간접적인 면역 형광은 DNA 복구 단백질, 공간 및 측두모집 사진을 검출할 수 있게 해주며 DNA 손상 부위에서 단백질 단백질 상호 작용을 심문하는 데 도움이 됩니다. DNA 손상에 따라 DNA 수리 단백질은 DNA 모욕으로 모집되며, 농도가 현지에서 증가하고 고정 된 샘플에 대한 간접 적인 면역 불의에 의해 시각화 될 수있는 foci라는 그룹을 형성합니다. 이 기술은 단백질 포시를 검출하고 세포에서 존재하는 공존화를 정량화하는 데 사용될 수 있다.
이것은 복잡한 대형 및 DNA 수리를 위해 필요한 사건의 순서를 설명하는 것을 도울 수 있습니다. 특정 단백질 단백질 상호 작용은 그러한 실험에서 수반될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 바바라 드 라 페나, 내 실험실에서 매우 재능있는 Postdoc 사진 성장하여 시작 40, 000 HeLa 세포는 18 밀리미터 둥근 유리 커버 슬립과 함께 12 웰 플레이트에 각각 잘 성장하여 시작 80 %의 합류.
4개의 회색 감마 조사에 세포를 노출한 후에, PBS의 1밀리리터로 두 번 세척하십시오. 그런 다음 PBS를 완전히 제거하고 각각의 우물에 200 마이크로리터의 NDB를 추가합니다. 실온에서 2분 동안 세포를 배양한 다음 NDB를 제거합니다.
잠복기 시간은 세포주에 따라 다를 수 있지만 일반적으로 2 분을 초과해서는 안됩니다. PBS의 1 밀리리터로 세포를 씻으시다. 그런 다음 PBS를 완전히 제거하고 세포 고정을 위해 각 웰에 4%PFA의 200 마이크로리터를 추가합니다.
섭씨 4도에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 PFA를 제거하고 각 웰에 PBS의 1 밀리리터를 추가합니다. PBS를 완전히 제거한 다음 각 우물에 200 마이크로리터의 블로킹 솔루션을 추가하고 실온에서 2시간 또는 섭씨 4도에서 16~18시간 동안 세포를 배양합니다.
1차 항체 및 희석 완충제를 희석시키고 습도 상자에 잘 섞일 때까지 이를 희석시키고 파라필름 한 조각을 넣고 1차 항체의 마이크로리터를 한 방울로 첨가한다. 커버슬립의 한 가장자리를 우물에서 떨어뜨리고 액체를 퍼뜨리는 파라필름에 천천히 낮춥니다. 실온에서 2시간 동안 커버슬립을 배양합니다.
인큐베이션 세척 후 커버는 PBS에서 세 번 미끄러져 세척 당 1 분 동안 미끄러. 이차 항체 및 희석 완충제를 희석시키고 전작대로 각 커버슬립에 이차 항체 10 마이크로리터를 적용하고 빛으로부터 보호되는 실온에서 2시간 동안 배양할 때까지 이를 희석한다. 커버를 PBS로 세 번, 세척당 1분 동안 물로 한 번 씻으시면 됩니다.
그런 다음 투명 매니큐어로 DAPI 씰 커버 슬립이 들어있는 글리세롤 기반 마운팅 미디어로 유리 슬라이드에 장착하여 20 분 동안 건조시하십시오. 60x 객관적렌즈에 침수 오일 한 방울을 놓고 DAPI를 사용하여 XYZ 이미지 획득을 위한 접피스를 통해 핵을 찾고, 획득 소프트웨어를 열고 스캐너 유형을 왕복으로, 512 x 512x 512로 스캐너 유형으로 설정합니다. PMT 패널 세트 모드에서 VBM 평균으로 프레임및 순차 스캔을 줄수 있습니다.
다음으로 다이피 및 열 검출기세트 채널1DAPI 및 SD 1, 채널 2에서 알렉사플루어 488 및 HSD 3로, 채널 3에서 알렉사플루어로, HSD 4는 라이브 이미지를 조정하고, 라이브 창을 Z.To, 라이브 버튼을 누르고 초점을 조정한다. 그런 다음 PMT 도구 창을 사용하여 레이저 강도 감도, 게인 및 오프셋 z 스택을 설정하고 시작부터 끝까지 선택하고 15개의 슬라이스를 선택합니다. 이미지를 저장하려면 폴더를 선택하고 LSM 시작 버튼을 눌러 수집을 시작합니다.
완료되면 시리즈 완료 버튼을 눌러 이미지 수집을 완료합니다. 분석 소프트웨어를 연 다음 배치 도구 창을 누르고 분석할 이미지를 선택합니다. 해석 도구 창으로 이동하여 15개의 슬라이스에서 최대 강도 투영을 표시하는 프로젝션을 선택합니다.
입력 출력 설정에서 생성된 일괄 처리 및 출력 폴더를 선택합니다. 이미지를 처리하는 프로세스를 누르고 이미지를 TIFF 파일로 내보냅니다. 원고 의 지시에 따라 셀 프로파일러와 핵 정량화를 수행합니다.
방사선으로 처리되지 않은 세포는 거의 감마 H2AX 엑스포 표지판을 나타낸다. 필수 DNA 수리 단백질이 없는 경우, 감마 H2AX 축적은 DNA 파손시 관찰될 수 있다. 수리되지 않은 휴식의 축적은 세포가 고체 감마 H2AX 핵에 의해 표시된 사전 저혈압이 될 수 있다.
조사 후, 핵은 감마 H2AX가 매우 빠르게 국소화되는 이중 좌초 휴식의 큰 숫자를 나타낸다. 어떤 foci가 방사선의 부재에서 관찰되는 경우에 몇몇 동안 포시의 수는 방사선을 포스트 한 두 4 및 16 시간에서 정량화하고 NOA 방사선 통제를 위해. 제기된 생물학적 질문과 요구되는 데이터의 종류에 따라, 상이한 플롯 옵션은 상이한 동물 종에서 제기된 1차 항체를 멀티플렉스화하고 이차 항체를 사용하여, 뚜렷한 형광으로 표지되어 있는 것으로 간주되어야 한다.
녹색과 빨간색의 중첩은 노란색 핫스팟을 초래하며 관심있는 두 단백질이 동일한 픽셀에 존재합니다. 지역화의 정량적 분석은 개체 기반 접근 방식이나 강도 상관 계수 기반 분석을 수행하는 통계적 접근 방식에 의해 달성될 수 있습니다. 상이한 동물종에서 자란 1차 항체의 조합은 이 프로토콜에 사용될 수 있다.
항체가 호환되고 서로 간섭하지 않는지 확인하십시오. 당신은 적절하게 각 기본 항체에 대해 사용되는 보조 항체를 설정하고 사용할 적은 힘을 선택할 때 특정 스펙트럼 중복을 고려할 필요가있다. 지역화 또는 단백질은 가능한 직접적인 상호 작용을 나타냅니다.
이것은 세포에 있는 과립 강수량에 의해, 또는 시험관 에 있는 정제한 단백질을 사용하여 직접 내려 놓기 에 의해 확인할 수 있습니다.
