilizzando il metodo del pizzico del piede.</li>
	<li>Per eseguire la perfusione transcardica di tutto il corpo12, fissare il mouse alla piattaforma chirurgica e bagnare la pelliccia con etanolo al 70% per ridurre la distribuzione della pelliccia nella cavità corporea. Utilizzare le forbici da dissezione fine per fare un'incisione trasversale nell'addome caudale e quindi un'incisione mediana del peritoneo, fermandosi nella cavità toracica prima di perforare il diaframma.<ol><li>Non tagliare il muscolo / nascondersi nella cavità peritoneale e non continuare l'incisione oltre l'addome.</li>
	</ol></li>
	<li>Interrompere l'incisione non appena la cavità toracica è stata raggiunta prima di perforare il diaframma. Fare attenzione a non danneggiare il cuore e i polmoni che possono compromettere la qualità della perfusione o il recupero cellulare</li>
	<li>Usando le forbici per dissezione fine, fai un'incisione mediana del peritoneo fermandosi nella cavità toracica prima di perforare il diaframma.</li>
	<li>Afferrare il topo per l'estremità distale dello sterno usando una pinza e sollevare verso l'alto mentre si taglia il diaframma assicurandosi di non danneggiare il cuore, i polmoni o la vascolarizzazione. Una volta che gli organi sono visibili, praticare un'incisione attraverso la gabbia toracica e separare e fissare la custodia toracica in modo che il cuore e i polmoni siano completamente esposti.</li>
	<li>Fare con attenzione una piccola incisione nell'atrio destro vicino all'arco aortico. Questo servirà come deflusso per la perfusione.</li>
	<li>Subito dopo, inserire delicatamente un ago da 25 G x 5/8 collegato a una siringa riempita con 10 ml di PBS freddo nella superficie superiore distale del ventricolo sinistro. Fare attenzione a non inserire attraverso il setto ventricolare nel ventricolo destro. L'ago dovrebbe essere appena inserito nel ventricolo sinistro. NOTA: Se il setto ventricolare viene perforato, il liquido uscirà dal naso del topo. Ciò ridurrà la qualità della perfusione e comporterà la perdita di cellule.</li>
	<li>Se lo si desidera, è possibile utilizzare un morsetto per tenere saldamente l'ago in posizione nel ventricolo sinistro durante la perfusione.</li>
	<li>Spingere costantemente ma delicatamente 10 ml di PBS freddo nel cuore. Il tessuto del topo dovrebbe iniziare a perfondersi e cancellare il sangue quando il fluido esce dall'atrio destro.<ol><li>Spingere una seconda aliquota di 10 mL di PBS fino a quando non si è verificata una sufficiente clearance del sangue. Il fegato avrà un aspetto marrone chiaro e i polmoni passeranno da un colore rosa rossastro a un colore prevalentemente bianco.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzando una pinza e forbici per dissezione fine, rimuovere con cura tutti i tessuti circostanti tra cui cuore, trachea, esofago, timo, tessuto connettivo, linfonodi e bronchi di grandi dimensioni.</li>
	<li>Separare i singoli lobi polmonari e posizionare i lobi in una capsula di Petri su ghiaccio contenente un'aliquota di 1-2 ml di mezzo di cellule polmonari fredde.</li>
</ol>4. Omogeneizzazione del tessuto polmonare per array di perline multiplex mediante omogeneizzatore di perline
<ol><li>Pre-raffreddare un tubo conico con tappo a vite da 2 ml contenente 3 sfere sterili di zirconia/silice da 2,3 mm. Aggiungere 200 μL di tampone di omogeneizzazione a freddo al tubo.</li>
	<li>Pesare il lobo, trasferire il lobo sul tubo conico pre-raffreddato contenente le perle e il tampone di omogeneizzazione. NOTA: Circa 50-100 mg di tessuto omogeneizzato in 200 μL di tampone saranno sufficienti per rilevare l'espressione di citochine e chemochine nel campione.<ol><li>Omogeneizzare il lobo utilizzando un omogeneizzatore a base di perline (vedi Tabella dei materiali) a 4.000 giri / min per 2 minuti.</li>
		<li>Assicurarsi che il tessuto sia completamente omogeneizzato. Aumentare il tempo se necessario.</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo l'omogeneizzazione, centrifugare il tubo in una microcentrifuga pre-raffreddata (4 °C) a 15.870 x g per 3 minuti.</li>
	<li>Trasferire i surnatanti in un microtubo pre-raffreddato da 1,5 ml.</li>
	<li>Porre il campione direttamente sul ghiaccio per un uso immediato o conservare il campione a -80 °C per un uso futuro. Evitare cicli multipli di congelamento-scongelamento.</li>
</ol>5. Dissociazione del tessuto polmonare e isolamento di singole cellule
<ol><li>Versare il mezzo delle cellule polmonari dei lobi polmonari rimanenti per evitare la diluizione del tampone di dissociazione. Quindi, inserire con cautela una siringa da 1 mL con 25G e 5/8 ago contenente 1 mL del tampone di dissociazione nel tessuto polmonare.</li>
	<li>Iniettare piccole frazioni (da 1/4 a 1/5di th) del tampone di dissociazione in ciascun lobo polmonare e gonfiare delicatamente. NOTA: la maggior parte del tampone uscirà subito dopo il gonfiaggio poiché il lobo è stato asportato.</li>
	<li>Ripetere l'iniezione del tampone di dissociazione 1-2x.</li>
	<li>Incubare i lobi polmonari con tampone di dissociazione per 2 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Tritare finemente i lobi polmonari in piccoli pezzi usando le forbici per dissezione fine.</li>
	<li>Trasferire i pezzi polmonari tritati con il tampone di dissociazione in una provetta da centrifuga da 15 ml.  Supplemento con tampone di dissociazione aggiuntivo per un totale di 6 ml. Vortice vigorosamente per 1 min.</li>
	<li>Incubare il campione per 45 minuti a 37 °C. Vortice vigorosamente ogni 7-8 minuti.</li>
	<li>Dopo 45 minuti di incubazione, vortice vigorosamente il campione per 1 minuto per risultati ottimali.</li>
	<li>Dissociare ulteriormente il campione passando attraverso un filtro cellulare da 100 μm per rimuovere il tessuto connettivo e interstiziale residuo, indesiderato.</li>
	<li>Centrifugare il campione per 10 minuti a 380 x g, scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 5 ml di terreno di cellule polmonari fredde al campione. Risospendere il pellet cellulare mediante vortice delicato.</li>
	<li>Centrifugare il campione per 10 minuti a 380 x g, scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di mezzo di cellule polmonari fredde. Risospendere il pellet cellulare mediante vortice delicato.</li>
	<li>Passare attraverso un filtro cellulare da 100 μm e contare le cellule.</li>
</ol>6. Analisi citometrica a flusso per la nicchia delle cellule immunitarie polmonari
<ol><li>Semina 1-2 x 106 cellule/anticorpo in una piastra inferiore rotonda a 96 pozzetti (3 set in totale). Centrifugare le celle per 3 minuti a 830 x g. Scartare i surnatanti .</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 50 μL di PBS freddo contenente colorazione vivi/morti fissabili. Preparare la macchia secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Incubare le cellule a 4 °C per 20 minuti al riparo dalla luce. Centrifugare le celle per 3 minuti a 830 x g. Scartare i surnatanti .</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare con 25 μL di tampone FACS freddo contenente 5 μg/mL di anticorpo CD16/32 anti-topo. Incubare a 4 °C per 10-15 min.</li>
	<li>Aggiungere alle cellule 25 μL di tampone FACS freddo contenente combinazioni di anticorpi elencate nella Tabella 1 . Mescolare mediante pipettaggio delicato. NOTA: il volume totale del tampone FACS per la colorazione degli anticorpi è di 50 μL. Pertanto, quando si prepara una miscela master di anticorpi in 25 μL, la concentrazione di anticorpi deve essere doppia rispetto alla concentrazione finale.</li>
	<li>Incubare le cellule a 4 °C per 20 minuti al riparo dalla luce. Centrifugare le celle per 3 minuti a 830 x g. Scartare i surnatanti .</li>
	<li>Risospendere le cellule con 100 μL di tampone FACS freddo. Centrifugare le celle per 3 minuti a 830 x g. Scartare i surnatanti .</li>
	<li>Risospendere le cellule con 100 μL di tampone FACS freddo. Trasferire in un tubo FACS di polistirene a fondo tondo da 5 mL contenente 150 μL di tampone FAC aggiuntivo. Analizzare immediatamente il campione utilizzando un citometro a flusso. NOTA: la fissazione delle cellule utilizzando i seguenti passaggi consente di analizzare i campioni in un secondo momento.</li>
	<li>Dopo il punto 6.7, risospendere il campione con 100 μL di paraformaldeide all'1% in PBS.</li>
	<li>Incubare il campione a 4 °C per 15 minuti al riparo dalla luce. Centrifugare le celle per 3 minuti a 830 x g. Scartare i surnatanti .</li>
	<li>Risospendere le cellule con 100 μL di tampone FACS freddo. Centrifugare le celle per 3 minuti a 830 x g. Scartare i surnatanti .</li>
	<li>Risospendere le cellule con 100 μL di tampone FACS freddo. Conservare le celle a 4 °C, al riparo dalla luce. Analizzare il campione entro 72 h.</li>
</ol>7. Array di perline multiplex per il rilevamento di citochine e chemochine
NOTA: I pannelli multiplex di chemochine proinfiammatorie e infiammazioni disponibili in commercio (vedere la tabella dei materiali) sono stati utilizzati per determinare l'espressione di chemochine e citochine nei polmoni dopo l'induzione di tMCAO secondo il protocollo del produttore, che è stato descritto in dettaglio13.
<ol><li>In breve, scongelare gli analiti su ghiaccio se sono stati conservati a -80 °C dopo l'omogeneizzazione dei tessuti. Centrifugare il campione a 590 x g per 2 minuti a 4 °C prima dell'uso per rimuovere il tessuto residuo.</li>
	<li>Generare una curva standard diluendo in serie il cocktail standard (C7) che è ad una concentrazione nota di 10 ng/mL in 7 standard (C1-6) con l'ultimo standard che è il solo tampone di analisi (C0).</li>
	<li>Una volta che tutti i reagenti si sono riscaldati a temperatura ambiente, aggiungere 25 μL di ciascun standard e 25 μL di tampone di dosaggio a una piastra a V inferiore a 96 pozzetti.</li>
	<li>A ciascun pozzetto del campione, aggiungere 25 μL di omogenato polmonare (analita) e 25 μL di tampone di dosaggio a una piastra del pozzetto V inferiore a 96 pozzetti</li>
	<li>Vortice le sfere pre-rivestite vigorosamente, quindi aggiungere 25 μL di perle pre-rivestite a ciascuno dei pozzetti standard e campione.</li>
	<li>Sigillare la piastra e proteggere dalla luce coprendo con un foglio. Agitare la piastra a 110 giri/min per 2 ore a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugare a 230 x g per 5 min. Aggiungere 200 μL di tampone di lavaggio a 1x (la soluzione madre è 20x, diluire a 1x con acqua). Incubare per 1 min.</li>
	<li>Centrifugare a 230 x g per 5 min. Risospendere lo standard e campionare con anticorpi di rilevamento da 25 μL.</li>
	<li>Sigillare e coprire la piastra per proteggerla dalla luce. Agitare la piastra a 110 giri/min per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 25 μL di streptavidina-ficoeritrina (SA-PE) a ciascun standard e campionare il pozzetto.</li>
	<li>Sigillare e coprire la piastra per proteggerla dalla luce. Agitare a 110 giri/min per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Ruotare la piastra a 230 x g per 5 minuti. Risospendere lo standard e i campioni in 1x tampone di lavaggio.</li>
	<li>Trasferire in un tubo FACS da 5 mL di polistirene a fondo tondo ben etichettato contenente ulteriori 150 μL di tampone di lavaggio 1x.</li>
	<li>Determinare l'intensità di fluorescenza del segnale PE per gli standard e i campioni utilizzando un citometro a flusso.</li>
	<li>Costruire una curva standard per ogni chemochina e citochina utilizzando l'intensità media di fluorescenza (MFI) di PE rispetto alle concentrazioni predeterminate.</li>
	<li>Determinare la concentrazione di ciascuna chemochina e citochina utilizzando la curva standard e l'MFI di ciascun campione. Il pannello multiplex fornisce un software di analisi dei dati che può essere utilizzato per determinare la concentrazione di ciascun analita. Il peso del lobo apicale/superiore viene utilizzato per determinare la concentrazione di citochine o chemochine per milligrammo di tessuto.</li>
</ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+synovial+sarcoma+metastasis+in+the+mouse:+PI3'-lipid+signaling+and+inflammation.">Modeling synovial sarcoma metastasis in the mouse: PI3'-lipid signaling and inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2989-3005 (2016).</li><li>Bout&#233;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C3HeB/FeJ+mouse+model+recapitulates+the+hallmark+of+bovine+tuberculosis+lung+lesions+following+Mycobacterium+bovis+aerogenous+infection.">The C3HeB/FeJ mouse model recapitulates the hallmark of bovine tuberculosis lung lesions following Mycobacterium bovis aerogenous infection.</a> Veterinary Research. 48 (1), 73 (2017).</li><li>Bal, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1&#946;,+IL-4+and+IL-12+control+the+fate+of+group+2+innate+lymphoid+cells+in+human+airway+inflammation+in+the+lungs.">IL-1&#946;, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs.</a> Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).</li><li>Nakasone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+gamma/delta+T+cells+in+the+lungs+and+their+roles+in+neutrophil-mediated+host+defense+against+pneumococcal+infection.">Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection.</a> Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I protocolli qui descritti consentono l'identificazione dei tipi di cellule immunitarie polmonari e l'espressione di chemochine o citochine nello stesso topo. Se si desidera uno studio istopatologico, un lobo individuale può essere rimosso e fissato a tale scopo prima di procedere alle fasi di isolamento di una singola cellula. Una limitazione di questo metodo è che questo approccio potrebbe non essere adatto in alcuni contesti patologici se si prevede che il cambiamento nella composizione delle cellule immunitarie e l...

I polmoni sono un organo barriera, esposti all'ambiente esterno e, pertanto, ricevono costantemente sfide immunologiche come agenti patogeni e allergeni1. L'attivazione delle cellule immunitarie residenti nei polmoni e l'infiltrazione delle cellule immunitarie dalla periferia sono necessarie per eliminare i patogeni dall'ambiente polmonare. Inoltre, le cellule immunitarie residenti nei polmoni mantengono la tolleranza ai batteri commensali, suggerendo che queste cellule svolgono un ruolo nella clearance dei patogeni e nel mantenimento dell'omeostasi1. I macrofagi alveolari e interstiziali sono tra le cellule immunitarie sentinella residenti nei polmoni che rilevano i patogeni tramite i recettori di riconoscimento dei modelli e eliminano questi patogeni mediante fagocitosi2. Le cellule dendritiche residenti nei polmoni collegano la risposta immunitaria innata e adattativa attraverso la presentazione dell'antigene3. Inoltre, le cellule immunitarie innate locali attivate producono citochine e chemochine che amplificano la risposta infiammatoria e stimolano l'infiltrazione di cellule immunitarie come monociti, neutrofili e linfociti nei polmoni1. È stato dimostrato che l'ictus ischemico modifica l'immunità sistemica e porta ad una maggiore suscettibilità alle infezioni polmonari; Tuttavia, pochi studi hanno valutato il compartimento polmonare dopo ictus ischemico, anche se alcuni studi lo hanno esaminato durante le condizioni infiammatorie 4,5,6,7,8,9. L'obiettivo dei metodi qui descritti è determinare simultaneamente la patologia polmonare, la composizione delle cellule immunitarie e i livelli di espressione di citochine e chemochine nei polmoni per valutare le alterazioni del compartimento polmonare e valutare potenziali alterazioni della risposta immunitaria polmonare dopo attacco ischemico.
Descritto qui è un protocollo per ottenere sospensioni a singola cellula dai polmoni dei topi per identificare 13 tipi di cellule immunitarie. Questo protocollo si basa sulla digestione dei tessuti con collagenasi D senza la necessità di un dissociatore tissutale automatizzato. Inoltre, abbiamo sviluppato un protocollo per preparare omogenati tissutali che possono essere utilizzati per determinare i livelli di espressione di 13 diverse citochine o chemochine utilizzando array di perline multiplex basati sulla citometria a flusso. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per studiare gli effetti dell'ictus ischemico sull'immunità polmonare e può essere utilizzato anche in altri modelli di malattia.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:932px;" width="931">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">B220-APC, clone RA3-6B2</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">103212</td>
			<td style="width:412px;">1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Beadbug 3 position bead homogenizer</td>
			<td style="width:129px;">Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:101px;">D1030</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CCR2-BV421, clone SA203G11</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">150605</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD103-BV421, clone 2E7</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">121422</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD11b-PE/Cy7, clone M1/70</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">101216</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD11c-PE/Cy7, clone N418</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">117318</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">117328</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD4-BV421, clone GK1.5</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">100443</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD45-FITC, clone 30-F11</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">103108</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD64-APC, clone X54-5/7.1</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">139306</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">CD8-PE, clone 53-6.7</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">100708</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Collagenase D</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>11088882001</td>
			<td>Component in the dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Conical screw cap tube</td>
			<td style="width:129px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">02-681-344</td>
			<td>Tube for tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">DNase I</td>
			<td style="width:129px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Component in the dissociation buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Fc block CD16/32 antibody</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">genlteMACS dissociator</td>
			<td style="width:129px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">gentleMACS C tubes</td>
			<td style="width:129px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:101px;">130-093-237</td>
			<td>Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial</td>
			<td style="width:129px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">78442</td>
			<td>Component in the homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">Laser doppler monitor</td>
			<td style="width:129px;">Moor</td>
			<td style="width:101px;">MOORVMS-LDF</td>
			<td>Blood flow monitoring during tMCAO</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">LEGENDplex proinflammatory chemokine panel</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">740451</td>
			<td>Multiplex bead array</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">LIVE/DEAD fixable near-IR stain</td>
			<td style="width:129px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">L34976</td>
			<td>Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Ly6C-PE, clone HK1.4</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">128008</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Ly6G-BV510, clone 1A8</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">127633</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:289px;">MCAO suture L56 reusable 6-0 medium</td>
			<td style="width:129px;">Doccol</td>
			<td style="width:101px;">602356PK10Re</td>
			<td>tMCAO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">MHC II-BV510, clone M5/114.15.2</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">107636</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">108728</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Siglec F-PE, clone E50-2440</td>
			<td style="width:129px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:101px;">552126</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Silk suture thread, size 6/0</td>
			<td style="width:129px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:101px;">18020-60</td>
			<td>tMCAO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">SomnoSuite anesthesia system</td>
			<td style="width:129px;">Kent Scientific</td>
			<td style="width:101px;">SS-01</td>
			<td>Mouse anaesthetization for tMCAO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">TCRb-BV510, clone H57-897</td>
			<td style="width:129px;">Biolegend</td>
			<td style="width:101px;">109234</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:289px;">Zirconia/silica beads, 2.3 mm</td>
			<td style="width:129px;">Biospec</td>
			<td style="width:101px;">11079125z</td>
			<td>Beads for tissue homogenization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of immune cells and proinflammatory mediators in the pulmonary environment

L'espansione, l'attivazione e il traffico delle cellule immunitarie ai polmoni, che sono controllati dall'espressione di citochine e chemochine multiple, possono essere alterati da gravi lesioni cerebrali. Ciò è evidenziato dal fatto che la polmonite è una delle principali cause di mortalità nei pazienti che hanno sofferto di ictus ischemico. L'obiettivo di questo protocollo è descrivere l'uso dell'analisi citometrica a flusso multicolore per identificare 13 tipi di cellule immunitarie nei polmoni dei topi, inclusi macrofagi alveolari, macrofagi interstiziali, cellule dendritiche (DC) CD103+ o CD11b+, DC plasmacitoidi, eosinofili, monociti/cellule derivate da monociti, neutrofili, cellule T e B derivate da linfoidi, cellule NK e cellule NKT, a seguito di induzione di ictus ischemico mediante occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media. Inoltre, descriviamo la preparazione di omogenati polmonari utilizzando un metodo di omogeneizzazione delle perle, per determinare i livelli di espressione di 13 diverse citochine o chemochine simultaneamente mediante array di perline multiplex accoppiati con analisi citometrica a flusso. Questo protocollo può anche essere utilizzato per studiare la risposta immunitaria polmonare in altri contesti patologici, come la malattia polmonare infettiva o la malattia allergica.

Abbiamo recentemente riportato che l'induzione dell'ictus ischemico nei topi altera la composizione delle cellule immunitarie dei polmoni11. In particolare, l'ischemia cerebrale transitoria ha aumentato le percentuali di macrofagi alveolari, neutrofili e DC CD11b +, mentre ha diminuito le percentuali di cellule T CD4 +, cellule T CD8 +, cellule B, cellule NK ed eosinofili nel compartimento polmonare. Inoltre, l'alterazione cellulare corrispondeva a livelli significativamente diminuiti di chemochin...

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Characterization of Immune Cells and Proinflammatory Mediators in the Pulmonary Environment

Questo protocollo descrive l'uso della citometria a flusso per identificare i cambiamenti nella composizione delle cellule immunitarie, nel profilo delle citochine e nel profilo delle chemochine nell'ambiente polmonare dopo occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media, un modello murino di ictus ischemico.

Caratterizzazione di cellule immunitarie e mediatori proinfiammatori in ambiente polmonare

Immune cell expansion, activation, and trafficking to the lungs, which are controlled by the expression of multiple cytokines and chemokines, may be ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.2K Views.  West Virginia University. Questo protocollo descrive l'uso della citometria a flusso per identificare i cambiamenti nella composizione delle cellule immunitarie, nel profilo delle citochine e nel profilo delle chemochine nell'ambiente polmonare dopo occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media, un modello murino di ictus ischemico.

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Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, including signaling, cytoskeletal remodeling, regulation of gene expression, apoptosis and cell cycle progression 1. Calpains have been implicated in many pathologies including muscular dystrophies, cancer, diabetes, Alzheimer's disease and multiple sclerosis 1. Calpain regulation is complex and incompletely understood. mRNA and protein levels correlate poorly with activity, limiting the use of gene or protein expression techniques to measure calpain activity. This video protocol details a flow cytometric assay developed in our laboratory for measuring calpain activity in fixed and living cells. This method uses the fluorescent substrate BOC-LM-CMAC, which is cleaved specifically by calpain, to measure calpain activity. 2 In this video, calpain activity in fixed and living murine 32Dkit leukemia cells, alone or as part of a splenocyte population is measured using an LSRII (BD Bioscience). 32Dkit cells are shown to have elevated activity compared to normal splenocytes.

This article will detail the protocol for measuring calpain activity in fixed and living cells using flow cytometry.

Misurazione dell&#39;attività Calpain nelle celle fissi e Living in citometria a flusso

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between liver sinusoidal endothelial cells and hepatocytes1,2. Stellate cells are derived from bone marrow precursors and store up to 80% of the total body vitamin A1, 2. Upon activation, stellate cells differentiate into myofibroblasts to produce extracellular matrix, thus contributing to liver fibrosis3. Based on their ability to contract, myofibroblastic stellate cells can regulate the vascular tone associated with portal hypertension4. Recently, we demonstrated that hepatic stellate cells are potent antigen presenting cells and can activate NKT cells as well as conventional T lymphocytes5. 

 Here we present a method for the efficient preparation of hepatic stellate cells from mouse liver. Due to their perisinusoidal localization, the isolation of hepatic stellate cells is a multi-step process. In order to render stellate cells accessible to isolation from the space of Disse, mouse livers are perfused in situ with the digestive enzymes Pronase E and Collagenase P. Following perfusion, the liver tissue is subjected to additional enzymatic treatment with Pronase E and Collagenase P in vitro. Subsequently, the method takes advantage of the massive amount of vitamin A-storing lipid droplets in hepatic stellate cells. This feature allows the separation of stellate cells from other hepatic cell types by centrifugation on an 8% Nycodenz gradient. The protocol described here yields a highly pure and homogenous population of stellate cells. Purity of preparations can be assessed by staining for the marker molecule glial fibrillary acidic protein (GFAP), prior to analysis by fluorescence microscopy or flow cytometry. Further, light microscopy reveals the unique appearance of star-shaped hepatic stellate cells that harbor high amounts of lipid droplets. 


 Taken together, we present a detailed protocol for the efficient isolation of hepatic stellate cells, including representative images of their morphological appearance and GFAP expression that help to define the stellate cell entity.

Here we describe a method for the isolation of hepatic stellate cells from mouse liver. For stellate cell purification, mouse livers are digested in situ and in vitro by pronase-collagenase treatment prior to density gradient centrifugation. This technique yields highly pure hepatic stellate cells.

Sette passi per Stellate Cellule

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is a common modifier of heart and lung function, by elaborating cellular infiltration, production of cytokines and growth factors, and by initiating remodeling processes 1.
Compared to the left ventricle, the right ventricle is a low-pressure pump that operates in a relatively narrow zone of pressure changes. Increased pulmonary artery pressures are associated with increased pressure in the lung vascular bed and pulmonary hypertension 2. Pulmonary hypertension is often associated with inflammatory lung diseases, for example chronic obstructive pulmonary disease, or autoimmune diseases 3. Because pulmonary hypertension confers a bad prognosis for quality of life and life expectancy, much research is directed towards understanding the mechanisms that might be targets for pharmaceutical intervention 4. The main challenge for the development of effective management tools for pulmonary hypertension remains the complexity of the simultaneous understanding of molecular and cellular changes in the right heart, the lungs and the immune system.
Here, we present a procedural workflow for the rapid and precise measurement of pressure changes in the right heart of mice and the simultaneous harvest of samples from heart, lungs and immune tissues. The method is based on the direct catheterization of the right ventricle via the jugular vein in close-chested mice, first developed in the late 1990s as surrogate measure of pressures in the pulmonary artery5-13. The organized team-approach facilitates a very rapid right heart catheterization technique. This makes it possible to perform the measurements in mice that spontaneously breathe room air. The organization of the work-flow in distinct work-areas reduces time delay and opens the possibility to simultaneously perform physiology experiments and harvest immune, heart and lung tissues.
The procedural workflow outlined here can be adapted for a wide variety of laboratory settings and study designs, from small, targeted experiments, to large drug screening assays. The simultaneous acquisition of cardiac physiology data that can be expanded to include echocardiography5,14-17 and harvest of heart, lung and immune tissues reduces the number of animals needed to obtain data that move the scientific knowledge basis forward. The procedural workflow presented here also provides an ideal basis for gaining knowledge of the networks that link immune, lung and heart function. The same principles outlined here can be adapted to study other or additional organs as needed.

A specific and rapid protocol to simultaneously investigate right heart function, lung inflammation, and the immune response is described as a learning tool. Video and figures describe physiology and microdissection techniques in an organized team-approach that is adaptable to be used for small to large sized studies.

Ventricolo destro di pressione sistolica Misure in combinazione con raccolta di campioni di tessuto polmonare e immunitaria nei topi

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

Isolamento di tessuto adiposo cellule immunitarie

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

Indagare gli effetti dei probiotici sul pneumococcico colonizzazione utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Aderenza Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

We have established a technique for the isolation, phenotypic characterization and functional analysis of immune cells from murine gingiva.

Isolamento, caratterizzazione e esame funzionale della cella di rete gengivale immunitario

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...