Name: characterization of immune cells and proinflammatory mediators in the pulmonary environment
Uploaded: 2020-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
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この研究は、NIH助成金P20 GM109098とプラエスペロからエドウィン・ワンへのイノベーション賞プログラムによって支援されました。フローサイトメトリー実験は、NIH助成金S10 OD016165、U57 GM104942、P30 GM103488、およびP20 GM103434によってサポートされているWVUフローサイトメトリー&シングルセルコア施設で実施されました。

実施されたすべてのプロトコルと手順は、ウェストバージニア大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。マウスを、ウェストバージニア大学のビバリウム中の特異的病原体フリー条件下で飼育した。
1. 溶液の調製
<ol><li>灌流緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水、PBS)を調製する。マウス1匹あたり約2つの氷冷PBSの10mLアリコートを使用する。</li>
	<li>肺細胞培地/FACSバッファーを調製する。FACS緩衝液は、1%ウシ胎児血清(FBS)を添加したPBSを含有する。肺の切除と移動の全プロセスのために培地を冷たく保ちます。肺サンプルあたり約8mLを調製する。実験前に新鮮な培地/FACSバッファーを調製してください。</li>
	<li>単一細胞単離のための解離バッファーを調製する。緩衝液は、ハンクス緩衝塩溶液(HBSS)中に1mg/mLコラゲナーゼDおよび200μg/mLDNase Iを含有する。実験前に、原液(100 mg/mL コラゲナーゼ D および 10 mg/mL DNase I) から新鮮に調製します。肺サンプルあたり約6mLが必要です。使用前にバッファが室温に達していることを確認してください。</li>
	<li>肺組織均質化のための均質化緩衝液を調製する。緩衝液は、PBSおよび1xプロテイナーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル(ストック=100x)を含有する。実験前に新たに準備してください。均質化プロセス全体を通してバッファーを冷たく保ちます。約200μLの緩衝液は、肺の単一の右葉を均質化するのに十分である。</li>
</ol>2.一過性中大脳動脈閉塞(tMCAO)
注:中大脳動脈へのモノフィラメント挿入を介したtMCAOの手順は、以前に詳細に文書化されていました10。これらの実験では、体重25〜30gの8〜12週齢の雄性C57BL/6Jマウスを使用した。
<ol><li>簡単に言えば、手術前にマウスに2mg / kgメロキシカムを皮下投与する。 5%イソフルランを用いて誘導チャンバー内でマウスを深く麻酔する。つま先ピンチ法で深麻酔を確認します。鼻錐を使用して手術中に1〜2%のイソフルランで麻酔を維持します。マウスの下に暖かい毛布を置いて、手順を通して体温を36.5〜38°Cに保ちます。すべての手術器具は、手術の前日にオートクレーブ滅菌する必要があります。</li>
	<li>70%エタノールとそれに続くクロルヘキシジンスクラブを使用して腹側頸部の皮膚を剃り、準備する。最初の切開を行う前に、切開領域に2mg / kgのブピバカインを皮下投与する。乾燥を防ぐために目を覆うために眼軟膏を使用してください。正中線頸部切開を行います。気管の周りの柔らかい組織を静かに脇に引っ張ります。</li>
	<li>左総頚動脈と外頸動脈を特定します。</li>
	<li>血液の流れを止めるために、総頸動脈に一時的な縫合糸(サイズ6/0)を塗布する。外頸動脈を切開する。</li>
	<li>シリコーンゴムコーティングされたモノフィラメント(サイズ6-0)を外頸動脈に挿入し、モノフィラメントを中大脳動脈に進める。モノフィラメントを中大脳動脈に60分間放置する(閉塞)。</li>
	<li>レーザードップラー流量測定を使用して血流速度を監視します。中大脳動脈への流量が>80%減少したことは、閉塞が成功したことを示す。</li>
	<li>60分間の閉塞に続いて、モノフィラメントを取り出し、再灌流が起こるようにする。切開部を閉じます。</li>
	<li>偽手術マウスでは、モノフィラメントを挿入せずにステップ2.1〜2.6を実行する。これらのマウスでは、血流の速度は、手順全体を通して安定したままであるべきです。</li>
	<li>マウスを毎日モニターし、標準的なスコアリング基準11を使用して神経学的欠損を測定する。0 – 神経学的欠陥なし;1 – 尾によって持ち上げられたときに対側前足を引っ込めます;尾によって持ち上げられたときの対側への2-円;3-歩行中に対側に落ちる。4 – 自発的に歩かないか、昏睡状態です;5 - 死んだ。</li>
	<li>手術後3日間、24時間ごとに通常の生理食塩水と鎮痛剤(メロキシカム、2mg / kg)の皮下注射を行います。</li>
	<li>下流分析のためにtMCAOの24時間および72時間後に肺を単離する。</li>
</ol>3.肺組織の収穫
<ol><li>100mg/kgのケタミンおよび10mg/kgのキシラジンの腹腔内(すなわち)注射により、マウスを深く麻酔する。つま先ピンチ法で深麻酔を確認します。</li>
	<li>全身心経灌流12を行うには、マウスを手術台にピン留めし、70%エタノールで毛皮を濡らして体腔内への毛皮分布を減少させる。細かい解剖はさみを使用して、尾腹部に横方向の切開を行い、次に腹膜の正中線切開を行い、横隔膜を突き刺す前に胸腔で止まる。<ol><li>筋肉を切断したり、腹腔に隠れたり、腹部を過ぎて切開を続けたりしないでください。</li>
	</ol></li>
	<li>横隔膜を穿刺する前に胸腔に到達したらすぐに切開を停止します。灌流の質や細胞の回復を損なう可能性のある心臓や肺を傷つけないように注意してください</li>
	<li>細かい解剖はさみを使用して、横隔膜を突き刺す前に胸腔で止まる腹膜の正中線切開を行う。</li>
	<li>鉗子を使用して胸骨の遠位端でマウスをつかみ、心臓、肺、または血管系を傷つけないように横隔膜を切り裂きながら上に持ち上げます。臓器が見えたら、胸郭を切開し、心臓と肺が完全に露出するようにリブケースを分離してピン留めします。</li>
	<li>大動脈弓の近くの右心房に慎重に小さな切開をしてください。これは灌流のための流出として役立つでしょう。</li>
	<li>その直後に、10mLの冷たいPBSを充填したシリンジに取り付けられた25G x 5/8針を左心室の遠位上面に静かに挿入する。心室中隔を通って右心室に挿入しないように注意してください。針は左心室にかろうじて挿入する必要があります。 注:心室中隔が穿孔されている場合、マウスの鼻から液体が飛び出します。これは灌流の質を低下させ、細胞損失をもたらす。</li>
	<li>所望により、灌流中に針を左心室内の所定の位置にしっかりと保持するためにクランプが使用され得る。</li>
	<li>10mLの冷たいPBSを着実に、しかし穏やかに心臓に押し込みます。マウス組織は、体液が右心房から出るにつれて血液を灌流し、一掃し始めるべきである。<ol><li>十分な血液クリアランスが生じるまで、PBSの10mLの第2アリコートを押す。肝臓は明るい茶色の外観を持ち、肺は赤みがかったピンク色からほとんどが白色に変わります。</li>
	</ol></li>
	<li>鉗子と細かい解剖はさみを使って、心臓、気管、食道、胸腺、結合組織、リンパ節、大きな気管支など、周囲の組織をすべて慎重に取り除きます。</li>
	<li>個々の肺葉を分離し、1〜2mLの冷肺細胞培地のアリコートを含む氷上のシャーレに葉を置く。</li>
</ol>4. ビーズホモジナイザーを用いたマルチプレックスビーズアレイの肺組織の均質化
<ol><li>滅菌2.3 mmジルコニア/シリカビーズ3個を含む2 mL円錐形スクリューキャップチューブを事前に冷却します。200 μLの冷ホモジナイズバッファーをチューブに加えます。</li>
	<li>ローブを秤量し、ビーズおよび均質化緩衝液を含む予め冷却された円錐管にローブを移す。 注:200 μLのバッファーでホモジナイズされた約50〜100 mgの組織で十分であり、サンプル中のサイトカインおよびケモカイン発現を検出するのに十分です。<ol><li>ビーズベースのホモジナイザー( 材料表を参照)を使用して、4,000rpmで2分間ローブを均質化します。</li>
		<li>組織が完全に均質化されていることを確認します。必要に応じて時間を増やします。</li>
	</ol></li>
	<li>均質化に続いて、チューブを予め冷却した(4°C)マイクロ遠心分離機中で15,870 x g で3分間遠心分離する。</li>
	<li>上清を予め冷却した1.5mLマイクロチューブに移す。</li>
	<li>すぐに使用できるようにサンプルを氷の上に直接置くか、将来の使用のためにサンプルを-80°Cで保管してください。複数の凍結融解サイクルは避けてください。</li>
</ol>5. 肺組織の解離と単一細胞の単離
<ol><li>肺細胞培地を注ぎ、残りの肺葉の解離緩衝液の希釈を避ける。次いで、1mLの解離緩衝液を含む25Gおよび5/8針を含む1mLシリンジを肺組織に慎重に挿入する。</li>
	<li>解離バッファーの小さな画分(約1/4~ 1/5番目)を各肺葉に注入し、穏やかに膨らませます。 注:ほとんどのバッファは、ローブが切除されているため、膨らんだ直後に飛び出します。</li>
	<li>解離緩衝液の注入を1〜2倍繰り返す。</li>
	<li>肺葉を解離緩衝液と共に室温で2分間インキュベートする。</li>
	<li>細かい解剖はさみを使用して肺葉を細かく刻みます。</li>
	<li>解離バッファーでミンチした肺片を15 mL遠沈管に移します。 追加の解離緩衝液を合計6mLまで補充する。1分間激しく渦を巻きます。</li>
	<li>サンプルを37°Cで45分間インキュベートする。 渦は7〜8分ごとに激しくなります。</li>
	<li>45分間のインキュベーション後、最適な結果を得るためにサンプルを1分間激しく渦巻きます。</li>
	<li>さらに、100μmの細胞ストレーナーを通過することによってサンプルを解離させ、残留組織、望ましくない結合組織、および間質組織を除去する。</li>
	<li>サンプルを380 x gで10分間遠心分離し、上清を捨てる。</li>
	<li>5 mLの冷肺細胞培地をサンプルに加える。穏やかなボルテックスによって細胞ペレットを再懸濁する。</li>
	<li>サンプルを380 x gで10分間遠心分離し、上清を捨てる。</li>
	<li>1mLの冷肺細胞培地を加える。穏やかなボルテックスによって細胞ペレットを再懸濁する。</li>
	<li>100μmのセルストレーナーを通過し、細胞を数えます。</li>
</ol>6. 肺免疫細胞ニッチのフローサイトメトリー解析
<ol><li>種子1-2 x 106個の細胞/抗体を96 ウェルの丸底プレート(合計3セット)にセットします。細胞を830 x gで3分間遠心分離する。上清を捨てる。</li>
	<li>細胞ペレットを、固定可能な生/死垢を含む50μLの冷PBSに再懸濁する。製造元の指示に従って汚れを準備します。</li>
	<li>細胞を4°Cで20分間インキュベートし、光から保護します。細胞を830 x gで3分間遠心分離する。上清を捨てる。</li>
	<li>5 μg/mL の抗マウス CD16/32 抗体を含む 25 μL の低温 FACS バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。4°Cで10〜15分間インキュベートする。</li>
	<li>表1に列挙した抗体組合せを含む25μLの低温FACS緩衝液を細胞に加える。穏やかなピペッティングで混ぜる。 注:抗体染色用のFACSバッファーの総容量は50 μLです。したがって、25 μLの抗体のマスターミックスを調製する場合、抗体の濃度は最終濃度の2倍にする必要があります。</li>
	<li>細胞を4°Cで20分間インキュベートし、光から保護します。細胞を830 x gで3分間遠心分離する。上清を捨てる。</li>
	<li>細胞を100 μLの低温FACSバッファーで再懸濁します。細胞を830 x gで3分間遠心分離する。上清を捨てる。</li>
	<li>細胞を100 μLの低温FACSバッファーで再懸濁します。追加のFACsバッファーを150 μL含むポリスチレン製丸底5 mL FACSチューブに移します。フローサイトメーターを用いて直ちに試料を分析する。 注:次の手順を使用した細胞固定により、サンプルを後で分析できます。</li>
	<li>ステップ6.7に続いて、PBS中の1%パラホルムアルデヒド100μLでサンプルを再懸濁する。</li>
	<li>サンプルを4°Cで15分間インキュベートし、光から保護します。細胞を830 x gで3分間遠心分離する。上清を捨てる。</li>
	<li>細胞を100 μLの低温FACSバッファーで再懸濁します。細胞を830 x gで3分間遠心分離する。上清を捨てる。</li>
	<li>細胞を100 μLの低温FACSバッファーで再懸濁します。セルを4°Cで保管し、光から保護します。72時間以内にサンプルを分析します。</li>
</ol>7. サイトカインおよびケモカイン検出のためのマルチプレックスビーズアレイ
注:市販の炎症誘発性ケモカインおよび炎症多重パネル( 材料表を参照)を使用して、詳細に記載されている製造業者のプロトコールに従ってtMCAO誘導後の肺におけるケモカインおよびサイトカインの発現を決定した13。
<ol><li>簡単に言えば、分析種が組織均質化後に-80°Cで保存された場合、氷上で解凍する。使用前にサンプルを590 x g で4°Cで2分間遠心分離し、残留組織を除去します。</li>
	<li>既知の濃度 10 ng/mL の標準カクテル (C7) を 7 つの標準物質 (C1-6) に段階的に希釈し、最後の標準をアッセイバッファーのみ (C0) にして、標準曲線を生成します。</li>
	<li>すべての試薬が室温まで温まったら、各標準物質25 μLおよびアッセイバッファー25 μLをV底96ウェルプレートに加えます。</li>
	<li>各サンプルウェルに、25 μLの肺ホモジネート(検体)と25 μLのアッセイバッファーをV底96ウェルプレートに加えます。</li>
	<li>プレコートビーズを激しくボルテックスし、次いで25μLのプレコートビーズを標準ウェルおよびサンプルウェルのそれぞれに加える。</li>
	<li>プレートを密封し、ホイルで覆って光から保護します。プレートを室温で110rpmで2時間振る。</li>
	<li>230 x g で5分間遠心分離する。200 μLの洗浄バッファーを1xで加えます(原液は20x、水で1xに希釈します)。1分間インキュベートする。</li>
	<li>230 x g で5分間遠心分離する。標準物質とサンプルを25 μLの検出抗体で再懸濁します。</li>
	<li>光から保護するためにプレートを密封して覆います。プレートを110rpmで室温で1時間振盪する。</li>
	<li>25 μLのストレプトアビジン-フィコエリスリン(SA-PE)を各標準物質に加え、ウェルをサンプリングする。</li>
	<li>光から保護するためにプレートを密封して覆います。室温で110rpmで30分間振盪する。</li>
	<li>プレートを230 x g で5分間回転させます。標準品とサンプルを1x洗浄バッファーに再懸濁します。</li>
	<li>追加の150 μLの1x洗浄バッファーを含む、十分に標識されたポリスチレン丸底5 mL FACSチューブに移します。</li>
	<li>フローサイトメーターを用いて標準物質および試料についてのPEシグナル蛍光強度を決定する。</li>
	<li>予め決定された濃度に対するPEの平均蛍光強度(MFI)を用いて、各ケモカインおよびサイトカインの標準曲線を構築する。</li>
	<li>各試料からの標準曲線およびMFIを用いて各ケモカインおよびサイトカインの濃度を決定する。マルチプレックスパネルは、各分析物の濃度を決定するために使用できるデータ分析ソフトウェアを提供します。頂端/上葉の重量は、組織のミリグラムあたりのサイトカインまたはケモカインの濃度を決定するために使用されます。</li>
</ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-1&#946;,+IL-4+and+IL-12+control+the+fate+of+group+2+innate+lymphoid+cells+in+human+airway+inflammation+in+the+lungs.">IL-1&#946;, IL-4 and IL-12 control the fate of group 2 innate lymphoid cells in human airway inflammation in the lungs.</a> Nature Immunology. 17 (6), 636-645 (2016).</li><li>Nakasone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+gamma/delta+T+cells+in+the+lungs+and+their+roles+in+neutrophil-mediated+host+defense+against+pneumococcal+infection.">Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection.</a> Microbes Infection. 9 (3), 251-258 (2007).</li></ol>

著者らには開示するものは何もありません。

ここで説明するプロトコールは、肺免疫細胞型の同定および同じマウスにおけるケモカインまたはサイトカインの発現を可能にする。組織病理学研究が必要な場合は、単一細胞単離ステップに進む前に、その目的のために個々の葉を除去して固定することができる。この方法の1つの制限は、免疫細胞組成の変化およびケモカインおよび/またはサイトカインの発現が肺の異なる葉間で不均等?...

肺はバリア器官であり、外部環境にさらされているため、病原体やアレルゲンなどの免疫学的課題を絶えず受けています1。肺環境から病原体を除去するためには、肺常在免疫細胞の活性化と末梢からの免疫細胞の浸潤が必要です。さらに、肺常在性免疫細胞は共生細菌に対する耐性を維持しており、これらの細胞が病原体のクリアランスおよび恒常性の維持に役割を果たしていることを示唆している1。肺胞マクロファージおよび間質マクロファージは、パターン認識受容体を介して病原体を感知し、貪食作用によってこれらの病原体をクリアする肺常在性センチネル免疫細胞の1つです2。肺常在樹状細胞は、抗原提示を介して自然免疫応答と適応免疫応答を橋渡しする 3.また、活性化された局所自然免疫細胞は、炎症反応を増幅し、単球、好中球、リンパ球などの免疫細胞の肺への浸潤を刺激するサイトカインやケモカインを産生する1。虚血性脳卒中は、全身性免疫を改変し、肺感染症に対する感受性の増加につながることが示されている;しかし、虚血性脳卒中後の肺区画を評価した研究はほとんどないが、炎症状態4,5,6,7,8,9の間にそれを調べた研究もある。本明細書に記載される方法の目標は、肺病理、免疫細胞組成、ならびに肺におけるサイトカインおよびケモカイン発現のレベルを同時に決定して、肺区画への変化を評価し、虚血発作後の肺免疫応答への潜在的な変化を評価することである。
ここに記載するのは、13種類の免疫細胞を同定するためにマウスの肺から単一細胞懸濁液を得るためのプロトコールである。このプロトコルは、自動化された組織解離器を必要とせずに、コラゲナーゼDによる組織消化に基づいています。さらに、フローサイトメトリーベースのマルチプレックスビーズアレイを使用して、13種類のサイトカインまたはケモカインの発現レベルを決定するために使用できる組織ホモジネートを調製するプロトコルを開発しました。このプロトコルは、虚血性脳卒中が肺免疫に及ぼす影響を調査するために首尾よく使用され、他の疾患モデルでも使用することができる。

<table><tbody><tr><td>B220-APC, clone RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103212</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Beadbug 3 position bead homogenizer</td><td>Benchmark Scientific</td><td>D1030</td><td>Tissue homogenizer</td></tr><tr><td>CCR2-BV421, clone SA203G11</td><td>Biolegend</td><td>150605</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>CD103-BV421, clone 2E7</td><td>Biolegend</td><td>121422</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>CD11b-PE/Cy7, clone M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>1:400 dilution</td></tr><tr><td>CD11c-PE/Cy7, clone N418</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418</td><td>Biolegend</td><td>117328</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>CD4-BV421, clone GK1.5</td><td>Biolegend</td><td>100443</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>CD45-FITC, clone 30-F11</td><td>Biolegend</td><td>103108</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>CD64-APC, clone X54-5/7.1</td><td>Biolegend</td><td>139306</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>CD8-PE, clone 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100708</td><td>1:800 dilution</td></tr><tr><td>Collagenase D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11088882001</td><td>Component in the dissociation buffer</td></tr><tr><td>Conical screw cap tube</td><td>ThermoFisher</td><td>02-681-344</td><td>Tube for tissue homogenization</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10104159001</td><td>Component in the dissociation buffer</td></tr><tr><td>Fc block CD16/32 antibody</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>genlteMACS dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator</td></tr><tr><td>gentleMACS C tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator</td></tr><tr><td>Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial</td><td>ThermoFisher</td><td>78442</td><td>Component in the homogenization buffer</td></tr><tr><td>Laser doppler monitor</td><td>Moor</td><td>MOORVMS-LDF</td><td>Blood flow monitoring during tMCAO</td></tr><tr><td>LEGENDplex proinflammatory chemokine panel</td><td>Biolegend</td><td>740451</td><td>Multiplex bead array</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD fixable near-IR stain</td><td>ThermoFisher</td><td>L34976</td><td>Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis</td></tr><tr><td>Ly6C-PE, clone HK1.4</td><td>Biolegend</td><td>128008</td><td>1:800 dilution</td></tr><tr><td>Ly6G-BV510, clone 1A8</td><td>Biolegend</td><td>127633</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>MCAO suture L56 reusable 6-0 medium</td><td>Doccol</td><td>602356PK10Re</td><td>tMCAO</td></tr><tr><td>MHC II-BV510, clone M5/114.15.2</td><td>Biolegend</td><td>107636</td><td>1:800 dilution</td></tr><tr><td>NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136</td><td>Biolegend</td><td>108728</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Siglec F-PE, clone E50-2440</td><td>BD Biosciences</td><td>552126</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Silk suture thread, size 6/0</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-60</td><td>tMCAO</td></tr><tr><td>SomnoSuite anesthesia system</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td>Mouse anaesthetization for tMCAO</td></tr><tr><td>TCRb-BV510, clone H57-897</td><td>Biolegend</td><td>109234</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Zirconia/silica beads, 2.3 mm</td><td>Biospec</td><td>11079125z</td><td>Beads for tissue homogenization</td></tr></tbody></table>

characterization of immune cells and proinflammatory mediators in the pulmonary environment

複数のサイトカインおよびケモカインの発現によって制御される免疫細胞の増殖、活性化、および肺への輸送は、重度の脳損傷によって変化し得る。これは、肺炎が虚血性脳卒中に罹患した患者の死亡の主な原因であるという事実によって証明される。このプロトコルの目的は、一過性中脳動脈閉塞による虚血性脳卒中誘導後の肺胞マクロファージ、間質マクロファージ、CD103+またはCD11b+樹状細胞(DC)、形質細胞様DC、好酸球、単球/単球由来細胞、好中球、リンパ球由来TおよびB細胞、NK細胞、およびNKT細胞を含む、マウスの肺における13種類の免疫細胞を同定するための多色フローサイトメトリー分析の使用を記述することである。さらに、ビーズホモジナイゼーション法を用いた肺ホモジネートの調製について記載し、フローサイトメトリー分析と結合したマルチプレックスビーズアレイによって13種類のサイトカインまたはケモカインの発現レベルを同時に決定する。このプロトコルはまた、感染性肺疾患またはアレルギー性疾患などの他の疾患設定における肺免疫応答を調査するためにも使用することができる。

我々は最近、マウスにおける虚血性脳卒中誘導が肺の免疫細胞組成を変化させることを報告した11。具体的には、一過性脳虚血は肺胞マクロファージ、好中球、およびCD11b+ DCの割合を増加させ、肺区画内のCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、B細胞、NK細胞、および好酸球の割合を減少させた。さらに、細胞の変化は、肺における複数のケモカインの有意な減少レベルに対応していた。こ?...

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Characterization of Immune Cells and Proinflammatory Mediators in the Pulmonary Environment

このプロトコルは、虚血性脳卒中のマウスモデルである一過性中大脳動脈閉塞後の肺環境における免疫細胞組成、サイトカインプロファイル、およびケモカインプロファイルの変化を同定するためのフローサイトメトリーの使用を記載している。

肺環境における免疫細胞および炎症誘発性メディエーターの特性評価

Immune cell expansion, activation, and trafficking to the lungs, which are controlled by the expression of multiple cytokines and chemokines, may be ...

characterization-immune-cells-proinflammatory-mediators-pulmonary

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.2K ビュー.  West Virginia University. このプロトコルは、虚血性脳卒中のマウスモデルである一過性中大脳動脈閉塞後の肺環境における免疫細胞組成、サイトカインプロファイル、およびケモカインプロファイルの変化を同定するためのフローサイトメトリーの使用を記載している。

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Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in peripheral tissues in steady state; however in response to antigen stimulation, DCs take up the antigen and rapidly migrate to the draining lymph nodes where they initiate T cell response against the antigen1,2. Additionally, DCs also play a key role in initiating autoimmune as well as allergic immune response3.
DCs play an essential role in both initiation of immune response and induction of tolerance in the setting of lung environment4. Lung environment is largely tolerogenic, owing to the exposure to vast array of environmental antigens5. However, in some individuals there is a break in tolerance, which leads to induction of allergy and asthma. In this study, we describe a strategy, which can be used to monitor airway DC maturation and migration in response to the antigen used for sensitization. The measurement of airway DC maturation and migration allows for assessment of the kinetics of immune response during airway allergic inflammation and also assists in understanding the magnitude of the subsequent immune response along with the underlying mechanisms.
Our strategy is based on the use of ovalbumin as a sensitizing agent. Ovalbumin-induced allergic asthma is a widely used model to reproduce the airway eosinophilia, pulmonary inflammation and elevated IgE levels found during asthma6,7. After sensitization, mice are challenged by intranasal delivery of FITC labeled ovalbumin, which allows for specific labeling of airway DCs which uptake ovalbumin. Next, using several DC specific markers, we can assess the maturation of these DCs and can also assess their migration to the draining lymph nodes by employing flow cytometry.

We describe a strategy to monitor maturation and migration of pulmonary dendritic cells in response to ovalbumin in the setting of ovalbumin induced allergic airway inflammation. This strategy can be modified to assess migration of pulmonary dendritic cells in settings of infection.

アレルギー性​​気道炎症時の肺樹状細胞の成熟および移行の解析

Dendritic cells (DCs) are the key players involved in initiation of adaptive immune response by activating antigen-specific T cells. DCs are present in ...

免疫・感染学

A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models of ALI are key in enhancing our understanding of disease pathogenesis. Lipopolysaccharide (LPS) derived from gram positive bacteria induces neutrophilic inflammation in the airways and lung parenchyma of mice. Efficient pulmonary delivery of compounds such as LPS is, however, difficult to achieve. In the approach described here, pulmonary delivery in mice is achieved by challenge to aerosolized Pseudomonas aeruginosa LPS. Dissolved LPS was aerosolized by a nebulizer connected to compressed air. Mice were exposed to a continuous flow of LPS aerosol in a Plexiglas box for 10 min, followed by 2 min conditioning after the aerosol was discontinued. Tracheal intubation and subsequent bronchoalveolar lavage, followed by formalin perfusion was next performed, which allows for characterization of the sterile pulmonary inflammation. Aerosolized LPS generates a pulmonary inflammation characterized by alveolar neutrophilia, detected in bronchoalveolar lavage and by histological assessment. This technique can be set up at a small cost with few appliances, and requires minimal training and expertise. The exposure system can thus be routinely performed at any laboratory, with the potential to enhance our understanding of lung pathology.

We describe a method for inducing neutrophilic pulmonary inflammation by challenge to aerosolized lipopolysaccharide by nebulization, to model acute lung injury. In addition, basic surgical techniques for lung isolation, tracheal intubation and bronchoalveolar lavage are also described.

エアロゾル化リポ多糖を使用して生成肺好中球増加のための方法

Acute lung injury (ALI) is a severe disease characterized by alveolar neutrophilia, with limited treatment options and high mortality. Experimental models ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

炎症性細胞の浸潤を分析するための肺胞の気管支肺胞洗浄

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

IL-8トランジェントトランスジェニックマウスモデル<em&gt;インビボ</em&gt;炎症反応の長期モニタリング

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Identification and Characterization of Immunogenic RNA Species in HDM Allergens that Modulate Eosinophilic Lung Inflammation

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses and microbial substances that induce innate immune responses. These allergen-associated microbial components play an important role in regulating the development of type 2 inflammatory conditions such as allergic asthma. However, the underlying mechanisms remain largely undefined. The protocol presented here determines the structural characteristics and in vivo activity of allergen-associated immunostimulatory RNA. Specifically, common allergens are examined for the presence of double-stranded RNA (dsRNA) species that can stimulate IFN responses in lungs and restrain&#160;the development of severe lung eosinophilia in a mouse model of HDM-induced allergic asthma. Here, we have included the following three assays: Dot blot to show the dsRNA structures in total RNA isolated from allergens including HDM species, RT-qPCR to measure the activities of HDM RNA in interferon stimulating genes (ISGs) expression in mouse lungs and FACS analysis to determine the effects of HDM RNA on the number of eosinophils in BAL and lung, respectively.

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) often contain microbial substances that activate innate immune responses to regulate allergic inflammation. The protocol presented here demonstrates the identification of dsRNA species in HDM allergens and characterization of their immunogenic activities in modulating eosinophilic lung inflammation.

好酸球性肺炎症を調節するHDMアレルゲンにおける免疫原性RNA種の同定と特性評価

Environmental allergens such as house dust mites (HDM) are often in complex forms containing both allergic proteins that drive aberrant type 2 responses ...

Visualizing Lung Cellular Adaptations during Combined Ozone and LPS Induced Murine Acute Lung Injury

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or fungal) inflammatory conditions. An overwhelming host response may result in compromised respiration and acute lung injury, which is characterized by lung neutrophil recruitment as a result of the patho-logical host immune, coagulative and tissue remodeling response. Sensitive microscopic methods to visualize and quantify murine lung cellular adaptations, in response to low-dose (0.05 ppm) ozone, a potent environmental pollutant in combination with bacterial lipopolysaccharide, a TLR4 agonist, are crucial in order to understand the host inflammatory and repair mechanisms. We describe a comprehensive fluorescent microscopic analysis of various lung and systemic body compartments, namely the broncho-alveolar lavage fluid, lung vascular perfusate, left lung cryosections, and sternal bone marrow perfusate. We show damage of alveolar macrophages, neutrophils, lung parenchymal tissue, as well as bone marrow cells in correlation with a delayed (up to 36-72 h) immune response that is marked by discrete chemokine gradients in the analyzed compartments. In addition, we present lung extracellular matrix and cellular cytoskeletal interactions (actin, tubulin), mitochondrial and reactive oxygen species, anti-coagulative plasminogen, its anti-angiogenic peptide fragment angiostatin, the mitochondrial ATP synthase complex V subunits, &#945; and &#946;. These surrogate markers, when supplemented with adequate in vitro cell-based assays and in vivo animal imaging techniques such as intravital microscopy, can provide vital information towards understanding the lung response to novel immunomodulatory agents.

Combined ozone and bacterial endotoxin exposed mice show wide-spread cell death, including that of neutrophils. We observed cellular adaptations such as disruption of cytoskeletal lamellipodia, increased cellular expression of complex V ATP synthase subunit &#946; and angiostatin in broncho-alveolar lavage, suppression of the lung immune response and delayed neutrophil recruitment.

オゾンとLPS誘発マウス急性肺損傷時の肺細胞適応の可視化

Lungs are continually faced with direct and indirect insults in the form of sterile (particles or reactive toxins) and infectious (bacterial, viral or ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

In Vivo 光シート顕微鏡観察に基づくアレルギー性炎症の実験的肺ホーミング ヒトリンパ球のイメージング高度な

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

医学

Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while suppressing unwanted reactions to environmental antigens. Lungs host several populations of innate and adaptive immune cells that provide immune surveillance but also mediate protective immune responses. These cells, which keep the healthy pulmonary immune system in balance, also participate in several pathological conditions such as asthma, infections, autoimmune diseases, and cancer. Selective expression of surface and intracellular proteins provides unique immunophenotypic properties to the immune cells of the lung. Consequently, flow cytometry has an instrumental role in the identification of such cell populations during steady-state and pathological conditions. This paper presents a protocol that describes a consistent and reproducible method to identify the immune cells that reside in the lungs of healthy mice under steady-state conditions. However, this protocol can also be used to identify changes in these cell populations in various disease models to help identify disease-specific changes in the lung immune landscape.

In this study, we present an effective and reproducible protocol to isolate the immune populations of the murine respiratory system. We also provide a method for the identification of all innate and adaptive immune cells that reside in the lungs of healthy mice, using a 9-color-based flow cytometry panel.

マウス肺の自然免疫細胞および適応免疫細胞の同定のためのフローサイトメトリー分析

The respiratory tract is in direct contact with the outside environment and requires a precisely regulated immune system to provide protection while ...

肺環境における免疫細胞および炎症誘発性メディエーターの特性評価

要約

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アレルギー性気道炎症時の肺樹状細胞の成熟および移行の解析

エアロゾル化リポ多糖を使用して生成肺好中球増加のための方法

炎症性細胞の浸潤を分析するための肺胞の気管支肺胞洗浄

IL-8トランジェントトランスジェニックマウスモデル

体内上部気道免疫メディエーターレベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

好酸球性肺炎症を調節するHDMアレルゲンにおける免疫原性RNA種の同定と特性評価

オゾンとLPS誘発マウス急性肺損傷時の肺細胞適応の可視化

In Vivo 光シート顕微鏡観察に基づくアレルギー性炎症の実験的肺ホーミングヒトリンパ球のイメージング高度な

マウス肺の自然免疫細胞および適応免疫細胞の同定のためのフローサイトメトリー分析

肺環境における免疫細胞および炎症誘発性メディエーターの特性評価

要約

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アレルギー性​​気道炎症時の肺樹状細胞の成熟および移行の解析

エアロゾル化リポ多糖を使用して生成肺好中球増加のための方法

炎症性細胞の浸潤を分析するための肺胞の気管支肺胞洗浄

IL-8トランジェントトランスジェニックマウスモデル

体内上部気道免疫メディエーター レベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

離とマウスとヒトの肺胞マクロファージの体外培養

好酸球性肺炎症を調節するHDMアレルゲンにおける免疫原性RNA種の同定と特性評価

オゾンとLPS誘発マウス急性肺損傷時の肺細胞適応の可視化

In Vivo 光シート顕微鏡観察に基づくアレルギー性炎症の実験的肺ホーミング ヒトリンパ球のイメージング高度な

マウス肺の自然免疫細胞および適応免疫細胞の同定のためのフローサイトメトリー分析

アレルギー性気道炎症時の肺樹状細胞の成熟および移行の解析

体内上部気道免疫メディエーターレベルの定量化のための粘膜内層流体の非侵襲的サンプリング

In Vivo 光シート顕微鏡観察に基づくアレルギー性炎症の実験的肺ホーミングヒトリンパ球のイメージング高度な