이 논문은 투석 방법과 실온에서 시투 X 선 회절 실험을 통해 온칩 단백질 결정화를 위해 개발된 미세 유체 칩의 제조 프로토콜을 설명합니다. 이러한 마이크로칩의 주요 장점 중 하나는 제조 재료의 선택으로 실온에서 시투 X선 회절 데이터 수집에 호환되는 칩을 렌더링하는 것입니다. 온칩 결정화 실험은 소량의 단백질 샘플이 필요하며, 이러한 고부가가치 거대 분자로 작업하는 전체 비용을 줄입니다.
온칩 결정화는 또한 기존의 결정학 실험 중에 극저온 냉각과 함께 자주 적용되는 연약한 단백질 결정의 수동 수확을 제거합니다. 또한, 당사의 마이크로칩은 단백질 결정화를 위한 미세투약제(microdialis)를 사용하며, 이는 반투과성 멤브레인을 통해 침전물 농도를 평형화하는 것을 목표로 하는 확산 기반 방법이며, 단백질 결정화를 위한 크로물성 농도에 접근하고 결정화 조건에 대한 정확하고 가역적인 제어를 가능하게 합니다. 온도 조절과 결합된 미량 투약은 동일한 단백질 샘플을 사용하는 동안 침전물 농도를 변경하여 위상 다이어그램을 조사하기 위한 결정 성장으로부터 핵을 분리하는 데 사용될 수 있다.
먼저 50 그램의 PDMS 실리콘 베이스를 준비하고 10 대 1 질량 비율로 경화제입니다. 두 가지 재료를 비커에 주걱으로 섞습니다. 혼합 후, 모든 기포를 제거하기 위해 진공 챔버에 혼합물을 배치합니다.
제1 SU8에 25그램의 미리 혼합된 PDMS를 넣어 미세 유체 채널과 기둥의 패턴을 최대 5밀리미터까지 마스터합니다. 그런 다음 나머지 25그램의 PDMS를 두 번째 SU8 마스터에 부어 기둥의 패턴만 포함합니다. 오븐에서 2개의 PDMS 층을 338 켈빈에서 1시간 동안 치료합니다.
SU8 마스터의 패턴 주위에 경화 된 PDMS 층을 메스로 자르고 실리콘 마스터에서 PDMS 금형을 부드럽게 벗깁니다. 위쪽으로 향하는 패턴이 있는 견고한 현미경 유리 슬라이드에 채널과 기둥을 모두 갖춘 PDMS 금형을 배치합니다. 단백질 챔버로 설계된 PDMS 금형의 중앙 기둥을 커버하기 위해 재생 셀룰로오스 투석 막의 작은 조각을 잘라.
투석막의 분자량 차단은 단백질 샘플의 분자량 및 결정화 용액의 침전제에 따라 선택된다. 그런 다음 재생된 셀룰로오스 투석 막의 건조 조각을 조심스럽게 분리합니다. 분리된 투석 막의 작은 조각을 잘라냅니다.
멤브레인의이 조각의 크기는 칩의 디자인에 따라 달라집니다. 그리고 구체적으로, 그것은 중앙 기둥의 치수에 따라 달라집니다. 유리 슬라이드에서 지원되는 PDMS 금형의 중앙 기둥에 투석 막조각을 예치하고 기둥과 채널이 위쪽으로 향합니다.
그런 다음 두 번째 PDMS 금형은 유리 슬라이드에서 이미 지원되는 PDMS 금형 위에 아래쪽을 향한 기둥만 을 특징으로 합니다. 두 PDMS 금형의 모든 기둥을 정렬합니다. 재생된 셀룰로오스 투석 막의 조각은 PDMS 금형의 두 중앙 기둥 사이에 끼어 있습니다.
제조 절차의 이 단계는 광학 현미경에서 또는 단순히 모든 기둥의 정렬을 주의 깊게 검사하여 수행 될 수있다. PDMS 금형 내의 갇힌 기포를 제거하고, 포토치료 가능한 NOA 수지의 삽입을 강화하기 위해 진공 챔버에 조립을 배치하고 30분 동안 담정을 하고, 이 프로토콜의 다음 단계에서 설명될 것이다. 진공 챔버에서 어셈블리를 제거하고 모세관 임비비티온에 의해, 포토 치료 가능한 티올린 계 수지, NOA 81로 두 PDMS 금형 사이의 빈 공간을 채웁니다.
어셈블리의 네 면 중 3개에 수지를 적용합니다. 조립을 크로스 링커에 놓고 평방 센티미터당 35밀리와트의 정렬 된 UV 램프를 사용하여 8 초 동안 UV 광에 노출하여 NOA 수지를 치료하십시오. 현미경 유리 슬라이드의 표준 치수에 175 마이크로 미터 두께의 PMMA 조각을 잘라, PMMA 조각의 각 측면에서 플라스틱 보호를 벗겨.
첫 번째 UV 노출이 완료되면, 상하 PDMS 금형및 유리 슬라이드에서 부분적으로 교차 연결된 NOA 수지로 상부 PDMS 몰드를 제거합니다. 상부 PDMS 금형의 어셈블리와 PMMA 조각에 부분적으로 경화된 NOA 수지의 조립을 부드럽게 누릅니다. 새로운 어셈블리를 크로스 링커에 놓고 UV 광에 60초 동안 노출하여 NOA 수지를 다시 치료합니다.
상부 PDMS 금형을 조심스럽게 제거합니다. 완전히 교차 링크 NOA 수지로 만든 투석 칩은 재생 셀룰로오스 투석 막을 포함하고 PMMA 조각에 지원되는 준비가되어 있습니다. 빠른 에폭시 접착제와 미세 유체 채널의 입구 및 출구 지점에 상업적으로 이용 가능한 커넥터를 결합합니다.
유체 처리의 경우 커넥터 크기에 따라 PTFE 튜브의 직경을 선택합니다. 튜브는 투석 칩의 유체 채널 내에서 결정화 용액의 도입에 사용됩니다. 파이펫은 투석 막 바로 위에 위치한 단백질 저장소 내부의 단백질 샘플의 액적입니다.
단백질 액적의 부피는 사용되고있는 마이크로 칩의 설계에 따라 달라집니다. 그리고 구체적으로, 그것은 중앙 기둥의 부피에 따라 달라집니다, 그것은 0.1 또는 0.3 마이크로 리터 가 될 수 있습니다. 단백질 저장소 주변에 고진공 실리콘 그리스의 얇은 층을 조심스럽게 적용하십시오.
PMMA의 작은 조각을 잘라 부드럽게 실리콘 그리스의 얇은 층 위에 배치합니다. 단백질 저장소 위에 놓인 PMMA 조각을 커버하고 모든 가장자리 주위에 NOA 칩에 충실 할 만큼 큰 Kapton 테이프조각을 잘라. 단백질 샘플은 저수지 내에 캡슐화되고 칩은 결정화 실험에 사용될 수 있다.
먼저 버퍼 및 침전제 용액의 적절한 볼륨을 혼합하여 결정화 용액의 약 500 마이크로리터를 준비합니다. 주사기와 함께 수동으로 또는 자동화된 압력 구동 시스템을 통해 투석 칩의 지점에 결정화 솔루션을 주입합니다. 유체 채널이 결정화 용액으로 채워지고 공기가 안에 갇히지 않으면 파라필름 테이프로 칩의 입구및 출구 포트를 밀봉하십시오.
파이펫 단백질 저장기 내에서 단백질 용액의 적절한 볼륨을 캡슐화하고 이미 설명된 바와 같이 단백질 샘플을 캡슐화한다. 단백질 결정 성장은 디지털 카메라로 시각화및 기록될 수 있습니다. 투석 마이크로칩의 제조를 위해 광학적으로 투명하고 생물학적으로 불활성 물질을 선택하여 시투 X선 회절 실험에서 높은 호환성을 입증했습니다.
X선 빔의 직접 경로에 있는 칩의 단백질 구획을 포함하는 재료에 의해 생성된 배경 잡음이 평가되었다. 단백질 컴파트먼트는 재생된 셀룰로오스 투석 막, Kapton 테이프 및 2개의 PMMA 층으로 구성되며, 하나는 마이크로칩의 기판으로 사용되며, 하나는 단백질 샘플의 캡슐화에 사용된다. 이 사진에서는, Kapton 테이프, 재생된 셀룰로오스 투석 막, PMMA 층 및 그들의 조립에 의해 생성된 배경 잡음이 도시된다.
광치료 가능한 수지 NOA가 마이크로칩의 본체를 포함하더라도 단백질 챔버의 일부가 아니기 때문에 이 측정에는 포함되지 않는다. 물질과의 X선의 상호 작용에 기인하는 확산 고리는 4개의 협질보다 낮은 해상도에서 Kapton 테이프, 4-8 개의 협질기 사이 PMMA 및 4 5 개의 협스트롬 사이의 투석 막에 대해 볼 수 있습니다. 칩에 의해 생성된 총 배경 잡음은 주로 6개 앙스트롬 보다 낮은 해상도로 관찰되며, 이는 리소지메 고해상도 회절 데이터의 처리가 영향을 받지 않음을 나타낸다.
마이크로칩은 X선 회절 실험을 위해 설계된 3D 프린팅 지지대를 갖춘 X선 빔 앞에 장착되었으며 최대 3개의 칩을 동시에 보유할 수 있습니다. 실험은 마이크로투아연증 방법을 이용한 모델 용용성 단백질의 온칩 결정화를 위한 마이크로칩의 효율을 평가하기 위해 수행되었다. 리소지메 크리스탈은 두 가지 조건에서 293 켈빈에서 재배되었다.
첫 번째 결정화 조건은 염화 나트륨 1.5 및 0.1 어금니 나트륨 아세테이트를 포함했다. 제2 결정화 조건에는 염화물 나트륨 1개, 어금니 나트륨 0.1, 폴리에틸렌 글리콜 400이 포함되어 있으며, 고분자 량 및 점성 용액의 침전제를 사용하여 마이크로칩및 미세투석 방법의 호환성을 보여주기 위해 선택되었다. 결정화 실험은 정적 조건하에서 수행되었다.
일단 리소지메 결정이 마이크로칩에서 재배되면 실온에서 시투 X선 회절 실험에 사용되었습니다. 마이크로칩은 3D 프린팅 지지대를 지원하여 빔 라인에 장착되었으며, 완전한 X선 회절 데이터 세트는 두 개의 리소지메 결정으로부터 수집되었다. X선 회절 데이터의 처리 후, 단일 리소지메 결정의 전자 밀도 맵은 그림 A.Figure B에서 와 같이 1.95 앙스트롬 해상도로 얻어졌으며, 이는 1.85 앙스트롬 분해능에서 얻은 전자 밀도 맵을 나타낸다.
두 개의 서로 다른 리소지메 결정에서 얻은 두 개의 데이터 세트를 병합한 후, 두 전기 밀도 맵은 단일 또는 다중 단백질 결정에서 실온에서 투석 마이크로칩에서 직접 수행된 시투 X선 회절 실험에서 얻을 수 있는 상세한 구조적 정보를 보여줍니다. 우리는 마이크로 투석 방법을 사용하여 온칩 단백질 결정화를 위해 설계된 미세 유체 장치에 대한 제조 절차를 시연하고 실온에서 X 선 회절 실험에서 시연했습니다. 우리는 높은 X 선 투명도를 가진 제조 재료를 사용했으며, 시상 단백질 결정예 촬영에 적합합니다.
회절 데이터 수집은 칩에 대한 3D 인쇄 지지대를 사용하여 자동화되며, 이는 거시분자 결정학 빔 라인에 직접 장착할 수 있습니다. 이 마이크로칩의 다기능성은 작은 단백질 볼륨을 사용하여 결정화 조건과 맵 위상 다이어그램을 가역적으로 제어하기 위해 미세 투과를 사용하는 데서 비롯됩니다. 장치의 프로토타이핑은 간단하기 때문에 비교적 저렴한 재료로 깨끗한 방에서 하루에 최대 30 마이크로 칩을 제조 할 수 있습니다.
우리는 칩의 이러한 특징이 더 도전적인 단백질 표적의 연쇄 X 선 결정학 연구에 사용될 수 있기를 기대합니다.
