이 작품은 NIH (1R35GM133496-01)에서 Z. Gao에 대한 보조금에 의해 지원되었습니다. 우리는 단면에 도움을 준 라이언 홉스 박사에게 감사드립니다. 우리는 게놈 과학 및 생물 정보학, 고급 빛 현미경 검사영상, 유동 세포측정을 포함한 의학의 펜실베니아 주립 대학의 핵심 시설에 감사드립니다. 우리는 또한 RNA-seq 분석에 있는 도움을 주셔서 유카 이마무라 박사에게 감사드립니다.

1. mESC 문화
<ol><li>10cm 조직 배양 처리 플레이트를 0.1% 젤라틴으로 코팅하고 젤라틴이 15-30분 이상 을 세울 수 있도록 한 후 이를 꺼낼 수 있습니다.</li>
	<li>종자 γ 조사 마우스 배아 섬유아데스 (MEFs) 하루 전에 미리 온난 한 mESC 배지에서 mESC를 배양하기 전에 (덜벡코의 수정 된 이글 매체 (DMEM) 15% 태아 소 혈청 (FBS), 비 필수 아미노산, β-메르카토에탄올, L-글루타민, 페니실린/연쇄절제술신, 피루바테 나트륨, LIF, PD0325901(PD), Chir99021(CH).</li>
	<li>γ 조사된 MEF가 E14 세포를 배양하기 전에 플레이트 표면에 정착하고 부착하도록 허용합니다.</li>
	<li>37°C 수조에서 E14 EsC를 해동하고 따뜻한 mESC 배지로 15cm 원문 튜브로 세포를 신속하게 이송합니다. 3 분 동안 200 x g에서 세포를 펠릿과 상체를 제거합니다.</li>
	<li>mESC 배지의 10mL에서 세포를 재연하고 이전에 시드된 γ 조사된 MEF를 포함하는 배양판에 세포를 플레이트한다. 5% CO2미만의 37°C 인큐베이터에서 세포 배양을 배양한다.</li>
	<li>배양 패용, 배지를 흡인시키고 멸균 1x PBS로 접시를 씻으세요. 플레이트 표면을 덮고 37°C에서 3분 동안 배양할 수 있는 충분한 0.05% 트립신을 추가합니다.</li>
	<li>단일 셀 서스펜션을 생성하기 위해 mESC 배지 및 파이펫으로 트립신을 중화시합니다. 세포를 200 x g에서 3 분 동안 원심 분리하고 상체를 제거합니다.</li>
	<li>혈류계 또는 세포 카운터로 세포를 계산하고 10cm 배양 판에서 약 5.0 x 105 세포를 시드한다.</li>
	<li>mESC 배지의 10mL에서 세포를 다시 중단하고, 앞서 설명한 바와 같이 젤라틴 코팅 조직 배양판상에 세포를 플레이트및 배양한다. 참고: mESC는 그들의 식민지에서 분화에서 세포를 방지하기 위하여 매 2 일마다 통과하는 것이 좋습니다. 중간 체의 페놀 레드는 전적으로 pH 표시기로서 작용하며 세포 밀도에 따라 2일 보다 빨리 황색(더 산성)을 돌릴 수 있다. 따라서 매일 매체를 변경해야 할 수도 있습니다. γ 조사된 MEF는 결국 몇 구절 후에 죽을 것입니다.</li>
</ol>2. EB, NPC 및 뉴런 분화
<ol><li>앞에서 언급한 배양 패세이징 프로토콜을 수행하고 셀을 계산합니다(단계 1.7-1.10).</li>
	<li>매달려 있는 드롭방법(0일차)<ol>
<li>10cm 세포 배양 판의 경우, 약 2.5 x 104 세포가 20 μL 분화 배지에서 중단될 수 있습니다 (15 % FBS, 비 필수 아미노산, β-메르카포에탄올, L 글루타민, 페니바틸린 / 스트렙토미신 및 나트륨 pyrue)에서 5.0 x 102 세포가 일시 중단됩니다. 세포를 포함하는 대략 50 20 μL 물방울은 1개의 10cm 판에 도금될 수 있습니다.</li>
		<li>적절한 수의 세포를 알리쿼트한 다음 세포를 200 x g에서 3분 동안 원심분리하고 상체를 제거합니다.</li>
		<li>20 μL당 5.0 x 102 세포의 세포 밀도에 대한 분화 배지의 적절한 부피에서 세포를 재축한다(예를 들어, 분화 배지의 1mL에서 2.5 x 104 세포).</li>
		<li>마이크로피펫 또는 리피터 파이펫을 사용하여 세포 현탁액의 20 μL 방울을 조직 배양판의 뚜껑에 놓습니다. 물방울이 서로 너무 가깝지 않아 병합되지 않도록 하십시오. 참고: 액적은 접시 자체가 아닌 뚜껑에 놓일 때 조직 배양 처리 부착 플레이트 또는 서스펜션 플레이트에 도금될 수 있습니다. 보다 실현 가능하고 멸균 접근법을 위해, 부착 조직 배양 판에 액적을 플레이트하고 아래에 설명된 바와 같이 서스펜션 플레이트로 옮기.</li>
		<li>접시를 1x PBS5-10mL로 채우고 뚜껑을 조심스럽게 접시에 다시 놓습니다. 37°C 인큐베이터에서 배양한다. 참고 : PBS는 물방울이 건조되는 것을 방지하기 위해 배양 판에 추가됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>2일째에는마이크로피펫을 사용하여 뚜껑에서 물방울을 수집하고 10mL의 분화 매체로 채워진 10cm 세포 배양 현탁판에 놓는다. 인큐베이터에서 저속으로 흔들리는 궤도 셰이커에 문화를 배양합니다.</li>
	<li>4일째에,EB를 수확하고, 세포를 수집하고, 원심분리기를 200 x g에서 3분 동안 수집하고, 상부물을 제거한다. 참고: 후속 실험의 요구 사항에 따라 1배 PBS로 세척할 수도 있습니다.</li>
	<li>절차를 계속하고 신경 전구 세포 (NPC)로 EB 분화를 유도하기 위해, 5 μM 망추산 (RA)으로 분화 배지를 준비한다.</li>
	<li>이전 배지를 100 x g에서 3분 동안 펠릿으로 제거하거나 기존 배지를 흡입하기 전에 EB가 정착하도록 허용합니다. 배양판에 5 μM RA를 함유한 분화 배지10mL를 첨가한다.</li>
	<li>6일째에는상기와 같이 플레이트를 기울이고 배지를 피펫으로 배팅하여 5 μM RA를 함유한 신선한 배지로 배지의 절반 이상을 교체한다. 참고: 배지의 절반 이상이 5일과 7일에 신선한 RA 함유 매체로 교체하는 것이 좋습니다. 페놀 레드 인디케이터에 유의하십시오. 황색으로 변하면 모든 매체를 대체하는 것이 가장 좋습니다.</li>
	<li>8일째에는세포를 수집하고, 3분 동안 200 x g에서 원심분리하고, 상퍼를 제거하여 NPC를 수확한다. 참고: NPC는 후속 실험의 요구에 따라 1x PBS로 세척할 수도 있습니다. 필요한 경우 NPC를 동결하고 나중에 문화 및 분석을 위해 다시 해동할 수 있습니다. NPC를 배양해야 하는 경우, accutase는 트립신의 대안으로사용될 수도 있습니다.</li>
	<li>절차를 계속하고 NPC를 뉴런으로 분화하려면 원심분리에 의해 15mL 원추형 튜브에서 NPC를 수집하고 트립신으로 해리하고 37 °C에서 3 7 °C에서 배양하십시오. 모든 NPC 응집체가 해리되고 트립신을 매체로 중화할 수 있도록 NPC파이펫을 피펫합니다.</li>
	<li>40 μm 나일론 세포 스트레이너로 세포를 필터링하고 N2 배지에서 1.5 x 105/cm2의 밀도로 도금하기 전에 세포를 계산합니다 (DMEM / F12 배지 + 3 mg / mL 포도당 + 3 mg / mL 지질이 풍부한 소 se rum 알부민 (LBSA) + 1:100 N2 보충 + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL 펜/스트렙 + 1 mM L-글루타민) 후속 PCR 및 서부 블롯 실험을 위한 조직 배양 처리 플레이트에; 또는 면역 형광 실험을위한 조직 배양 챔버에.</li>
	<li>9일째에는기존 배지를 신선한 N2 매체로 교체하십시오.</li>
	<li>10일,N2/B27 배지(50% DMEM/F12 및 50% 신경 기저, 3 mg/mL LBA, 1:200 N2 보충제, 1:100 B27 보충제, 50 U/mL 펜/스트렙, 1mM L-글루타민)으로 N2/B27 배지를 전환하십시오.</li>
	<li>11-12일에는 다음과 같이 뉴런을 수확하십시오. 1x PBS로 세포를 세척하고 트립신을 추가하고 37°C 인큐베이터에서 배양한 후 3분 동안 배양한 후 중간 및 원심분리기로 트립신을 3분 동안 200 x g로 중화한다.</li>
</ol>3. mESC 및 분화 셀의 특성화
<ol><li>알칼리성 인산염 (AP) 분석 
	<ol>
<li>키트를 사용하여 알칼리성 인산염 활성을 평가합니다(재료 표참조).</li>
		<li>배양판에서 배지를 제거하고 1x PBS로 EsC를 세척합니다.</li>
		<li>플레이트에 키트와 함께 제공되는 수정 용액 1mL(포름알데히드와 메탄올로 구성되어 있음)을 추가하고 실온에서 2-5분 동안 배양합니다. 참고: 수정 솔루션의 오버 인큐베이션은 AP 활동을 손상시킬 수 있습니다.</li>
		<li>수정 용액을 제거하고 1x PBS로 EsC를 세척하고 접시에 PBS를 일부 남겨 둡니다. 참고: ESC를 PBS에 촉촉하게 유지하여 AP 활동을 손상시키지 않도록 하십시오.</li>
		<li>A, B 및 C 기판 용액을 1:1:1 비율로 혼합하여 AP 솔루션을 준비합니다. A와 B 용액을 먼저 혼합하고 C 용액을 추가하기 전에 실온에서 2 분 동안 혼합물을 배양합니다.</li>
		<li>1x PBS를 제거하고 이전에 준비된 AP 솔루션을 추가합니다.</li>
		<li>문화판을 알루미늄 호일로 감싸거나 어두운 방에서 3.5단계를 수행하여 어둠 속에서 약 15분 동안 EsC를 배양합니다.</li>
		<li>반응을 모니터링하고 용액이 밝게 변할 때 반응 용액을 제거하여 비특이적 얼룩을 피하십시오.</li>
		<li>1x PBS로 EsC를 두 번 세척합니다.</li>
		<li>1x PBS 또는 마운팅 매체로 ESC를 덮어 시료가 건조되는 것을 방지합니다. 참고: AP 식에 빨간색 또는 보라색 얼룩이 나타납니다. 플레이트는 4°C 냉장고에 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>RT-qPCR 
	<ol>
<li>EsC 및 EB 및 NPC에 대해 각각 1.6-1.7 및 2.4 단계를 수행하여 다양한 단계에서 세포를 수집합니다.</li>
		<li>RNA, DNA 및 단백질 추출 용액을 사용하여 RNA를 분리합니다(재료 표참조).</li>
		<li>역전사 키트로 cDNA를 생성하고(재료 표참조) 제조업체 의 설명서를 따릅니다.</li>
	</ol></li>
	<li>고정 및 포함 
	<ol>
<li>전술한 바와 같이 수확 한 EB및 NPC (단계 2.6) 실온에서 30 분 동안 1 x PBS에서 4 % 파라 포름알데히드 (PFA) 용액으로 수정하십시오.</li>
		<li>PFA를 제거하고 5 분 동안 1 x PBS로 샘플을 세척하십시오.</li>
		<li>샘플을 1x PBS, 10%-20%-및 30%-자당 용액의 직렬 희석에 배치하여 25\u201228°C에서 30분 동안 시료를 다음 솔루션으로 옮겨배배복시 30분 후에 다음 솔루션으로 옮겨놓는다. 참고: 샘플은 포함 단계를 계속하기 전에 4°C에서 30% 자당 용액에 저장할 수 있습니다.</li>
		<li>피펫 팁을 자당 용액으로 적시고 샘플을 저온 몰드의 중앙에 놓고 과도한 액체를 피펫으로 넣습니다. 참고: 필터 용지를 사용하여 초과 용액을 제거할 수도 있습니다. 파이펫 팁을 자당 용액으로 적시면 EB와 NPC가 팁 벽에 달라붙지 않도록 하는 것이 중요합니다.</li>
		<li>샘플을 다시 중단하지 않고 금형에 최적의 절삭 온도(OCT) 솔루션을 신중하게 추가하고 파이펫으로 과도한 거품을 제거합니다.</li>
		<li>샘플을 실험실 믹서에 낮은 속도로 배치하여 샘플을 15분 동안 약간 동요시킵니다. 이렇게 하면 10월 솔루션에서 다시 중단되는 경우 EB 및 NPC를 하단으로 해결하는 데 도움이 됩니다.</li>
		<li>금형을 액체 질소 또는 드라이 아이스에 배치하여 신속하게 시료를 동결합니다. 참고: 샘플은 다음 단계로 계속하기 전에 -70°C 냉동고에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>냉동 절제 
	<ol>
<li>냉동을 설정하여 샘플을 계측기로 옮기기 전에 -20에서 -18°C로 식힙니다.</li>
		<li>얼어 붙은 10월 블록을 금형에서 분리하고 홀더 표면에 약간의 OCT 용액을 배치하여 홀더에 고정하십시오.</li>
		<li>10월 블록을 정렬하여 EB와 NPC가 블레이드에 가장 가깝도록 조정하여 단면화 중에 샘플이 손실되지 않도록 합니다.</li>
		<li>조심스럽게 블록의 10 μm을 섹션과 샘플을 포함하는 조각에주의를 기울이는.</li>
		<li>샘플을 포함하는 OCT 슬라이스를 티슈 포함 유리 슬라이드에 빠르게 배치하고 10월 슬라이스가 실온에서 1시간 동안 공기 건조되도록 합니다. 참고: 샘플은 나중에 사용하기 위해 -70 °C에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>면역형광 (IF) 
	<ol>
<li>블록 OCT 섹션 또는 배양 챔버에 뉴런을 포함 10% 정상 당나귀 혈청/0.1% Triton X-100 에 1 x PBS에 1 x PBS 에 1 시간 실온에서 시간.</li>
		<li>1차 항체의 샘플을 4°C에서 하룻밤 사이에 1x PBS에서 5% 정상 당나귀 혈청/0.05% Triton X-100으로 배양한다.</li>
		<li>1x PBS/0.1% 트리톤 X-100 세 세 번 세척할 때마다 샘플을 세척합니다.</li>
		<li>이차 항체로 샘플을 5% 정상 당나귀 혈청/0.05% Triton X-100에서 실온에서 1시간 동안 1배 PBS로 배양한다.</li>
		<li>1x PBS/0.1% 트리톤 X-100 세 번째로 세척할 때마다 5분 간 세척한 다음 1 μg/mL DAPI로 샘플을 배양합니다.</li>
		<li>커버슬립과 일부 마운팅 매체로 샘플을 마운트하여 건조시로 만드십시오.</li>
		<li>형광 현미경의 밑에 견본을 관찰하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>RNA-세크 분석 
	<ol>
<li>다양한 단계에서 세포를 수집하고 RNA 추출을 수행합니다(3.2단계 참조).</li>
		<li>cDNA 라이브러리를 준비하고, Wang외.8에기재된 프로토콜에 따라 깊은 시퀀싱 및 데이터 분석을 수행한다.</li>
		<li>R 패키지, 클러스터 프로파일러를 사용하여 유전자 온톨로지(GO) 분석을 수행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>유동 세포측정 
	<ol>
<li>단계 1.6-1.7을 수행하여 EsC를 수집하고 매체에서 세포를 다시 중단합니다. 2.4단계를 따라 EB 및 NPC를 수집하고 배지에서 세포를 다시 중단합니다.</li>
		<li>40 μm 나일론 세포 여과기를 사용하여 새로운 15 mL 원문 튜브로 셀 서스펜션을 필터링합니다.</li>
		<li>유동 세포계(기관의 핵심 시설에서 수행)를 사용하여 샘플의 GFP 신호를 측정합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox1+marks+an+activated+neural+stem/progenitor+cell+in+the+hippocampus.">Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus.</a> Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NS21:+Re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures.">NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).</li><li>Bahmad, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Akt/mTOR+pathway+in+cancer+stem/progenitor+cells+is+a+potential+therapeutic+target+for+glioblastoma+and+neuroblastoma.">The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma.</a> Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).</li><li>Bastiaens, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+a+MEMS-Based+3D+Cell+Culture+System+for+in+vitro+Neuro-Electrophysiological+Recordings.">Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings.</a> Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).</li><li>Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer:+The+case+for+3D+bioprinting+neurons+to+create+patient-specific+epilepsy+models.">Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models.</a> Materials. 12 (19), (2019).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture.">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Joshi, P., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+imaging+(HCI)+on+miniaturized+three-dimensional+(3D)+cell+cultures.">High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures.</a> Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).</li></ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화 방법은 수십 년 동안 확립되어 왔으며 연구자들은 이전 프로토콜을 수정하거나 다양한 목적을 위해 새로운 프로토콜을 계속 생성하고있다7,10,11. 우리는 마우스 또는 인간 ESC의 다른 혈통 분화의 분석에 사용될 수 있는 신경에 mESC의 분화 단계의 효율성 그리고 진행을 종합적으로 분석하기 ?...

개발 중인 마우스 발아세포1,2,마우스 배아 줄기세포(mESC)의 내세포 질량으로부터의 첫 번째 파생이후 줄기세포자가재생 및분화3을연구하는 강력한 도구로 사용되고 있다. 더욱이, mESC 분화를 연구하면 신경퇴행성 질환4와같은 질환 치료에 줄기세포 기반 치료의 효율성과 안전성을 향상시킬 수 있는 분자 메커니즘에 대한 엄청난 이해를 이끌어 낸다. 동물 모델에 비해, 이 체외 시스템은 실용성 및 평가의 단순성, 동물과 대조적으로 세포주를 유지하는 데 드는 저렴한 비용, 유전자 조작의 상대적 용이성을 포함하여 많은 이점을 제공합니다. 그러나, 분화된 세포 유형의 효율 및 품질은 종종 다른 선인 mESC뿐만 아니라 분화 방법5,6에의해 영향을 받는다. 또한, 분화 효율을 평가하는 전통적인 분석은 견고성이 결여되어 유전자 발현의 글로벌 변화를 파악하지 못하는 선택된 마커 유전자의 질적 검사에 의존한다.
여기서 우리는 신경 분화의 체계적인 평가를 위해 애사의 배터리를 사용하는 것을 목표로합니다. 선택된 마커와 RNA-seq에 대한 기존의 체외 분석을 모두 사용하여 이 공정 중 전사적 변화뿐만 아니라 분화 효율을 측정하는 플랫폼을 구축합니다. 이전에 확립된 프로토콜7에기초하여, 우리는 매달려 있는 낙하 기술을 통해 배아 체(EBs)를 생성하고, 신경 전구세포(NPC)를 생성하기 위해 망막산(RA)의 초생리적 양을 이용한 유도를 거쳐 신경 유도 배지를 가진 뉴런으로 분화하였다. 분화의 효율을 검사하기 위해 기존의 RT-qPCR 및 면역 형광 (IF) 분석 외에도 RNA-seq 및 유동 세포 측정을 수행했습니다. 이러한 분석은 단계별 분화의 진행을 종합적으로 측정합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:805px;" width="804">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">25-052-CV</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">0.1% Gelatin</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">G1890-100G</td>
			<td>Prepared in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">16% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:127px;">28908</td>
			<td>Diluted in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">40-&#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:148px;">Falcon</td>
			<td style="width:127px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Albumax</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">11020021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">A11001</td>
			<td>Antibody was diluted at 1:500 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Alkaline Phosphatase Staining Kit II</td>
			<td style="width:148px;">Stemgent</td>
			<td style="width:127px;">00-0055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox</td>
			<td style="width:148px;">Azura Genomics</td>
			<td style="width:127px;">AZ-2105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">B27 supplement</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">BD FACSCanto</td>
			<td style="width:148px;">BD</td>
			<td style="width:127px;">657338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">bFGF</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">11123149001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:148px;">Agilent</td>
			<td style="width:127px;">5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Chir99021</td>
			<td style="width:148px;">Cayman Chemicals</td>
			<td style="width:127px;">13122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Chloroform</td>
			<td style="width:148px;">C298-500</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Chemical</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">DAPI</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">R37606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">DMEM</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">10-017-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">EB buffer</td>
			<td style="width:148px;">Qiagen</td>
			<td style="width:127px;">19086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Ethanol</td>
			<td style="width:148px;">111000200</td>
			<td style="width:127px;">Pharmco</td>
			<td>Diluted in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:127px;">S10250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">HiSeq 2500 Sequencing System</td>
			<td style="width:148px;">Illumina</td>
			<td style="width:127px;">SY-401-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:148px;">BDH1133-4LG</td>
			<td style="width:127px;">BDH VWR Analytical</td>
			<td>Diluted in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">LIF</td>
			<td style="width:148px;">N/A</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td>Collected from MEF supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">m18srRNA primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-GCAATTATTCCCCATGAACG-3&#39; 
			5&#39;-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">MEM Non-essential amino acids</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">25-025-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mNanog primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3&#39; 
			5&#39;-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">mNes primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3&#39; 
			5&#39;-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">mNeuroD1 primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3&#39; 
			5&#39;-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mOct4 primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3&#39; 
			5&#39;-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">mPax6 primers</td>
			<td style="width:148px;">IDTDNA</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;">5&#39;-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3&#39; 
			5&#39;-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">N2 supplement</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Nestin primary antibody</td>
			<td style="width:148px;">Millipore</td>
			<td style="width:127px;">MAB5326</td>
			<td>Antibody was diluted at 1:200 for IF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Neural basal</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Neurofilament primary antibody</td>
			<td style="width:148px;">DSHB</td>
			<td style="width:127px;">2H3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit</td>
			<td style="width:148px;">BioO Scientific</td>
			<td style="width:127px;">NOVA-5138-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">PD0325901</td>
			<td style="width:148px;">Cayman Chemicals</td>
			<td style="width:127px;">13034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:148px;">N/A</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td>Prepared in de-ionized water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">- Potassium chloride</td>
			<td style="width:148px;">P217-500G</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">- Potassium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td style="width:148px;">0781-500G</td>
			<td style="width:127px;">VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">- Sodium chloride</td>
			<td style="width:148px;">BP358-10</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">- Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate</td>
			<td style="width:148px;">SX0715-1</td>
			<td style="width:127px;">Milipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Random hexamer primer</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:127px;">SO142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Retinoic acid</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">R2625</td>
			<td>Prepared in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:127px;">25-000-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sucrose</td>
			<td style="width:148px;">Sigma</td>
			<td style="width:127px;">84097</td>
			<td>Diluted in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">SuperScript III Reverse Transcriptase</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:127px;">18064022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Tissue-Tek O.C.T. compound</td>
			<td style="width:148px;">Sakura</td>
			<td style="width:127px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">TriPure Isolation Reagent</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">11667165001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">TruSeq Rapid</td>
			<td style="width:148px;">Illumina</td>
			<td style="width:127px;">20020616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:148px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:127px;">BP176-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation and characterization of neural progenitors and neurons from mouse embryonic stem cells

우리는 마우스 배아 줄기 세포를 뉴런 혈통으로 배양하고 분화하기 위한 단계별 절차를 설명하고, 분화된 세포를 특징짓는 일련의 에세이를 따릅니다. 상기 E14 마우스 배아 줄기세포는 매달려 있는 낙하 방법을 통해 배아체를 형성하기 위해 사용되었고, 그 후 망막산에 의해 신경 전구 세포로 분화하도록 유도하고, 마지막으로 뉴런으로 분화하였다. 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-qPCR) 및 면역형광 실험은 신경 전조자와 뉴런이 각각 8일째와 12일째에 대응하는 마커(신경 전조자 및 뉴런용 신경필라멘트용 네신틴)를 나타낸다는 것을 밝혔다. Sox1 프로모터 중심의 GFP 리포터를 발현하는 E14 라인에 대한 유동 세포 측정 실험은 8일째에 세포의 약 60%가 GFP 양성인 것으로 나타났으며, 이는 이 단계에서 신경 전구 세포의 성공적인 분화를 나타낸다. 마지막으로, RNA-seq 분석은 글로벌 전사적 변화를 프로파일로 사용되었다. 이러한 방법은 신경 분화 시 세포 정체성 전이를 조절하는 특정 유전자 및 경로의 개입을 분석하는 데 유용합니다.

우리의 방법의 표현으로, 우리는 E14 세포에 EB, NPC 및 신경 분화 실험을 수행했습니다. E14 세포는 γ 조사된 MEF 인구가 희석될 때까지 γ 조사된 MEF(도1A)에서배양되었다. 우리는 나노그 및 Oct4 마커에 대한 알칼리 인파타아제 (AP) 염색(도 1B)및 이후 RT-qPCR (아래 참조)을 수행하여 E14 세포의 자통을 확인했다. γ 조사된 MEF-없는 E14 세포는 <strong c...

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Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

우리는 매달려 드롭 방법을 사용하여 신경 세포로 마우스 배아 줄기 세포의 체외 분화에 대한 절차를 설명합니다. 또한 RT-qPCR, 면역형광, RNA-seq 및 유동 세포종을 통해 포괄적인 현상 분석을 수행합니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

differentiation-characterization-neural-progenitors-neurons-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.7K 조회수.  Penn State Hershey Cancer Institute. 우리는 매달려 드롭 방법을 사용하여 신경 세포로 마우스 배아 줄기 세포의 체외 분화에 대한 절차를 설명합니다. 또한 RT-qPCR, 면역형광, RNA-seq 및 유동 세포종을 통해 포괄적인 현상 분석을 수행합니다.

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Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

연구

발생학

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

배아 줄기 세포와 조직의 심장 차별화의 성적인 규정

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of pancreatic progenitor cells that can be used for the study of and future treatment of diabetes. This article outlines a four-stage differentiation protocol designed to generate pancreatic progenitor cells from human embryonic stem cells (hESCs). This protocol can be applied to a number of human pluripotent stem cell (hPSC) lines. The approach taken to generate pancreatic progenitor cells is to differentiate hESCs to accurately model key stages of pancreatic development. This begins with the induction of the definitive endoderm, which is achieved by culturing the cells in the presence of Activin A, basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and CHIR990210. Further differentiation and patterning with Fibroblast Growth Factor 10 (FGF10) and Dorsomorphin generates cells resembling the posterior foregut. The addition of Retinoic Acid, NOGGIN, SANT-1 and FGF10 differentiates posterior foregut cells into cells characteristic of pancreatic endoderm. Finally, the combination of Epidermal Growth Factor (EGF), Nicotinamide and NOGGIN leads to the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ cells. Flow cytometry is performed to confirm the expression of specific markers at key stages of pancreatic development. The PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors at the end of stage 4 are capable of generating mature &#946; cells upon transplantation into immunodeficient mice and can be further differentiated to generate insulin-producing cells in vitro. Thus, the efficient generation of PDX1+/NKX6-1+ pancreatic progenitors, as demonstrated in this protocol, is of great importance as it provides a platform to study human pancreatic development in vitro and provides a source of cells with the potential of differentiating to &#946; cells that could eventually be used for the treatment of diabetes.

Efficient Differentiation of Pluripotent Stem Cells to NKX6-1+ Pancreatic Progenitors

Here we describe a 4-stage protocol to differentiate human embryonic stem cells to NKX6-1+ pancreatic progenitors in vitro. This protocol can be applied to a variety of human pluripotent stem cell lines.

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

Pluripotent stem cells have the ability to self renew and differentiate to multiple lineages, making them an attractive source for the generation of ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

말초 단핵 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 생성 및 이식 연구에 대 한 도파민성 신경 전구체로 분화

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...