이 작품은 국립 보건원 (R01 DK077195에서 R.M.A, R01 DK104641에서 R.M.A 및 D.R.B)의 보조금에 의해 지원되었습니다. 우리는 혈액학/ 종양학, 보스턴 아동 병원, 소아과 부, 하버드 의과 대학 및 다나 파버 암 연구소의 스튜어트 오킨 박사로부터 귀중한 의견을 인정합니다. 우리는 또한 마우스의 수술 후 치료에 카일 코스타에서 지원을 인정, 메리 타글리엔티와 박사 하비발라 Shojaeisadi (박사 양시 연구소, 소아과의 학과, 신생아 의과, 소아과의 학과, 신생아 의과, 보스턴 어린이 병원, 하버드 의과 대학) 기술 지원 및 도움이 토론을 위해.

<ol>
	<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation.">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> Journal of Immunological Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li><li>van den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Seth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+discrete+modes+of+spinal+cord+injury+on+bladder+muscle+contractility.">The impact of discrete modes of spinal cord injury on bladder muscle contractility.</a> BMC Urology. 13, 24 (2013).</li><li>Doyle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inosine+attenuates+spontaneous+activity+in+the+rat+neurogenic+bladder+through+an+A2B+pathway.">Inosine attenuates spontaneous activity in the rat neurogenic bladder through an A2B pathway.</a> Scientific Reports. 7, 44416 (2017).</li><li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+miRNA-regulated+networks,+hubs+of+signaling,+and+biomarkers+in+obstruction-induced+bladder+dysfunction.">Characterization of miRNA-regulated networks, hubs of signaling, and biomarkers in obstruction-induced bladder dysfunction.</a> JCI Insight. 2 (2), 89560 (2017).</li><li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concordant+miRNA+and+mRNA+expression+profiles+in+humans+and+mice+with+bladder+outlet+obstruction.">Concordant miRNA and mRNA expression profiles in humans and mice with bladder outlet obstruction.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 6 (6), 219-233 (2018).</li><li>Krishna, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+contusion+model+of+severe+spinal+cord+injury+in+rats.">A contusion model of severe spinal cord injury in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50111 (2013).</li><li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris.">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li><li>Gray, C. J., Boukouvalas, J., Szawelski, R. J., Wharton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline+p-nitroanilide+as+a+substrate+for+papain+and+other+plant+cysteine+proteinases.">Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline p-nitroanilide as a substrate for papain and other plant cysteine proteinases.</a> Biochemical Journal. 219 (1), 325-328 (1984).</li><li>Feodorova, Y., Koch, M., Bultman, S., Michalakis, S., Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+and+reliable+method+for+retina+dissociation+and+separation+of+rod+photoreceptor+perikarya+from+adult+mice.">Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice.</a> MethodsX. 2, 39-46 (2015).</li><li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bladder+extracellular+matrix.+Part+I:+architecture,+development+and+disease.">The bladder extracellular matrix. Part I: architecture, development and disease.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 596-611 (2009).</li><li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bladder+extracellular+matrix.+Part+II:+regenerative+applications.">The bladder extracellular matrix. Part II: regenerative applications.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 612-621 (2009).</li><li>The ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Yue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome.">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq.">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li></ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

여기에 설명된 마우스 척수 손상 모델은 방광 수축과 외부 요도 괄약근 이완 사이의 협착로 인한 기능성 방광 출구 장애물을 만드는 재현 가능한 방법을 제공한다. 이것은 차례로 비뇨기과 매끄러운 근육 구획의 확장에 의해 특징지어진 상해 후에 2 주 초에 방광 벽의 심오한 리모델링을 연상시킵니다. 설치류에서 SCI 모델의 구현에 중요한 단계는 (i) 부상 후 10\u201214 일 동안 계속되는 척추 충격의 기간 동안 수동 방광 발현에 엄격한 주의를 포함한다; (ii) 체중 감량을 최소화하기 위한 영양 농축; 및 (iii) 소변 비열의 반환을 넘어 확장 실험에 대한 특히 소변 확장에 대한 잠재력의 완화. 모델의 한계는 일시적인 혈뇨 기간 동안 혈전에서 마우스에 요도 폐색에 대한 잠재력을 포함, 그리고 추가로 수술 후 역행 사정 다음 정액 응고에서 남성 마우스에서.
여기에 설명된 조직 해리 접근법은 실험적 모욕에서 발생하는 조직의 구조적 변화를 고려하는 것의 중요성을 보여 주며, 이 경우 다운스트림 분석에 영향을 미칠 수 있는 SCI에 따라 중요한 조직 리모델링이 있을 수 있다. 단일 세포 분석의 증가로 유전자 발현에서 관찰된 차이는 단순히 해리 유발 된 동요의 결과가 아니라 질병 모델과 관련된 근본적인 생물학적 변화를 진정으로 대표하는 것이 중요합니다. 공개적으로 이용 가능한 식 데이터의 사용은 우리가 생존가능성을 극대화하면서 세포외 매트릭스의 효과적인 소화를 보장하기 위해 소화 버퍼의 공식을 수정할 수 있었습니다. 향후 응용 분야에서 고려될 수 있는 추가 수정은 해리프로토콜(15)에민감한 즉각적인 초기 유전자의 전사를 중단하기 위해 actinomycin D의 첨가를 포함한다.
파이프팅 기술은 조직을 해리하거나 이미 현탁액에있는 세포를 전송 할 때 중요합니다. 전단력으로 인한 세포의 물리적 손상을 줄이기 위해 세포 재서스펜션 중에 부드럽고 천천히 피펫하는 것이 중요합니다. 일반적으로 와이드 보어 파이펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다. 표준 팁을 사용하는 경우 세포를 손상시키는 전단 력을 피하기 위해 피펫 셀 서스펜션을 부드럽게 피하는 것이 특히 중요합니다. 이 프로토콜에서는 세포 스트레이너를 사용하는 것이 불가피하지만, 세포 농도는 100 μL 이상의 부피 손실과 함께 20% 이상 감소할 수 있다. 정확한 세포 수를 보장하기 위해 긴장 후 세포 농도를 결정하는 것이 좋습니다.
흐름 세포면에서 FMO 컨트롤은 중복방출 피크에서 신호의 출혈로 인해 배경의 측정을 제공합니다. 그(것)들은 항체가 그 채널에 포함될 때 존재할 수 있는 비특이적인 항체 결합, 또는 배경 염색의 측정이 아닙니다. 비특이적 항체 결합을 고려하기 위해, 하나는 적절한 등류형 제어를 포함해야 한다; 배경 염색의 경우 음수 컨트롤을 포함해야 합니다. 이러한 컨트롤을 종합하여 세포 집단을 정확하게 측정할 수 있습니다.

정상적인 오줌 방광 기능의 동요는 많은 개별을 위한 삶의 감소질로 이끌어 낼 수 있습니다. 부상이나 질병이 정상적인 방광 기능을 탈선하는 방법을 더 잘 이해하기 위해서는 방광 내의 세포의 정상적인 생물학적 상태와 실험적 동요 하에서 어떻게 변화하는지 조사하는 것이 중요합니다. 그러나 현재까지 오줌 방광 내에 거주하는 특정 세포 인구와 부상으로 어떻게 변하는지 는 불완전하게 특징지어지고 있습니다.
유동 세포형 또는 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)과 같은 단일 세포 프로파일링 방법은 방광 내의 특정 세포 유형에 빛을 비출 가능성이 있다. 그러나, 유익한 조직이 되는 이러한 접근법은 수확된 조직의 생존력, 유전자 발현 및 대표적인 세포 집단 비율에 영향을 미치지 않는 방식으로 소화되어야 한다. 효소 적 분리를 사용하는 프로토콜은 무차별 적인 프로테아제 활성1을통해 표면 마커 발현에 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 세포 측정에 의한 세포 식별에 영향을 미치는 반면, 해리 과정 자체는 반 덴 브링크 및 동료2에의해 최근에 설명된 바와 같이 즉각적인 초기 유전자의 유도로 이어질 수 있다. 저자는 해리에 영향을 받은 하위 인구가 작더라도, 즉각적인 초기 유전자의 높은 발현 수준 때문에 대량 발현 연구 결과에 있는 강한 오염 신호를 시작할 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 또한, 해리 프로토콜의 지속 기간은 일부 하위 집단에 고유한 것으로 나타난 유전자의 대량 발현 수준을 검출하는 데 영향을 미쳤다. 따라서, 해리 프로토콜의 영향을 고려하지 않고 생성된 단일 세포 데이터 세트는 근본적인 생물학과는 반대로 해리 방법으로부터 발생하는 유전자 발현 변화를 산출할 수 있다. 이러한 관측에 따르면 발표된 단일 세포 전사 데이터는 주의해서 해석되어야 하며, 그 결과는 독립적인 방법으로 검증되어야 합니다.
비록, 가혹하고 긴 해리 방법은 세포2에서유전자 발현을 바꿀 수 있습니다; 세포의 효과적인 격리는 존재하는 세포 모형의 정확한 표현을 얻기 위하여 필수적입니다. 방광은 다중 세포 모형을 포함하는 복잡한 기관이기 때문에, 비뇨기과 또는 기질 세포와 같은 몇몇 인구는 세포외 매트릭스 안에 존재하는 섬유아세포와 같은 그밖 세포 모형이 상대적으로 과소 표현될 수 있고 격리하기 어려울 수 있습니다. 방광이 척수 손상3,4 또는 방광 출구 방해5,6에서관찰되는 것과 같은 상당한 리모델링 및 섬유증을 겪은 경우 해리는 더욱 어려워진다.
여기서는 척수 손상 마우스 방광에서 하류 단일 세포 분석을 위한 최적화된 조직 해리 방법을 설명합니다. 유동 세포측정을 사용하여, 우리는 단 하나 세포 현탁액을 산출하고, 세포 생존가능성을 지원하며, 세포 집단의 정확한 비율을 유지하는 그들의 능력을 위한 4개의 효소 소화 프로토콜을 비교했습니다. 이 분석에 기초하여, 우리는 세포 사멸, 세포 응집체, 비 세포 핵산 및 다운스트림 분석의 잠재적억제제를 최소화하는 것이 고품질 데이터를 달성하는 데 중요하다는 결론을 내립니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 X Magnifying Loupes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle</td>
			<td>ETHICON</td>
			<td>J546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCR005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89049-168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>118213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, &#954;, Clone 30-F11</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1x2 teeth, 3.75&#34; length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-5172</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2115-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75&#34; length</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-6412</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1450003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Staining Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type III</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS004182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 6</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS005319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 &#38; Propidium Iodide (PI)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>V13241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4693-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enrofloxacin (Baytril)</td>
			<td>Bayer Health Care LLC,</td>
			<td>NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP</td>
			<td>2.27% Injectable Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 ml conical centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>122505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase from sheep testes, Type II</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Inc.</td>
			<td>130-110-917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4&#34; length, 0.15mm tip width</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td>
			<td>RS-5630</td>
			<td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-891-7959</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115509</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD3&#949; Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100309</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100409</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100709</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108715</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, &#954;, affinity purified</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116209</td>
			<td>Dump Channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, &#954;, Clone 2.4G2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10X)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer 1x</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89004-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin)</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-893-7216</td>
			<td>skin protectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A1217701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetropolycin eye ointment</td>
			<td>Dechra Veterinary Products</td>
			<td>NADA # 065-016. Approved by FDA.</td>
			<td>protect eyes during anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a single cell dissociation approach for molecular analysis of urinary bladder in the mouse following spinal cord injury

우리는 분리기 괄약근 dyssynergia, 기능성 방광 출구 방해 및 후속 방광 벽 리모델링을 유도하기 위하여 마우스에 있는 척수 손상의 구현을 기술합니다. 비부상 조절및 척수 손상마우스에서 방광벽의 세포구성평가를 용이하게 하기 위해 높은 세포 생존가능성을 지원하고 유동 세포측정에 의한 이산 하위집단의 검출을 가능하게 하는 최적화된 해리 프로토콜을 개발했습니다.
척수 손상은 흉부 척수의 완전한 transection에 의해 생성됩니다. 조직 수확 시, 동물은 깊은 마취 하에 인산염 완충식식염으로 침투하고 방광은 티로드의 완충제로 수확됩니다. 조직은 공개적으로 이용 가능한 유전자 발현 데이터베이스의 심문에 의해 결정된 마우스 방광의 콜라겐 함량에 기초하여 최적화된 소화 완충제에서 인큐베이션 하기 전에 다진다. 단일 세포 현탁액의 생성에 이어, 물질은 세포 생존가능성, 세포 수 및 특정 하위 집단의 평가를 위한 유동 세포측정에 의해 분석된다. 우리는 이 방법이 90% 이상의 생존력을 가진 세포 집단을 산출하고, 중간엽 및 상피 기원의 세포의 견고한 표현을 산출한다는 것을 보여줍니다. 이 방법은 마우스 방광 및 잠재적으로 다른 장기에 있는 개별적인 세포 모형의 정확한 다운스트림 분석을 가능하게 할 것입니다.

수술 흉부 척수 흉부의 성공은 여러 매개 변수의 평가에 의해 결정되며, 그 중 가장 명백한 것은 뒷다리 마비입니다. 동물은 앞다리를 사용하여 뒷다리를 드래그합니다. 그렇지 않으면 수유, 그루밍 및 경보를 포함한 활동 수준은 일반적으로 정상입니다. 또한, 동물은 12시간마다 조사관이 수동 방광 발현을 필요로 하는 의지에 따라 10~14일 후에 반사 블렌딩이 반환될 때까지 의지에 따라 방광 조절을 잃게 된다. 안락사 다음, 부상의 성공의 추가 징후는 주로 방광 대 체중 비율의 증가와 관련이, 조직 리모델링의 표시. 조직학적 분석은 비뇨기과 민원 근육 구획3내의 증식을 나타낸다.
단일 셀 서스펜션 의 준비 공개적으로 이용 가능한 발현 데이터를 사용하여 세포외 매트릭스 단백질용 방광 조직의농축(도 2)을결정하고 소화 믹스의 제형을 알리는 데 사용하였다. 콜라겐은방광벽(11,12)의핵심 성분이기 때문에, 먼저 마우스 ENCODE프로젝트(13)에의해 생성된 RNA 프로파일링 데이터 세트를 사용하여 마우스 방광에서 가장 풍부한 콜라겐(들)을 결정하기 위해 노력했다. 우리의 분석은 콜라겐 1A1, 콜라겐 3A1, 콜라겐 1A2 및 콜라겐 6A1이 마우스 방광 내의 가장 풍부한 콜라겐 유형임을 보여주었다(그림 2A). 우리는 또한 타불라 무리스 (마우스 (무스 무큘러스)에서 단일 세포 전사 데이터의보상)을 사용하여 콜라겐 1, 3, 6 및 히알루로난의 mRNA 발현 수준을 결정했습니다. 데이터는 조직 사이에서 공유된 세포 모형에 있는 유전자 발현의 직접 그리고 통제된 비교를 허용합니다. 이 분석은 이러한 세포외 매트릭스 성분의 발현이 비뇨기과(도2B)가아닌 중간엽 세포 유형에서 더 널리 퍼진 것으로 나타났다.
방광에서 고립 된 세포의 생존에 해리의 효과 유동 세포측정 분석은 4가지 프로토콜을 이용한 효소 소화가 각각 83%, 86%, 93% 또는 90%의 생존가능성을 산출한 것으로 나타났다. 따라서 프로토콜 섹션 3은 세포 생존가능성을 보존하는 데 가장 중요한 것으로 간주되었다. 또한 세포의 약 4%가 괴사(PI +/부속서V-)(도 4A)인것을 관찰하였다. 이러한 관찰은 소화 프로토콜의 효율성과 세포 생존가능성에 대한 후속 이점을 강조합니다.
방광에 있는 세포의 다른 인구에 척수 손상의 효력 우리는 대조군에 비해 SCI 마우스의 방광에 있는 총 세포 수에 있는 중요한 증가를 관찰했습니다. SCI 방광에서 얻은 점 플롯의 패턴은 또한 척수 손상으로 인한 지속적인 장기 리모델링과 약간 달랐다(그림 4B: 첫 번째 컬럼). 대조군과 비교하여 SCI 동물의 방광은 CD45 양성 세포의 상당한 증가를 보였습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg"> 그림 1: 간의 밝은 색상으로 대표적인 관류 완료. (A)관류의 시작 부분에 간 색을 보여줍니다. (B)관류의 끝에 밝은 간 색을 표시합니다. 마우스 (A)는 관류 2 주 전에 척수 트란담을 가지고 있었고, 그 결과 척수 손상이없는 마우스 (B)에서 마우스와 달리 골반에서 방광 비대 및 돌출이 발생했습니다. 이 경우 방광은 작고 골반에 숨겨져 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg"> 그림 2: 마우스 방광에서 세포외 매트릭스(ECM) 성분의 전사적 발현. (A)43가지 콜라겐 타입의 바 차트. 표현은14(데이터는 BioProject: PRJNA66167)에서 수집된 백만 개의 매핑된 읽기당 1킬로베이스당 읽기에 의해 명시된다. (B)미생물액액액액계 3'-엔드계에서 수득된 세포 유형의 유전자 발현의 바이올린 플롯은 남성과 여성의 소화 된 오줌 방광 샘플(남성과 여성)의 풀에서 계산된다. 카운트는 백만 ln (CPM +1)8당 1 + 카운트의 천연 logarithm을 사용하여 각 셀에 대해 로그 정규화되었다. 로개스텀을 복용하기 전에 CPM 1의 의사 수가 추가되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg"> 그림 3: 게이팅 전략 및 FMO 제어를 통해 형광 확산을 결정합니다. (A)세포 집단의 선택. (B)싱글을 위한 게이팅 전략. (C)괴사용 게이팅, PI 및 부속서 V 항체를 이용한 초기 및 후기 세포. (D\u2012F) 다색 유동 세포측정의 회로도 플롯(예를 들어, A, B, C, D 불소크롬 +와 결합된 항체(부속서 V 및 PI). 이는 염색되지 않은 대조군과 비교하여 FMO 대조군에 의해 나타난 형광 A 채널로 항체로 확산되는 형광을 나타낸다. 주황색 점선은 빨간색의 얼룩지지 않은 경계에 비해 FMO 게이팅 경계를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg"> 그림 4: 방광에 있는 다른 세포 모형의 혈투 세포측정. (A)부속서 V/PI 더블 염색 흐름 차트. 각 프로토콜에 사용되는 효소와 화학 물질의 상이한 조합은 해당 생존성 플롯 앞에 표현된다. 이러한 데이터는 프로토콜 섹션 3에서 가장 높은 생존력을 얻었다는 것을 보여줍니다. (B)단일 채널에서 검출된 라이-6A/E(Sca-1) 및 CD326(Ep-CAM)의 강도를 보여주는 대표적인 히스토그램. (C)마우스 방광의 세포 집단에 대한 SCI의 효과. 상부 패널은 대조군 비수술용 마우스로부터 얻어진 3개의 해리된 방광에 염색의 결과를 보여주고 낮은 패널은 SCI를 가진 3개의 동물에 염색의 결과를 보여줍니다. 첫 번째 열은 총 세포 집단입니다. 두 번째 열에는 단일 게이팅 선택이 표시됩니다. 세 번째 컬럼은 B 세포, T 세포 및 NK 셀에 대해 부정적인 살아있는 세포의 하위 집단을 보여줍니다. 네 번째 열은 CD45에 대해 양성 라이브 셀에 대한 염색을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>양(500mL용)</td>
			<td>어러지니</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>4.091 g</td>
			<td>140 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>0.186 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>0.0476 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-포도당</td>
			<td>0.9 g</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>헤페스</td>
			<td>1.19 g</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: Tyrode의 솔루션을 준비하기 위한 구성 요소입니다. 표시된 구성 요소는 500mL Tyrode의 솔루션을 준비하기 위한 것입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>구성 요소</td>
			<td>금액</td>
			<td>프로토콜 섹션 1</td>
			<td>프로토콜 섹션 2</td>
			<td>프로토콜 섹션 3</td>
			<td>프로토콜 섹션 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>5 mg</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0.03 mM</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr>
<tr>
<td>콜라게나아제 타입 I</td>
			<td>132.5대</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr>
<tr>
<td>콜라게나아제 타입 III</td>
			<td>96.4대</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr>
<tr>
<td>콜라게나제 타입 VI</td>
			<td>50대</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>예</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>드나스</td>
			<td>10대</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>파파인</td>
			<td>115대</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr>
<tr>
<td>팬 콜라게나제</td>
			<td>50대</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr>
<tr>
<td>히알루로니다제</td>
			<td>10.5 대</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
		</tr>
<tr>
<td>디스파스 II</td>
			<td>1.25 대</td>
			<td>예</td>
			<td>예</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>세포 해리 솔루션</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>예</td>
			<td>-</td>
			<td>예</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>재조합 효소</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>예</td>
			<td>-</td>
			<td>예</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 소화 버퍼를 준비하기 위한 구성 요소입니다. 표시된 성분은 2.5mL 소화 믹스의 제조를 위한 것입니다(1 U는 37°C에서 분당 기질 1 μmol의 가수분해를 촉매한다. 각 효소의 단위의 정의를 위한 제품 데이터 시트를 참조하십시오).

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A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

이 프로토콜의 목표는 척수 손상의 마우스 모델에 최적화된 조직 해리 프로토콜을 적용하고 유동 세포측정에 의한 단일 세포 분석 접근법을 검증하는 것입니다.

척수 손상 다음 마우스에 있는 오줌 방광의 분자 분석을 위한 단 하나 세포 해리 접근

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...

a-single-cell-dissociation-approach-for-molecular-analysis-urinary

Research

JoVE Journal

Biology

5.4K 조회수.  Boston Children's Hospital. 이 프로토콜의 목표는 척수 손상의 마우스 모델에 최적화된 조직 해리 프로토콜을 적용하고 유동 세포측정에 의한 단일 세포 분석 접근법을 검증하는 것입니다.

비디오: A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

척수 전기 생리학

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

연구

생물학

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

휴대 통신 분석을위한 단일 세포 미세 주입

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapper 슈퍼 해상도 현미경을위한 오픈 소스 단일 입자 분석

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Cystometric and External Urethral Sphincter Measurements in Awake Rats with Implanted Catheter and Electrodes Allowing for Repeated Measurements

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually performed as terminal analysis under urethane anesthesia. It is well known that anesthetic drugs can influence bladder function. Hence, the aim of this technique is to perform cystometric measurements of the urinary bladder and external urethral sphincter in lightly restrained awake rats. For this purpose, a bladder catheter is implanted into the bladder dome. Subsequently, two electrodes are implanted bilateral to the external urethral sphincter and a ground electrode is sutured to a non-responsive skeletal muscle. The bladder catheter and the three electrodes are finally tunneled subcutaneously to the neck region and affixed to a harness. With this technique, the lower urinary tract can be measured at multiple time points in the same animal to assess lower urinary tract function. The main application of this technique is the follow-up of simultaneous urinary bladder and external urethral sphincter function in awake healthy rats and after induction of a disease or injury. Moreover, subsequent lower urinary tract monitoring can be performed during evaluation of the disease/injury and to monitor treatment efficacy.

This protocol first describes the surgical procedure of the permanent implantation of a urinary bladder catheter combined with external urethral sphincter electrodes, and second, the measurement of the function of the urinary bladder and external urethral sphincter in implanted awake animals.

반복된 측정에 대 한 수 있도록 전극 이식된 카 테 터와 깨어 있는 쥐에 Cystometric 및 외부 요도 괄약근 측정

Lower urinary tract function is mainly assessed by means of cystometric bladder function analysis in rodents. Conventional cystometries are usually ...

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms of human diseases such as cancer. Transgenic and conditional knockout mice have been frequently used for gene overexpression or ablation in specific tissues or cell types in vivo. However, generating germline mouse models can be time-consuming and costly. Recent advancements in gene editing technologies and the feasibility of delivering DNA plasmids by viral infection have enabled rapid generation of non-germline autochthonous mouse cancer models for several organs. The bladder is an organ that has been difficult for viral vectors to access, due to the presence of a glycosaminoglycan layer covering the urothelium. Here, we describe a novel method developed in lab for efficient delivery of DNA plasmids into the mouse bladder urothelium in vivo. Through intravesical instillation of pCAG-GFP DNA plasmid and electroporation of surgically exposed bladder, we show that the DNA plasmid can be delivered specifically into the bladder urothelial cells for transient expression. Our method provides a fast and convenient way for overexpression and knockdown of genes in the mouse bladder, and can be applied to building GEMMs of bladder cancer and other urological diseases.

We describe a novel method for the delivery of DNA plasmid into the urothelial cells of mouse bladder in vivo through urethra catheterization and electroporation. It offers a fast and convenient way for generating autochthonous mouse models of bladder diseases.

새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Zebrafish 독도에서 단일 셀 해상도 칼슘 이미징 사용 하 여 베타 세포 기능 분석

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.

Single-Nucleus RNA 시퀀싱을 위한 성인 마우스 신장에서 핵 분리

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are ...

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis beneath the injury site. To date, there is no functional recovery therapy for SCI, and there is a lack of clarity regarding the many complexes and dynamic events occurring after SCI. Many non-mammalian organisms can regenerate after severe SCI, such as teleost fishes, urodele amphibians, and larval stages of anuran amphibians, including Xenopus laevis tadpoles. These are bona fide model organisms to study and understand the response to SCI and the mechanisms underlying successful regenerative processes. This type of research can lead to the identification of potential targets for SCI therapeutic intervention. This article describes how to perform Xenopus laevis tadpole spinal cord transection, including husbandry, surgery, postsurgery care, and functional test evaluation. This injury method can be applied for elucidating the different steps of spinal cord regeneration by studying the cellular, molecular, and genetic mechanisms, as well as histological and functional evolution after SCI and during spinal cord regeneration.

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

Xenopus laevis tadpole spinal cord transection is a relevant injury method to study spinal cord injury and regeneration by making a transverse cut that completely severs the spinal cord at the thoracic level.

Xenopus laevis Tadpoles의 척수 Transection

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model organisms. However, despite this wealth of sequence information, comprehensive gene annotation efforts have proven challenging, especially for small proteins. Notably, conventional protein annotation methods were designed to intentionally exclude putative proteins encoded by short open reading frames (sORFs) less than 300 nucleotides in length to filter out the exponentially higher number of spurious noncoding sORFs throughout the genome. As a result, hundreds of functional small proteins called microproteins (&#60;100 amino acids in length) have been incorrectly classified as noncoding RNAs or overlooked entirely.
Here we provide a detailed protocol to leverage free, publicly available bioinformatic tools to query genomic regions for microprotein-coding potential based on evolutionary conservation. Specifically, we provide step-by-step instructions on how to examine sequence conservation and coding potential using Phylogenetic Codon Substitution Frequencies (PhyloCSF) on the user-friendly University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser. Additionally, we detail steps to efficiently generate multiple species alignments of identified microprotein sequences to visualize amino acid sequence conservation and recommend resources to analyze microprotein characteristics, including predicted domain structures. These powerful tools can be used to help identify putative microprotein-coding sequences in noncanonical genomic regions or to rule out the presence of a conserved coding sequence with translational potential in a noncoding transcript of interest.

The protocol described here provides detailed instructions on how to analyze genomic regions of interest for microprotein-coding potential using PhyloCSF on the user-friendly UCSC Genome Browser. Additionally, several tools and resources are recommended to further investigate sequence characteristics of identified microproteins to gain insight into their putative functions.

마이크로단백질 동정 및 서열 분석을 위한 통합 접근법

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...