이 사업은 삼성과학기술재단(프로젝트 번호 SSTF-BA1801-10)의 보조금으로 지원되었다.

<ol>
	<li>Gonzalez, W. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+ensemble+dynamics+underlying+a+long-term+associative+memory.">Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory.</a> Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).</li><li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time.">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Compact+Head-Mounted+Endoscope+for+In+vivo+Calcium+Imaging+in+Freely+Behaving+Mice.">A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Xiong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Cerebral+Vascular+Atlas+in+Stereotaxic+Coordinates+of+Whole+Mouse+Brain.">Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).</li><li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data.">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li><li>Millhouse, O. E., DeOlmos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+configurations+in+lateral+and+basolateral+amygdala.">Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala.</a> Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).</li><li>McDonald, A. 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숙련된 수술 기술은 우리가 여기에서 설명한 편도체와 같은 더 깊은 두뇌 지구에 있는 헤드 마운트 소형 현미경 검사법을 가진 생체 내 광학 칼슘 화상 진찰에서 성공을 달성하기 위해 필수적입니다. 따라서 이 프로토콜은 베이스플레이트 부착 및 GRIN 렌즈 이식의 최적화된 수술 과정에 대한 지침을 제공하지만 중요한 단계에 추가 최적화 프로세스가 필요할 수 있습니다. 프로토콜 섹션에서 언급했듯이 수술의 편도체 좌표, 기류 부착 단계의 기류 속도, 칼슘 레코딩 및 변수(ICA 측두중량, 이벤트 가장 작은 감쇠 시간등)에서이미지 수집 설정(프레임 속도, LED 전원등)을데이터 처리에 최적화할 필요가 있다.
베이스 플레이트 부착 단계를 수정할 수 있습니다. 헤드 플레이트는 모바일 홈 케이지에서 실시베이스 플레이트 부착 중에 깨어있는 마우스의 머리를 고정하는 데 도움이되기 때문에 필요합니다. 그러나, 이동식 홈 케이지가 실험실에서 준비되지 않은 경우, 이소플루란 가스 마취 시스템은 대안옵션이다. 이러한 대체 적인 방법으로, 이소플루란 가스의 농도중요 할 수 있습니다. 우리는 GCaMP 신호가 1.5% 이소플루란 이하마우스의 편도체에서 거의 검출되지 않는 것을 관찰했습니다. 반대로, GCaMP 신호는 0.8%의 이소플루란 상태하에서 검출되고 마우스는 거의 깨어 있는 상태에 머무르지만 이 조건에서 실질적인 머리 움직임없이 유지된다. 이러한 마취 조건은 따라서 헤드 플레이트 및 모바일 홈 케이지와 같은 추가 장치를 사용하지 않고 베이스 플레이트 부착을 수행 할 수 있습니다.
두개골 나사, 시멘트, 베이스 플레이트 및 현미경의 불안정한 부착은 모션 보정 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 수정할 수 있는 모션 아티팩트를 유발할 수 있습니다. 측면 심실의 움직임은 현재 사용 가능한 모션 보정 소프트웨어로 쉽게 수정할 수 없는 불규칙한 유형의 모션 아티팩트를 유발할 것으로 생각됩니다. 이러한 불규칙한 운동 유물은 해마와 피질과 같은 대부분의 피상적 인 뇌 영역에서 최소화됩니다. 그러나 편도체에서 광학 이미징 중에 자주 감지됩니다. 이 문제를 극복하기 위해, 이 프로토콜은 바이러스 주사 부위에서 50 μm 떨어진 GRIN 렌즈를 측면측(도 1C)에이식하여 측면 심실에서 유래한 잠재적 모션 아티팩트를 감소시킴으로써 이미지 수집 과정을 크게 향상시키는 것을 제안합니다. 우리는 바이러스 주사 부위에 비해 50 μm을 설정하지만, 렌즈 이식에 대한 표적 좌표는 또한 측면 심실에 비해 설정 될 수있다. 이 프로토콜에서, 우리는 화상 진찰의 성공적인 성과를 위해 바이러스 표현 사이트를 정확하게 표적으로 하는 것이 더 중요하다고 추론했습니다. 따라서, 우리는 렌즈 이식의 표적 좌표를 설정하는 기준으로 바이러스 주사 좌표를 사용했다. 반복된 시험을 통해 GRIN 렌즈가 바이러스 발현 부위를 효율적으로 타겟팅하는 동시에 측면 심실 운동으로 인한 모션 아티팩트를 피할 수 있는 최적의 조건을 확립했습니다. 결국, 모든 모션 아티팩트를 효율적이고 정확하게 교정할 수 있는 방법은 향후 더 깊은 뇌 영역에 대한 광학 이미징에 액세스하는 데 큰 도움이 될 것입니다.
헤드 마운트 소형 현미경을 가진 생체 내 광학 칼슘 이미징은 강력한 도구이며 최적화되었지만 여전히 많은 측면에서 개선의 여지가 있습니다. 이 프로토콜은 자유롭게 행동하는 동물의 편도체에서 실시간 신경 활동을 조사하는 것을 목표로 하는 연구를 용이하게 할 것입니다.

칼슘은 거의 모든 세포 기능8에서중요한 역할을하는 유비쿼터스 두 번째 메신저입니다. 뉴런에서, 작용 잠재력 발사 및 시냅스 입력은 세포내 무료 [Ca2+]9,10의급격한 변화를 일으킨다. 따라서 칼슘 과도를 추적하면 신경 활동을 모니터링 할 수있는 기회를 제공합니다. GECI는 정의된 세포 인구 및 셀룰러 내구획(11,12)에서[Ca2+]모니터링을 허용하는 강력한 도구입니다. 단백질 기반 칼슘 표시기의 많은 다른 모형 중, GCaMP, 단일 GFP 분자13에근거를 둔 Ca2+ 프로브는, 가장 최적화되고 이렇게 널리 사용되는 GECI입니다. 여러 차례의 엔지니어링을 통해 GCaMP의 여러 변형이12,14,15,16을개발했습니다. 우리는 이 프로토콜16에서최근에 개발된 GCaMPPs, GCaMP7b 중 하나를 사용합니다. GCaMP센서는 개발 17 동안 Ca2+ 과도의 이미징, 특정 피질층(18)에서의생체 이미징, 모터 작업 학습19의 회로 역학 측정 및 해마및 대미20의 연관 공포 기억과 관련된 세포 앙상블 활동의이미징과 같은 다수의 모델 유기체에서 신경 회로 기능의 연구에 크게기여했다.
GECIs의 광학 이미징은 몇 가지 장점이있습니다 22. 유전 인코딩을 통해 GECI는 유전자 프로파일 또는 해부학 적 연결의 특정 패턴에 의해 정의되는 세포의 특정 하위 집합에서 장기간 안정적으로 표현 될 수 있습니다. 광학 이미징은 살아있는 동물에서 수백에서 수천 개의 뉴런을 생체 내에서 만성 동시 모니터링할 수 있게 합니다. 몇몇 광학 이미징 시스템은 헤드 마운트 소형형 광소 현미경21,23,24,25로마우스를 자유롭게 행동하는 뇌 내에서 GECIs의 생체 이미징 및 분석을 위해 개발되었다. GECIs, GRIN 렌즈 및 헤드 마운트 소형 현미경을 기반으로 한 생체 내 광학 이미징 기술이 신경 회로 활동과 행동 사이의 연관성을 연구하는 강력한 도구임에도 불구하고, 편도체에 이 기술을 적용하는 것은 GRIN 렌즈를 미막도라에서 GEC를 표현하는 세포에 표적화하는 것과 관련된 몇 가지 기술적 문제로 인해 어려웠으며, 이는 GEC의 이미지를 심각하게 저하시키는 동작 아티팩트를 유발하고 이미지를 저하시키는 데 방해가 되고 있다. 이 프로토콜은 편도체에서 생체 내 광학 칼슘 이미징에서 성공적인 단계를 위한 중요한 단계인 베이스플레이트 부착 및 GRIN 렌즈 이식의 외과 적 절차에 유용한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 편도체를 대상으로하지만, 여기에 설명 된 대부분의 절차는 일반적으로 다른 깊은 뇌 영역에 적용됩니다. 이 프로토콜은 특정 시스템(예: Inscopix)을 기반으로 하지만 다른 대체 시스템에서동일한 목적을 쉽게 달성할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>26G needle</td><td>BD</td><td>302002</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE</td><td>Addgene</td><td>104493-AAV1</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>AAV2/1-CaMKii&amp;alpha;-GFP</td><td>custom made</td><td></td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink)</td><td>Lang</td><td>1334-pink</td><td>Surgery &amp;amp; Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Air flow manipulator</td><td>Neurotar</td><td>NTR000253-04</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Amoxicillin</td><td>SIGMA</td><td>A8523-5G</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Baseplate</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002192</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Baseplate cover</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002193</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Behavioral apparatus (chamber)</td><td>Coulbourn Instrument</td><td>Testcage</td><td>Behavior test</td></tr><tr><td>Behavioral apparatus (software)</td><td>Coulbourn Instrument</td><td>Freeze Frame</td><td>Behavior test</td></tr><tr><td>Carbon cage</td><td>Neurotar</td><td>180mm x 70mm</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>SIGMA</td><td>PHR1452-1G</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Data processing software</td><td>INSCOPIX</td><td>INSCOPIX Data Processing Software</td><td>Baseplate Attachment &amp;amp; Behavior test</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>SIGMA</td><td>D1756-500MG</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Drill</td><td>Seyang</td><td>marathon-4</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Drill bur</td><td>ELA</td><td>US1/2, Shank104</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Glass needle</td><td>WPI</td><td>PG10165-4</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002208</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Hamilton Syringe</td><td>Hamilton</td><td>84875</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Head plate</td><td>Neurotar</td><td>Model 5</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Hex-key</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004195</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Laptop computer</td><td>Samsung</td><td>NT950XBV</td><td>Surgery &amp;amp; Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004223</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Microscope gripper</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002199</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Microscope, DAQ software, hardware</td><td>INSCOPIX</td><td>nVista 3.0</td><td>Baseplate Attachment &amp;amp; Behavior test</td></tr><tr><td>Mobile homecage</td><td>Neurotar</td><td>MHC V5</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>Moterized arm</td><td>Neurostar</td><td>Customized</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Moterized arm software</td><td>Neurostar</td><td>Customized</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>NI board</td><td>National instrument</td><td></td><td>Behavior test</td></tr><tr><td>Removable epoxy bond</td><td>WPI</td><td>Kwik-Cast</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Resin cement (Super-bond)</td><td>Sun medical</td><td>Super bond C&amp;amp;B</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Skull screw</td><td>Stoelting</td><td>51457</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Stereotaxic electrode holder</td><td>ASI</td><td>EH-600</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Stereotaxic manipulator</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td>Baseplate Attachment</td></tr></tbody></table>

successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse

자유롭게 움직이는 동물에서 신경 활동의 생체 내 실시간 모니터링은 행동에 신경 활동을 연결하는 주요 접근 법 중 하나입니다. 이를 위해, 유전자 인코딩된 칼슘 지표(GECIs), 소형형 형광 현미경, 그라데이션 굴절지수(GRIN) 렌즈를 사용하여 뉴런의 칼슘 과도를 검출하는 생체 내 이미징 기술이 개발되어 많은 뇌 구조1,2,3,4,5,6에성공적으로 적용되었다. 이 화상 진찰 기술은 최대 몇 주까지 장기 기간 동안 유전으로 정의된 세포 집단의 만성 동시 화상 진찰을 가능하게 하기 때문에 특히 강력합니다. 유용하지만, 이 화상 진찰 기술은 편도체, 정서적 처리 및 연관 공포 기억 기억7을위한 필수적인 두뇌 구조물과 같은 두뇌 내깊은 찾아내는 두뇌 구조물에 쉽게 적용되지 않았습니다. 편도체에 이미징 기술을 적용하는 것을 어렵게 만드는 몇몇 요인이 있습니다. 예를 들면, 운동 유물은 일반적으로 두뇌에 있는 깊은 이식된 헤드 마운트 현미경이 상대적으로 불안정하기 때문에 더 깊은 두뇌 지구에서 실시하는 화상 진찰 도중 더 빈번해 깁니다. 또 다른 문제는 측면 심실이 이식된 GRIN 렌즈에 가깝게 위치하고 호흡 도중의 움직임이 쉽게 교정할 수 없는 고불규칙한 동작 아티팩트를 유발할 수 있어 안정적인 이미징 뷰를 형성하기가 어렵다는 것입니다. 더욱이, 편도체내의 세포는 일반적으로 휴식 또는 마취 상태에서 조용하기 때문에, 나중에 이미징을 위한 기질도금 절차 도중 편도체에서 GECI를 발현하는 표적 세포를 찾아 서 집중하기 어렵다. 이 프로토콜은 이러한 깊은 뇌 영역에서 생체 내 칼슘 이미징을 성공적으로 위해 헤드 마운트 소형 현미경으로 편도체에서 GECI를 발현하는 세포를 효율적으로 표적으로 하는 방법에 대한 유용한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜은 특정 시스템(예: Inscopix)을 기반으로 하지만 제한되지는 않습니다.

GRIN 렌즈 이식 의 검증 만성적으로 시멘트를 통해 뇌에 베이스 플레이트를 부착하기 전에 GRIN 렌즈 이식을 검증해야 합니다. 렌즈 이식이 성공한 동물의 경우, GCaMP 발현 세포와 혈관 모두 현미경의 객관적인 렌즈와 이식된 GRIN렌즈(그림 2A 및 B)사이의거리에 의해 결정된 초점 평면 범위 내에서 명확하게 관찰되었다. 대조적으로, 오프 타겟 이식을 가진 동물에서는, GCaMP 발현 세포의 명확한 심상이 초점 평면 범위 내에서 관찰되지 않았습니다 (초점이 외하거나 보이지 않는). 초점이 맞지 않는 경우, 잘 초점을 맞춘 혈관을 관찰할 수 있지만 초점 평면 범위 내의 세포에 대해서만 흐릿한이미지(그림 2C및 D). 보이지 않는 경우, 혈관은 대부분의 경우 관찰되지 않았으며 초점 평면 범위 내에서 형광 신호가 검출되지않았다(도 2E). 더욱이, 다른 경우와 달리, 이식된 GRIN 렌즈는 밝은가장자리(도 2F)를보였다. 베이스 플레이트 부착은 표적 GRIN 렌즈 이식을 가진 검증된 동물에서만 수행됩니다.
청각 자극에 대한 응답으로 LA 뉴런에서 GCaMP 신호 기록 본 프로토콜에서, 4개의 인스턴스는 마우스에 2.8kHz, 200ms 지속시간, 25펄스)를 마우스에 제시하였고, GCaMP 신호는 헤드 마운트 미크엔도스코프를 가진 마우스의 LA 세포에 광학적으로 기록되었다. 일방적인 측면 편도체에서 AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE를 주입한 마우스는 이미징에 사용되었다. 성공적인 GRIN 렌즈 이식을 가진 동물에서는, 세포및 혈관을 발현하는 바이러스는 초점 평면 범위 내에서 명확하게 관찰되었다(도3A). 동작 조건에서, 약 50-150 세포는 일반적으로 ΔF/F 영상에 도시된 바와 같이 톤 없이도 LA에서 시야에서 상당한 형광 변화를 나타내며, 자발적으로 활성세포(도 3B). 톤 프리젠 테이션시, 단지 몇 세포는 ΔF / F 이미지 분석에 의해 결정된 GCaMP 신호의 톤 별 변화를 표시 (도 3C 및 도 3D의6 셀). 동일한 절차는 대조군으로서 AAV2/1-CaMKIIα-GFP로 주입된 마우스에 대해 수행되었다. GFP 발현 세포는 초점 평면 범위 내에서 검출되었지만, ΔF/F 이미지분석(도 3E 및 도 3F)에의해 결정된 톤 유무에 관계없이 유의한 형광 변화를 표시한 세포는 없다.
GCaMP 발현및 GRIN 렌즈의 표적화에 대한 조직학적 검증을 위해, 사후 뇌의 관상적 부분은 형광현미경(도 4A 및 도 4B)에따라 검사된다. DAPI 염색은 GRIN렌즈(도 4C)주위의뇌 조직의 염증으로 인한 손상과 손상의 손상의 흔적을 확인하기 위해 사용된다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61659/61659fig1.jpg"> 그림 1: LA에서 생체 내 미세 내시경 칼슘 이미징을 위한 입체적 수술용 회로도 워크플로우 및 다이어그램. (A) LA에서 생체 내 미세 엔도스코픽 칼슘 이미징의 회로도 워크플로우. (B) 바이러스 주사 및 GRIN 렌즈 임플란트 수술을 위한 두개부 절제술 부위의 2차원 좌표를 보여주는 현미경 사진. 두 개의 두개골 나사와 렌즈는 동등한 삼각형을 형성합니다. (C) 바이러스 주입 부위와 이식된 GRIN 렌즈 사이의 상대적 위치에 대한 다이어그램, 그리고 "값 A"를 계산하기 위한 회로도 설명. (D) 수술의 마지막 단계에서 두개골 표면에서 헤드 플레이트에 시멘트 층의 단면. 수지 치과 시멘트는 나사와 이식 된 GRIN 렌즈의 벽을 덮어야합니다. 아크릴 시멘트는 수지 치과 시멘트에 적용됩니다. 헤드 플레이트는 시멘트 층에 부착됩니다. 파라핀 필름은 이식된 GRIN 렌즈 표면을 덮고 먼지로부터 보호합니다. 탈착식 에폭시 본드는 파라핀 필름의 분리를 방지합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61659/61659fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61659/61659fig2.jpg"> 도 2: 베이스플레이트 부착 후 GRIN 렌즈 이식 및 시멘트 층 구성의 유효성 검사. (A) 성공적인 GRIN 렌즈 이식을 가진 동물의 대표적인 내시경 스냅샷 이미지. GCaMP 발현 세포와 혈관 은 명확하게 관찰된다. (B) 성공적인 GRIN 렌즈 이식을 가진 동물로부터 이식된 GRIN 렌즈 표면의 스냅샷 이미지. (C) 초점이 아닌 GRIN 렌즈 이식을 가진 동물의 대표적인 내시경 스냅샷 이미지. (D) 초점이 아닌 GRIN 렌즈 이식을 받은 동물로부터 이식된 GRIN 렌즈 표면의 스냅샷 이미지. 초점이 닿지 않는 경우 혈관은 때때로 명확하게 관찰되지만 초점 평면 범위 내의 세포에 대한 흐릿한 이미지만 관찰됩니다. (E) 시야가 다른 GRIN 렌즈 이식을 가진 동물의 대표적인 내시경 스냅샷 이미지입니다. 보이지 않는 경우, 혈관은 대부분의 경우 관찰되지 않으며 초점 평면 범위 내에서 형광 신호가 검출되지 않습니다. (F) 시야가 없는 GRIN 렌즈 이식을 받은 동물의 이식된 GRIN 렌즈 표면의 스냅샷 이미지입니다. 다른 경우와 달리 이 경우 밝은 가장자리가 관찰됩니다. (G) 베이스 플레이트 부착을 위한 시멘트 층의 구성. 베이스 플레이트와 헤드 플레이트는 아크릴 시멘트에 의해 부착됩니다. 베이스 플레이트와 GRIN 렌즈 사이에 아크릴 시멘트로 채워지지 않은 공간이 있어야 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61659/61659fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61659/61659fig3.jpg"> 그림 3: LA 뉴런에서 GCaMP 신호 기록. (A ~ C) AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE를 주입한 마우스로부터 얻은 데이터. (A) 동작 테스트 중 대표적인 내시경 스냅샷 이미지입니다. GCaMP7b 발현 세포및 혈관은 초점 평면 범위 내에서 명확하게 관찰되었다. (B) ΔF/F 신호를 보여주는 대표적인 스냅샷 이미지입니다. 백색선은 행동 시험 도중 관심 있는 지역에 있는 중요한 형광 변경을 표시한 세포를 표시합니다. 배율 막대 = 50 μm. (C) 최대 강도 투영 이미지. 총 6개의 셀은 GCaMP 신호의 톤별 변화를 나타냈다. 스케일 바 = 50 μm. (D) 톤 반응 셀의 대표 ΔF / F 추적. 각 색상은 패널(C)에서 동일한 색상을 가진 각 개별 셀에 해당합니다. (E와 F) AAV2/1-CaMKIIα-GFP를 주입한 마우스로부터 얻은데이터. (E) 동작 테스트 중 대표적인 내시경 스냅샷 이미지입니다. GFP 발현 세포는 초점 평면 범위 내에서 명확하게 검출되었다. (F) ΔF/F 신호를 보여주는 대표적인 스냅샷 이미지입니다. 스케일 바 = 50μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61659/61659fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61659/61659fig4.jpg"> 도 4: GRIN 렌즈 위치 및 GCaMP7b 발현의 조직학적 검증. (A) LA에서 GCaMP7b 발현을 나타내는 대표적인 관상 섹션 이미지. 스케일 바 = 200μm. (B) 확대 된 이미지. 스케일 바 = 50 μm. (C) DAPI 염색 신호를 나타내는 형광 현미경 이미지. 스케일 바 = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61659/61659fig4large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>요소</td>
			<td>값</td>
		</tr>
<tr>
<td>공간 다운 샘플링 계수</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>시간적 다운 샘플링 계수</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>공간 필터: 높은 컷오프</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>공간 필터: 낮은 컷오프</td>
			<td>0.005</td>
		</tr>
<tr>
<td>모션 보정: 높은 컷오프</td>
			<td>0.016</td>
		</tr>
<tr>
<td>모션 보정: 낮은 컷오프</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>모션 보정: 최대 번역</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>ΔF/F 레퍼런스 프레임</td>
			<td>평균 프레임</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: 블록사이즈</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: 수렴임계값</td>
			<td>1x10^-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: icaTemporalWeight</td>
			<td>0.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: numIC</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: numPC</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>PCA/ICA: 언믹스 타입</td>
			<td>시간적</td>
		</tr>
<tr>
<td>이벤트 감지: 붕괴 상수</td>
			<td>1.18</td>
		</tr>
<tr>
<td>이벤트 감지: 임계값</td>
			<td>4</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 데이터 처리를 위한 변수 목록

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Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

생체 내 미세 엔도스코픽 칼슘 이미징은 자유롭게 행동하는 동물의 신경 활동을 실시간으로 모니터링 할 수있는 귀중한 도구입니다. 그러나, 편도체에 이 기술을 적용하는 것은 어려웠습니다. 이 프로토콜은 마우스에 있는 소형화된 현미경으로 편도체 세포를 성공적으로 표적으로 하기 위한 유용한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다.

자유롭게 행동하는 마우스의 편도체에 있는 머리 산 소형 현미경을 가진 성공적인 생체 내 칼슘 화상 진찰

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

successful-vivo-calcium-imaging-with-head-mount-miniaturized

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.2K 조회수.  Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). 생체 내 미세 엔도스코픽 칼슘 이미징은 자유롭게 행동하는 동물의 신경 활동을 실시간으로 모니터링 할 수있는 귀중한 도구입니다. 그러나, 편도체에 이 기술을 적용하는 것은 어려웠습니다. 이 프로토콜은 마우스에 있는 소형화된 현미경으로 편도체 세포를 성공적으로 표적으로 하기 위한 유용한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다.

비디오: Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

연구

생물학

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

신경과학

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit functions in systems neuroscience. However, high absorbance and scattering of light in mammalian tissue limit intravital imaging mostly to superficial brain regions, leaving deep-brain areas, such as the hippocampus, out of reach for optical microscopy. In this video, we show the preparation and implantation of the custom-made imaging window to enable chronic in vivo imaging of the dorsal hippocampal CA1 region in head-fixed behaving mice. The custom-made window is supplemented with an infusion cannula that allows targeted delivery of viral vectors and drugs to the imaging area. By combining this preparation with wide-field imaging, we performed a long-term recording of neuronal activity using a fluorescent calcium indicator from large subsets of neurons in behaving mice over several weeks. We also demonstrated the applicability of this preparation for voltage imaging with single-spike resolution. High-performance genetically encoded indicators of neuronal activity and scientific CMOS cameras allowed the recurrent visualization of subcellular morphological details of single neurons at high temporal resolution. We also discuss the advantages and potential limitations of the described method and its compatibility with other imaging techniques.

This article demonstrates the preparation of a custom-made imaging window supplemented with infusion cannula and its implantation onto the CA1 region of the hippocampus in mice.

마우스를 면도하는 해마에서 신경 활동을 시각화하기위한 두개골 절제술 절차

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages over conventional multi-photon calcium imaging systems: (1) compact; (2) light-weighted; (3) affordable; and (4) allows recording from freely behaving animals. This protocol describes brain surgeries for deep brain in vivo calcium imaging using a custom-developed miniscope recording system. The preparation procedure consists of three steps, including (1) stereotaxically injecting the virus at the desired brain region of a mouse brain to label a specific subgroup of neurons with genetically encoded calcium sensor; (2) implantation of gradient-index (GRIN) lens that can relay calcium image from deep brain region to the miniscope system; and (3) affixing the miniscope holder over the mouse skull where miniscope can be attached later. To perform in vivo calcium imaging, the miniscope is fastened onto the holder, and neuronal calcium images are collected along with simultaneous behavior recordings. The present surgery protocol is compatible with any commercial or custom-built single-photon and two-photon imaging systems for deep brain in vivo calcium imaging.

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo calcium imaging is a powerful technique to study neuronal dynamics and microcircuits in freely behaving mice. This protocol describes performing brain surgeries to achieve good in vivo calcium imaging using a miniscope.

입체 택시 바이러스 주입 및 생체 내 심부 뇌를위한 그라디언트 인덱스 렌즈 이식

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Superior Colliculus의 Two-photon 및 Wide-field Calcium 이미징

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

저자 스포트라이트: Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

생쥐의 치상동맥 세포에서 뉴런 활성을 위한 실시간 이미징 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal activity in awake animals during behavior tasks. Since the hippocampus is closely associated with episodic and spatial memory, it has become an essential brain region in&#160;this field&#39;s research. In recent research, engram cells and place cells were studied by recording the neural activities in the hippocampal CA1 region using the miniature microscope in mice while performing behavioral tasks including open-field and linear track. Although the dentate gyrus is another important region in the hippocampus, it has rarely been studied with in vivo imaging due to its greater depth and difficulty for imaging. In this protocol, we present in detail a calcium imaging process, including how to inject the virus, implant a GRIN (Gradient-index) lens, and attach a base plate for imaging the dentate gyrus of the hippocampus. We further describe how to preprocess the calcium imaging data using MATLAB. Additionally, studies of other deep brain regions that require imaging may benefit from this method.

저자 스포트라이트: Investigating Neural Activity of Dentate Gyrus Granule Cells with Miniature Microscope(소형 현미경으로 치상골 과립 세포의 신경 활동 조사)

The dentate gyrus of the hippocampus carries out essential and distinct functions in learning and memory. This protocol describes a set of robust and efficient procedures for in vivo calcium imaging of granule cells in the dentate gyrus in freely moving mice.

In Vivo: Calcium Imaging of Granule cells in the dentate gyrus of hippocampus in mice(생쥐의 해마 치열계에 있는 과립 세포의 In vivo 칼슘 이미징) 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

자유롭게 행동하는 마우스의 편도체에 있는 머리 산 소형 현미경을 가진 성공적인 생체 내 칼슘 화상 진찰

요약

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Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

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