이 비디오 프로토콜의 목적은 배아 마우스 신경 줄기 세포 격리 및 문화에 대한 소스와 효율적인 프로토콜을 수립하는 것입니다. 안녕하세요, 저는 메리암 사데기 자데입니다. 저는 로이안 연구소의 세포 및 분자 생물학 석사 학생입니다.
오늘 저와 제 동료는 13개의 배아 마우스 신경절 저울에서 신경 줄기 세포를 수확하는 방법을 보여주고 싶습니다. 안녕하세요, 나는 바하레 알리자데 쇼르예스탄입니다. 저는 로이안 생명공학연구소의 줄기세포학과에서 세포및 분자생물학 석사학생입니다.
안녕하세요, 나는 레자 데가니 - 바르남카스티입니다. 또한 저는 로이안 연구소에서 세포 및 분자 생물학을 공부하고 있습니다. 외과 적 절차는 자궁에서 각 13 마우스 배아를 수확 포함.
두개골에서 뇌를 추출 구부러진 바늘 팁으로 배아의 폰타넬의 전면을 절단. 고립 된 뇌의 미세 해부는 신경절 명성을 수확합니다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 신경 줄기 세포 배지에서 수확 된 조직의 해리.
그리고 마지막으로, 신경 세포를 생성하기 위해 현탁액 배양에서 세포를 도금. 70%에탄올로 살포하여 복부 부위의 피부를 깨끗하고 소독합니다. 피부를 위쪽 복부를 제어한 다음 피부를 잘라내고 가위로 얼굴을 밑줄로 밑줄로 하여 복강과 자궁 뿔을 발견합니다.
가위로 배아를 함유한 자궁 경적을 제거하고 25ml의 차가운 HEPES MEM 버퍼를 포함하는 50ml 원뿔 튜브로 옮긴다. 라미날 흐름 후드 아래에 원문 튜브를 놓습니다. 후드 아래 캡을 엽니다.
자궁 뿔을 튜브에서 꺼내서 신선한 차가운 HEPES MEM 버퍼의 충분한 부피로 세 번 헹구어 파편과 혈액을 제거하십시오. 자궁 조직을 7~10ml의 차가운 HEPES MEM 버퍼를 함유한 10cm 페트리 접시로 옮춥니까. 미세 한 가위를 사용하여 자궁 뿔을 열고 차가운 HEPES MEM 버퍼의 7 ~ 10 ml를 포함하는 새로운 접시에 배아를 전송합니다.
이제 미세 해부 작업을 위해 해부 현미경 아래에 배아와 함께 10cm 접시를 넣습니다. 강철 메스 블레이드 핸들에 팁을 밀어 주사기 바늘의 끝을 구부립니다. 팁이 70~90도 각도로 구부러지때까지 바늘 끝을 구부립니다.
해부 현미경 아래 바늘의 끝을 확인하여 바늘 끝에서 굴곡을 확인하십시오. 자연적으로 태아는 이것에 있는 측면 위치가 있습니다. 그들의 위치를 변경하지 않고, 미세 한 포셉으로 배아의 목과 몸을 잡고 배아 헤드의 폰타넬의 앞쪽에 바늘의 구부러진 부분을 깊은 삽입.
거기에 작은 출혈이나 혈전이있을 것입니다. 구부러진 부분이 이마쪽으로 부풀어 오른 다음 머리 뒤쪽으로 바늘 끝을 피상적으로 움직입니다. 피부와 두개골을 잘라내고 근본적인 뇌를 손상시키지 않도록 하십시오.
바늘 끝으로 피부를 측면으로 밀어 뇌를 발견하십시오. 피부의 측면측면에서 피부 의 측면으로 바늘을 삽입하여 피부의 측면에서 뇌 아래 부위까지 프레임 아래에 삽입합니다. 그리고 해부 된 두개골에서 나올 그것을 밀어이 두피에서 뇌를 제거합니다.
간절의 명성은 내측 및 측면 부품으로 비디오에 명확하게 표시됩니다. 케어 포셉을 사용하여 뇌를 꾸준히 유지한 다음 마이크로시저를 사용하여 각 반구의 피질을 절단하여 신경절 의 명성을 드러냅니다. 뇌를 잡고 신경 줄기 세포 매체를 포함하는 15ml 원심분리기 튜브에 해부 된 신경절 저명.
모든 뇌가 미세 해부 될 때까지이 절차를 반복합니다. 튜브의 바닥에 파이펫 팁을 배치하여 해부 된 신경절 저명각을 잘라 내고 서스펜션을 2 5 회 위아래로 배치하여 조직을 분해하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 서스펜션을 110g에서 5분간 원심분리합니다.
상체를 제거하고 EDTA에서 0.05 %의 튜브의 1 ml에서 세포를 다시 중단합니다. 세포 현탁액을 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 트립신 활성을 중지콩 트립신 억제제의 동등한 볼륨을 추가합니다.
트립신이 완전히 비활성화되었는지 확인하기 위해 셀 서스펜션을 위아래로 피펫합니다. 5 분 동안 110g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 완전한 신경 줄기 세포 배지의 1 ml에서 세포를 다시 중단하고 세포의 수를 계산합니다.
신경 줄기 세포 배지에서 세포를 적당한 크기의 조직 배양 플라스크로 플레이트. 2T25 5ml, T75에 20ml, 40ml를 T175 플라스크로 옮기습니다. 신경구는 5%CO2를 가진 가습한 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 3일 문화 후에 나타납니다.
신경구 배양을 빨아, 5 분 동안 110g에서 원심분리기로 원심분리기로 중단 된 신경구와 배지를 전송한 다음 상체를 폐기하십시오. 0.05%의 트립신 EDTA 1ml에서 10분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 그런 다음 간장 티르프신 억제제와 신경구를 부드럽게 위아래로 피펫하여 단일 세포를 만들기 위해 트립신을 비활성화합니다.
5 분 동안 110g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 상체를 버리고 신경 줄기 세포 배지의 1 ml에서 세포를 다시 중단합니다. 이 세포는 고급 실험을 위한 라미네이트 및 완전히 코팅된 표면에 다음 단계 배양 또는 배양을 위한 준비됩니다.
7일 후 100만 개의 1차 신경줄기세포를 육성함으로써 세포 수가 3~4억 개로 증가할 것이다. 6 ~7 일 후 구체는 직경 150 에서 200 마이크로 미터 사이 측정 해야 하 고 신경 분화를 위한 bFGF와 EGF의 부재에 라미네이트 폴리 ornithine 코팅 요리에 하위 문화에 대 한 준비가 될 것입니다. 유동 세포 분석 결과 신경구를 구성하는 세포의 95%에 가까운 네스틴 양성신경 줄기 세포에 대 한 알려진된 마커는 나스티닌 양성 했다.
베타 튜룰린 III와 간글리오 섬유성 단백질 항체를 이용한 아세약은 코팅된 표면에 신경 줄기 세포를 재배함으로써 약 94%의 신경 표현형을 나타내고 약 5%의 신경교 표현형을 보여준다는 것을 알 수 있다. 이 짧은 비디오에서 13 마우스 배아 신경절 저명에서 신경 줄기 세포의 신속한 격리를위한 실험실 기술. 신경 줄기 세포 배양에서 성공하기를 바랍니다.
